基于双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统及其应用

摘要

本发明涉及基于双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统及其应用，属于基因工程技术领域。该系统主要由nCas9和核碱基脱氨酶双重互补的碱基编辑融合蛋白A、B以及向导RNA组成。与传统胞嘧啶碱基编辑系统相比，本发明公开的基于双分子脱氨酶互补的胞嘧啶碱基编辑系统，在保持高效胞嘧啶碱基编辑中靶效率的同时，极大降低了其在基因组上的Cas9依赖型和Cas9非依赖型脱靶；本发明还提供了可高效工作的基于双分子脱氨酶互补的腺嘌呤碱基编辑系统；本发明公开的基于双分子脱氨酶互补的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑系统普遍适用于真核生物，从真菌、动物到植物，在作物遗传育种、动物品种改良乃至人类遗传疾病的临床治疗等领域具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑系统包括以下

1)至5)中任意一项：

1）碱基编辑融合蛋白A、碱基编辑融合蛋白B和向导RNA；

2）包含编码碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B的核苷酸序列的表达构建体，和向导RNA；

3）碱基编辑融合蛋白A、碱基编辑融合蛋白B和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

4）包含编码碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

5）包含编码碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

其中所述的碱基编辑融合蛋白A自N端到C端依次包括第一nCas9多肽片段、柔性连接肽和第一核碱基脱氨酶多肽片段；所述碱基编辑融合蛋白B自N端到C端依次包括第二核碱基脱氨酶多肽片段、柔性连接肽和第二nCas9多肽片段；所述第一核碱基脱氨酶多肽片段和第二核碱基脱氨酶多肽片段选自相同的核碱基脱氨酶；

其中，所述碱基编辑系统中碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B的组合为如下1)至7)中任意一项：

1）氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示的碱基编辑融合蛋白A：Split‑AID10‑N，和氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示的碱基编辑融合蛋白B：Split‑AID10‑C；

2）氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示的碱基编辑融合蛋白A：Split‑AID10‑N5，和氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示的碱基编辑融合蛋白B：Split‑AID10‑C4；

3）氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示的碱基编辑融合蛋白A：Split‑BE3‑N，和氨基酸序列如SEQ ID NO: 20所示的碱基编辑融合蛋白B：Split‑BE3‑C；

4）氨基酸序列如SEQ ID NO: 21所示的碱基编辑融合蛋白A：Split‑A3A‑N，和氨基酸序列如SEQ ID NO: 22所示的碱基编辑融合蛋白B：Split‑A3A‑C；

5）氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示的碱基编辑融合蛋白A：Split‑A3B‑N，和氨基酸序列如SEQ ID NO: 24所示的碱基编辑融合蛋白B：Split‑A3B‑C；

6）氨基酸序列如SEQ ID NO: 29所示的碱基编辑融合蛋白A：Split‑ABE8e‑N，和氨基酸序列如SEQ ID NO: 30所示的碱基编辑融合蛋白B：Split‑ABE8e‑C；

7）氨基酸序列如SEQ ID NO: 31所示的碱基编辑融合蛋白A：Split‑ABE8e‑N7，和氨基酸序列如SEQ ID NO: 32所示的碱基编辑融合蛋白B：Split‑ABE8e‑C2。

2.根据权利要求1所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述编码碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B的核苷酸序列和/或所述编码向导RNA的核苷酸序列与表达调控元件可操作地连接。

3.根据权利要求2所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述调控元件为启动子；所述启动子包括病毒35S启动子，玉米Ubi‑1启动子，水稻Ubi启动子，病毒CMV启动子，酵母TDH3启动子，酵母GAL1启动子，拟南芥卵细胞特异的EC1.2en+EC1.1嵌合启动子，水稻U6启动子，拟南芥U6启动子，酵母U6启动子或人U6启动子。

4.根据权利要求1 3任一项所述的碱基编辑系统在产生经遗传修饰的生物体或

~

HEK293T细胞系中的应用，其特征在于，将所述碱基编辑系统导入生物体或HEK293T细胞系，由所述向导RNA将碱基编辑器靶向细胞基因组中的靶序列，导致所述靶序列中至少一个C碱基被T碱基取代或至少一个A碱基被G碱基取代；所述碱基编辑器由权利要求1 3任一项中所~述的碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B组成；所述应用为非疾病的诊断和治疗目的的应用；所述生物体为真菌、动物或植物；所述动物为小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛或猫。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述真菌包括酵母；所述植物包括拟南芥、水稻、小麦、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯或马铃薯。

说明书

基于双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基于双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

[0002] 数量众多的作物农艺性状以及人类遗传疾病由基因组上的单核苷酸多态性 [1,2](Single nucleotide polymorphisms,SNPs)决定 。由CRISPR/Cas9基因编辑技术衍生而来的碱基编辑技术(Base editing)具有不产生DNA双链断裂以及可精确实现靶位点单碱基替换等特点，极大提高了基因编辑的精确度和安全性，因而被广泛应用于基因功能研究、作[3]
物遗传改良和人类基因疾病的临床治疗等领域 。碱基编辑系统主要由碱基编辑器(Base editors,BEs)和向导RNA (single‑guide RNA,sgRNA)构成。科研人员最常用的碱基编辑器BE3是将来自大鼠的胞苷脱氨酶rAPOBEC1、来自噬菌体的尿嘧啶糖苷酶抑制子(Uracil [4]
glycosylase inhibitor,UGI)与Cas9切口酶(Cas9 nickase,nCas9‑D10A)融合获得 。在sgRNA的引导下，BE3结合于靶标基因位点处，其所融合的胞苷脱氨酶rAPOBEC1发挥脱氨作用，将靶序列中特定位置的胞嘧啶(C)碱基突变为尿嘧啶(U)碱基。在细胞内源修复机制的[4]
作用下，U碱基变为胸腺嘧啶(T) 碱基，最终达到C到T的碱基替换 。

[0003] 然而，近年来国际上多个在水稻、小鼠等生物体中的独立研究均发现，传统碱基编辑系统(如BE3系统)会在全基因组水平上引发大量不依赖于向导RNA (或Cas9)的随机脱靶[5,6]突变 。这给碱基编辑系统的实际使用，增加了难以评估的安全隐患，尤其是给临床应用带来了极大的不确定性。因此，发展高效、通用且安全的低脱靶碱基编辑系统，对基础科学研究、作物遗传改良乃至人类基因疾病的临床治疗都将大有裨益。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种新型的基于双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统及其应用，本发明提出的基于双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统能极大减少传统碱基编辑系统存在的全基因组随机脱靶问题，同时仍保持了高效的中靶编辑，具有广阔的应用前景。

[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统，所述碱基编辑系统包括以下1)至5)中至少一项：

[0006] 1)碱基编辑融合蛋白A、碱基编辑融合蛋白B和向导RNA；

[0007] 2)包含编码碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B的核苷酸序列的表达构建体，和向导RNA；

[0008] 3)碱基编辑融合蛋白A、碱基编辑融合蛋白B、和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

[0009] 4)包含编码碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

[0010] 5)包含编码碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

[0011] 其中所述的碱基编辑融合蛋白A自N端到C端依次包括第一nCas9多肽片段、柔性连接肽和第一核碱基脱氨酶多肽片段；所述碱基编辑融合蛋白B自N 端到C端依次包括第二核碱基脱氨酶多肽片段、柔性连接肽和第二nCas9多肽片段；所述第一核碱基脱氨酶多肽片段和第二核碱基脱氨酶多肽片段选自相同的核碱基脱氨酶。

[0012] 需要指出的是，“表达构建体”指适于感兴趣的核苷酸序列在生物体中表达的载体如重组载体。“表达”指可产生有功能的产物。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。本发明所述“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者可以是能够翻译的RNA(如mRNA)。本发明的“表达构建体”可包含相同来源但以不同于天然排列方式的调控序列和感兴趣的核苷酸序列，亦包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。

[0013] 本申请发明人发现，在本发明所述的碱基编辑系统中，向导RNA能与碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B形成蛋白核酸复合体(RNP)，并引导 RNP靶向目标DNA序列，导致所述靶标序列中一至多个胞嘧啶碱基到胸腺嘧啶碱基，或一至多个腺嘌呤(A)碱基到鸟嘌呤(G)碱基的核苷酸取代。且其第一核碱基脱氨酶多肽片段和第二核碱基脱氨酶多肽片段均不含有完整脱氨酶序列，也不具有碱基脱氨活性，这是该系统降低脱靶的关键所在。

[0014] 本申请发明人发现，在本发明所述的碱基编辑系统中，所述第一、第二核碱基脱氨酶通常是互补的，即可融合成具备完整脱氨活性的核碱基脱氨酶。

[0015] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述第一nCas9多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二nCas9多肽片段的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。

[0016] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述柔性连接肽包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的32aa连接肽。研究表明，所述柔性连接肽还包括 XTEN、PR、GGGGS、PRGGSGG、ARGGSGG、GS、GAP、(GGGGS)×3、 GGS和(GGS)×7。所述柔性的连接肽也可以是长1‑50个或更多个氨基酸、无二级以上结构的非功能性氨基酸序列。

[0017] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述碱基编辑融合蛋白A 和碱基编辑融合蛋白B的N端或C端融合有至少一个核定位序列。研究表明，所述核定位序列(NLS)通常可以与入核载体相互作用，从而可以使靶蛋白能够被运送进细胞核。一般而言，NLS由暴露于蛋白表面上的带正电的赖氨酸或精氨酸的一个或多个短序列组成，但其他类型的NLS也是已知的。NLS的非限制性实例包括氨基酸序列如：PKKKRKV或KRPAATKKAGQAKKKK。在一些具体的实施例中，本发明所述碱基编辑融合蛋白A的N端包含1个拷贝的NLS(氨基酸序列为PKKKRKV),所述碱基编辑融合蛋白B的C端包含1个拷贝的NLS  (氨基酸序列为KRPAATKKAGQAKKKK)或2个拷贝的NLS(氨基酸序列为 PKKKRKV和KRPAATKKAGQAKKKK)。

[0018] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述碱基编辑系统为胞嘧啶碱基编辑器系统；所述核碱基脱氨酶为胞苷脱氨酶；利用该系统可在向导RNA 的引导下使目标序列中的一至多个C碱基替换为T碱基。

[0019] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述胞苷脱氨酶选自：由 APOBEC3A(A3A)、APOBEC3B(A3B)、APOBEC3C(A3C)、APOBEC3D(A3D)、 APOBEC3F(A3F)、APOBEC3G(A3G)、APOBEC3H(A3H)、APOBEC1(A1)、 APOBEC3(A3)、APOBEC2(A2)、APOBEC4(A4)和AICDA(AID)或通过单个或多个氨基酸组合突变APOBEC3A(A3A)、APOBEC3B(A3B)、APOBEC3C(A3C)、 APOBEC3D(A3D)、APOBEC3F(A3F)、APOBEC3G(A3G)、APOBEC3H(A3H)、 APOBEC1(A1)、APOBEC3(A3)、APOBEC2(A2)、APOBEC4(A4)和AICDA(AID) 获得的胞苷脱氨酶变体构成的组。

[0020] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述胞苷脱氨酶选自人源 AID高活性变体AID10(中国专利：202010285948.1)、大鼠来源的rA1、人源的hA3A或人源的hA3B。

[0021] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述胞嘧啶碱基编辑融合蛋白A的第一核碱基脱氨酶多肽片段包括如SEQ ID NO:4～8所示任一氨基酸序列；所述胞嘧啶碱基编辑融合蛋白B的第二核碱基脱氨酶多肽片段包括如SEQ ID NO:9～13所示任一氨基酸序列。

[0022] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述胞嘧啶碱基编辑融合蛋白B的C端融合有至少一个尿嘧啶糖苷酶抑制子(UGI)，所述UGI的氨基酸序列如如SEQ ID NO:14所示

[0023] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述胞嘧啶碱基编辑系统包括以下1)至5)任一项所述的碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B的组合：

[0024] 1)氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的碱基编辑融合蛋白A： Split‑AID10‑N，和氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的碱基编辑融合蛋白B： Split‑AID10‑C；

[0025] 2)氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的碱基编辑融合蛋白A： Split‑AID10‑N5，和氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的碱基编辑融合蛋白B：Split‑AID10‑C4；

[0026] 3)氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的碱基编辑融合蛋白A：Split‑BE3‑N，和氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的碱基编辑融合蛋白B：Split‑BE3‑C；

[0027] 4)氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示的碱基编辑融合蛋白A：Split‑A3A‑N，和氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示的碱基编辑融合蛋白B：Split‑A3A‑C；

[0028] 5)氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的碱基编辑融合蛋白A：Split‑A3B‑N，和氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的碱基编辑融合蛋白B：Split‑A3B‑C。

[0029] 在本发明提供的具体实施方式中，所述的系统是基于双分子的、胞苷脱氨酶AID10互补的胞嘧啶碱基编辑系统“Split‑AID10”。其所述碱基编辑融合蛋白A由NLS多肽片段、第一nCas9多肽片段(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)、 32aa连接肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)以及第一核碱基多肽片段 AID10‑N(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)由N端到C端依次融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，称为“Split‑AID10‑N”；所述碱基编辑融合蛋白B由第二核碱基多肽片段AID10‑C(氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)、32aa 连接肽、第二nCas9多肽片段(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)、1分子UGI(氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)和1分子NLS从N端到C端依次融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，称为“Split‑AID10‑C”(如图2所示)。

[0030] 在本发明提供的具体实施方式中，所述的系统是基于双分子的、胞苷脱氨酶AID10互补的胞嘧啶碱基编辑系统“Split‑AID10‑N5‑C4”。其所述碱基编辑融合蛋白A由NLS多肽片段、第一nCas9多肽片段、32aa连接肽以及第一核碱基多肽片段AID10‑N5(氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)由N端到C端依次融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，称为“Split‑AID10‑N5”；所述碱基编辑融合蛋白B由第二核碱基多肽片段AID10‑C4(氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)、32aa连接肽、第二nCas9多肽片段、1分子UGI和1分子NLS 从N端到C端依次融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，称为“Split‑AID10‑C4”(如图2所示)。

[0031] 在本发明提供的具体实施方式中，所述的系统是基于双分子的、胞苷脱氨酶rA1互补的胞嘧啶碱基编辑系统“Split‑BE3”。其所述碱基编辑融合蛋白A 由NLS多肽片段、第一nCas9多肽片段、32aa连接肽以及第一核碱基多肽片段 BE3‑N(氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)由N端到C端依次融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，称为“Split‑BE3‑N”；所述碱基编辑融合蛋白B 由第二核碱基多肽片段BE3‑C(氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示)、32aa连接肽、第二nCas9多肽片段、1分子UGI和1分子NLS从N端到C端依次融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，称为“Split‑BE3‑C”。

[0032] 在本发明提供的具体实施方式中，所述的系统是基于双分子的、胞苷脱氨酶hA3A互补的胞嘧啶碱基编辑系统“Split‑A3A”。其所述碱基编辑融合蛋白 A由NLS多肽片段，第一nCas9多肽片段、32aa连接肽以及第一核碱基多肽片段A3A‑N(氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)依次融合而成，其氨基酸序列如 SEQ ID NO:21所示，称为“Split‑A3A‑N”；所述碱基编辑融合蛋白B由第二核碱基多肽片段A3A‑C(氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示)、32aa连接肽、第二nCas9多肽片段、1分子UGI和1分子NLS从N端到C端依次融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，称为“Split‑A3A‑C”。

[0033] 在本发明提供的具体实施方式中，所述的系统是基于双分子的、胞苷脱氨酶hA3B互补的胞嘧啶碱基编辑系统“Split‑A3B”。其中，所述碱基编辑融合蛋白A由NLS多肽片段、第一nCas9多肽片段、32aa连接肽以及第一核碱基多肽片段A3B‑N(氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)由N端到C端依次融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，称为“Split‑A3B‑N”；所述碱基编辑融合蛋白B由第二核碱基多肽片段A3B‑C(氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)、 32aa连接肽、第二nCas9多肽片段、1分子UGI和1分子NLS从N端到C端依次融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，称为“Split‑A3B‑C”。

[0034] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述碱基编辑系统为腺嘌呤碱基编辑器系统；所述核碱基脱氨酶为腺苷脱氨酶；利用该系统可在向导RNA 的引导下使目标序列中的一至多个A碱基替换为G碱基。

[0035] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述腺苷脱氨酶为DNA依赖型腺苷脱氨酶；优选地，所述腺苷脱氨酶为单链DNA依赖型腺苷脱氨酶。

[0036] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述腺苷脱氨酶包括大肠杆菌tRNA腺苷脱氨酶TadA的变体；优选地，所述变体包括TadA‑7.10、TadA‑8s 或TadA‑8e；更优选地，所述变体为TadA‑8e(国际专利：PCT/US2021/016827)。

[0037] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述腺嘌呤碱基编辑融合蛋白A的第一核碱基脱氨酶多肽片段包括如SEQ ID NO:25～26所示任一氨基酸序列；所述腺嘌呤碱基编辑融合蛋白B的第二核碱基脱氨酶多肽片段包括如 SEQ ID NO:27～28所示任一氨基酸序列。

[0038] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述腺嘌呤碱基编辑系统包括以下1)至2)任一项所述的碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B组合：

[0039] 1)氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的碱基编辑融合蛋白A： Split‑ABE8e‑N，和氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示的碱基编辑融合蛋白B： Split‑ABE8e‑C；

[0040] 2)氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示的碱基编辑融合蛋白A： Split‑ABE8e‑N7，和氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的碱基编辑融合蛋白B： Split‑ABE8e‑C2。

[0041] 在本发明提供的具体实施方式中，所述的系统是基于双分子的、腺苷脱氨酶TadA‑8e互补的胞嘧啶碱基编辑系统“Split‑ABE8e”。其所述碱基编辑融合蛋白A由NLS多肽片段、第一nCas9多肽片段、32aa连接肽以及第一核碱基多肽片段ABE8e‑N(氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示)由N端到C端依次融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，称为“Split‑ABE8e‑N”；所述碱基编辑融合蛋白B由第二核碱基多肽片段ABE8e‑C(氨基酸序列如SEQ ID NO:27 所示)、32aa连接肽、第二nCas9多肽片段和2分子NLS从N端到C端依次融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，称为“Split‑ABE8e‑C”。

[0042] 在本发明提供的具体实施方式中，所述的系统是基于双分子的、腺苷脱氨酶TadA‑8e互补的胞嘧啶碱基编辑系统“Split‑ABE8e‑N7‑C2”。其所述碱基编辑融合蛋白A由NLS多肽片段、第一nCas9多肽片段、32aa连接肽以及第一核碱基多肽片段ABE8e‑N7(氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示)由N端到C端依次融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，称为“Split‑ABE8e‑N7”；所述碱基编辑融合蛋白B由第二核碱基多肽片段ABE8e‑C2(氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示)、32aa连接肽、第二nCas9多肽片段和2分子NLS从N端到C 端依次融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，称为“Split‑ABE8e‑C2”。

[0043] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述编码碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B的核苷酸序列和/或所述编码向导RNA的核苷酸序列与表达调控元件可操作地连接。

[0044] 作为本发明所述碱基编辑系统的优选实施方式，所述调控元件为启动子；所述启动子包括病毒35S启动子，玉米Ubi‑1启动子，水稻Ubi启动子，病毒 CMV启动子，酵母TDH3启动子，酵母GAL1启动子，拟南芥卵细胞特异的 EC1.2en+EC1.1嵌合启动子，水稻U6启动子，拟南芥U6启动子或人U6启动子。

[0045] 研究表明，本发明可使用的启动子的实例包括但不限于聚合酶(pol)I、pol II 或pol III启动子。pol I启动子的包括鸡RNA pol I启动子。pol II启动子包括但不限于劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSV‑LTR)启动子和猿猴病毒40(SV40)立即早期启动子。pol III启动子包括U6和H1启动子。可以使用诱导型启动子如金属硫蛋白启动子。当用于植物时，启动子可以是花椰菜花叶病毒35S启动子、玉米Ubi‑1启动子、小麦U6启动子、水稻U3启动子、玉米U3启动子、水稻肌动蛋白启动子,拟南芥卵细胞特异的EC1.2en+EC1.1嵌合启动子、拟南芥U6 启动子；当用于酵母时，启动子可以是酵母ADH1启动子，酵母TDH3启动子，酵母GAL1启动子，酵母SNR52启动子；当用于人等哺乳动物时，启动子可以是病毒CMV启动子，人U3/U6启动子。

[0046] 本发明还提供所述的碱基编辑系统在产生经遗传修饰的生物体中的应用，将所述碱基编辑系统导入生物体细胞，由所述向导RNA将所述碱基编辑器靶向细胞基因组中的靶序列，导致所述靶序列中至少一个C碱基被T碱基取代或至少一个A碱基被G碱基取代。

[0047] 作为本发明所述应用的优选实施方式，所述生物为真核生物；所述真核生物为真菌、动物或植物。

[0048] 作为本发明所述应用的优选实施方式，所述真菌包括酵母；所述动物包括人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛或猫；所述植物包含单子叶植物和双子叶植物，包括并不限于拟南芥、水稻、小麦、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯或马铃薯。

[0049] 本发明的方法尤其适合于产生经遗传修饰的植物，例如作物植物。在本发明的产生经遗传修饰的植物的方法中，所述碱基编辑系统可以本领域技术人员熟知的各种方法导入植物。可用于将本发明的碱基编辑系统导入植物的方法包括但不限于：基因枪法、PEG介导的原生质体转化、土壤农杆菌介导的转化、植物病毒介导的转化、花粉管通道法和子房注射法。

[0050] 在本发明提供的一些优选地具体实施方式中，使用基于双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统产生的经遗传修饰的植物体具有优良的农艺性状。如图5B所示，使用基于双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统“Split‑AID10”，结合靶向拟南芥内源基因ALS的向导RNA，使转基因拟南芥该内源靶位点上发生G13>A13的单碱基替换，从而导致该编码基因的氨基酸序列发生第122位丙氨酸到苏氨酸 (A122T)的氨基酸替换。后续的除草剂喷施实验表明，含有该A122T氨基酸替换的转基因拟南芥植株均对咪唑啉酮类除草剂产生了抗性，而不含该氨基酸替换的拟南芥植株全部枯萎致死，说明使用Split‑AID10碱基编辑系统赋予了转基因拟南芥优良的除草剂抗性。

[0051] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0052] (1)本发明的基于双分子脱氨酶互补的胞嘧啶碱基编辑系统相比传统胞嘧啶碱基编辑(如BE3系统)，降低了碱基编辑在基因组上的Cas9依赖型和Cas9 非依赖型(随机型)脱靶，同时仍然保持了较为高效的碱基编辑中靶活性。

[0053] (2)本发明提供的基于双分子脱氨酶互补的腺嘌呤碱基编辑系统也展现出了在几乎所有代表性真核生物的普适性，在单子叶植物如水稻，双子叶植物如拟南芥，真菌如酵母，哺乳动物如人HEK293T细胞系均展现良好的腺嘌呤碱基编辑活性。

[0054] (3)本发明的基于双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统的开发和应用，为生物基因科学研究，作物遗传育种，尤其是人类遗传疾病的临床治疗提供了安全而有力的技术支撑。

附图说明

[0055] 图1为基于双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统的工作原理图。

[0056] 图2为用于在水稻原生质体中瞬时表达碱基编辑器的载体示意图。

[0057] 图3：A为在水稻原生质体中使用R‑loop方法评估多个碱基编辑器的中靶效率统计图(n＝3)；B为在水稻原生质体中使用R‑loop方法评估多个碱基编辑器的脱靶效率统计图(n＝3)；C为图A和图B的综合统计图(n＝12)。

[0058] 图4：A为4个水稻内源靶点的中靶编辑效率柱状图；B为比较split‑AID10 与两个传统碱基编辑器的Cas9依赖型脱靶编辑效率柱状图(n＝2)与脱靶位点信息表。

[0059] 图5：A为split‑AID10系统在3个拟南芥内源靶点的碱基编辑统计表；B 为使用split‑AID10系统编辑拟南芥内源ALS基因，从而赋予转基因T1代拟南芥对于咪唑啉酮类除草剂的抗性效果图和靶位点桑格测序图。

[0060] 图6：A为酿酒酵母6个靶点的编辑效率统计图(n＝3)；B为为酿酒酵母中单细胞水平全基因组范围的脱靶编辑评估，图中柱状图的值代表了多个生物学重复的平均值(ns,统计不显著；****，p值小于0.0001)。

[0061] 图7：A为人胚胎肾细胞系HEK293T中6个靶点的中靶编辑效率统计图 (n＝3)；B为人胚胎肾细胞系HEK293T中6个靶点的脱靶编辑效率统计图 (n＝3)；C为人胚胎肾细胞系HEK293T中图A和图B中所有靶点的中靶检测和脱靶检测编辑水平统计图(n＝18)；D为HEK293T细胞系中4个靶点的中靶编辑效率以及每个靶点对应的Cas9依赖型脱靶编辑水平统计图(n＝3)。

[0062] 图8：A为酿酒酵母内源靶点Ade1‑1每个碱基C的编辑效率统计图(n＝3)； B为酿酒酵母内源靶点Ade1‑3每个碱基C的编辑效率统计图(n＝3)；C为酿酒酵母内源靶点Can1‑1每个碱基C的编辑效率统计图(n＝3)；D为酿酒酵母内源靶点Can1‑9每个碱基C的编辑效率统计图(n＝3)。

[0063] 图9：A为在拟南芥原生质体中，比较Split‑ABE8e和Split‑ABE8e‑N7‑C2 系统与2个传统腺嘌呤碱基编辑系统靶向内源基因FLS2的编辑效率统计图 (n＝2)；B和C为使用Split‑ABE8e系统对转基因拟南芥(B)和转基因水稻 (C)植株中各自3个内源基因的编辑情况统计图。

[0064] 图10：A、B分别展示了酿酒酵母内源靶点Can1‑5和Can1‑9每个碱基A 的编辑效率统计图(n＝3)；C、D分别展示了在人胚胎肾细胞系HEK293T靶点Site 1和Site 2的腺嘌呤碱基编辑情况。

具体实施方式

[0065] 为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在公开发表的文[7]献中有更全面的描述 。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买获得。

[0066] 如图1所示，本发明提供的基于双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统主要由三部分组成：碱基编辑融合蛋白A，碱基编辑融合蛋白B以及向导RNA。其中，所述碱基编辑融合蛋白A和碱基编辑融合蛋白B共同构成双分子脱氨酶互补的碱基编辑器。所述融合蛋白A由第一nCas9多肽片段与第一脱氨酶多肽片段通过柔性连接肽融合而成。所述融合蛋白B由第二脱氨酶多肽片段与第二nCas9 多肽片段通过柔性连接肽融合而成。所述第一，第二nCas9多肽片段可无缝融合成完整nCas9蛋白。

[0067] 所述第一，第二脱氨酶多肽片段的脱氨酶选自同一核碱基脱氨酶，且其任一部分均不包含完整脱氨酶序列，也不具脱氨酶活性。在一些优选的实施方案中，如Split‑AID10胞嘧啶碱基编辑系统(图2‑7)，Split‑BE3胞嘧啶碱基编辑系统(图6‑7)，Split‑A3A胞嘧啶碱基编辑系统(图8)，Split‑A3B胞嘧啶碱基编辑系统(图8)和Split‑ABE8e腺嘌呤碱基编辑系统(图9‑10)中，所述第一，第二脱氨酶多肽片段也可无缝融合成完整的相应核碱基脱氨酶。

[0068] 在一些次优选的实施方案中，如Split‑AID10‑N5‑C4胞嘧啶碱基编辑系统(图 2)和Split‑ABE8e‑N7‑C2腺嘌呤碱基编辑系统(图9)，其第一第二脱氨酶多肽片段有部分氨基酸序列的重叠，融合成的脱氨酶氨基酸序列长度超过原始所选核碱基脱氨酶。

[0069] 其工作原理为：当向导RNA与碱基编辑融合蛋白A和B共表达时，向导 RNA引导后两者组装成完整的碱基编辑器并，三者共同组成蛋白核酸复合体 (RNPs)。随后RNPs由向导RNA靶向结合至目的基因位点处，导致所述目的基因序列中一至多个C碱基到T碱基的核苷酸取代(胞嘧啶碱基编辑系统)或一至多个A碱基到G碱基的核苷酸取代(腺嘌呤碱基编辑系统)。

[0070] 本发明提供的实施例证明，前述优选的实施方案如Split‑AID10胞嘧啶碱基编辑系统在植物如水稻，真菌如酵母，动物如人的HEK293T细胞系中均表现出接近背景水平的全基因组DNA脱靶，显著低于传统碱基编辑器如BE3(本发明也称“N‑BE3”)，同时维持了较为高效的DNA中靶效率。前述优选的实施方案 Split‑BE3胞嘧啶碱基编辑系统在代表性真核生物酵母和人的HEK293T细胞系中也表现出接近背景水平的全基因组DNA脱靶，显著低于传统碱基编辑器BE3，同时维持了较为高效的DNA中靶效率。前述优选的Split‑ABE8e腺嘌呤碱基编辑系统也展示出了广泛的物种适应性，从单细胞真核生物酵母，到高等植物拟南芥和水稻，乃至人的HEK293T细胞系中均能实现对真核生物内源靶点的有效腺嘌呤碱基编辑。

[0071] 实施例1在单子叶模式植物水稻中评估基于双分子脱氨酶互补的胞嘧啶碱基编辑系统的中靶效率和脱靶效率。

[0072] 1、实验材料：本实施例所使用野生型水稻品种为粳稻中花11(Oryza sativa L.ssp.japonica ZH11)。

[0073] 2、碱基编辑相关水稻原生质体瞬时表达载体的构建

[0074] 碱基编辑器“N‑BE3”(或称为“BE3”)的表达载体pHBT‑rAPOBEC1‑nCas9‑UGI由本实验室自主构建，其所用启动子为玉米 ZmUbi‑1启动子，所用终止子为NOS终止子。

[0075] 基于双分子脱氨酶互补的胞嘧啶碱基编辑器“Split‑AID10”由“Split‑AID10‑N”表达载体和“Split‑AID10‑C”表达载体共同构成；由上海生工生物技术有限公司(Sangon Biotech.Co.,Ltd.)商业化合成编码氨基酸序列如 SEQ ID NO:15(Split‑AID10‑N)所述多肽片段的多核苷酸序列，随后将该产物经简单酶切连接融合至前述pHBT载体获得表达载体pHBT‑Split‑AID10‑N；“Split‑AID10‑C”表达载体的构建：pHBT‑Split‑AID10‑C载体构建过程与 pHBT‑Split‑AID10‑N基本一致，其包含编码氨基酸序列如SEQ ID NO:16 (Split‑AID10‑C)所述多肽片段的多核苷酸序列。

[0076] 基于双分子脱氨酶互补的胞嘧啶碱基编辑器“Split‑AID10‑N5‑C4”由表达载体pHBT‑Split‑AID10‑N5和表达载体pHBT‑Split‑AID10‑C4共同构成，构建方法同“Split‑AID10”，其中Split‑AID10‑N5的氨基酸序列如SEQ ID NO:17， Split‑AID10‑C4的氨基酸序列如SEQ ID NO:18。

[0077] nSaCas9表达载体的构建：植物密码子优化的SaCas9的多核苷酸序列来自德国[8]Puchta Holger教授的馈赠(已公开论文 )。使用购自南京诺赞生物技术有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的定点突变试剂盒(Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2，#C214‑01)，将前述SaCas9编码氨基酸序列中的第10位天冬氨酸突变为丙氨酸，获得编码nSaCas9(D10A)的多核苷酸序列。最后通过简单酶切连接方法构建表达载体pHBT‑nSaCas9。

[0078] 3、水稻向导RNA瞬时表达载体的构建

[0079] 参照已公开发表的论文中阐述的方法[9,10]，并基于 pUC119‑OsU6apro‑sgRNA[10]构建8个向导RNA表达载体 pUC119‑OsAAT1‑sgRNA、pUC119‑OsCDC48‑sgRNA、pUC119‑OsNAL1‑sgRNA、 pUC119‑OsPDS1‑sgRNA、pUC119‑OsCDC48‑Sa‑gRNA、 pUC119‑OsNRT1.1B‑Sa‑gRNA、pUC119‑OsDEP1‑Sa‑gRNA和pUC119‑OsAAT1‑Sa‑gRNA。向导RNA所包含的靶序列信息如表1所示。

[0080] 表1

[0081]

[0082] 4、水稻原生质体的制备及转染

[0083] 水稻原生质体制备：

[0084] 1)12小时光照(32℃)/12小时黑暗(28℃)，200μmol·m‑2·s‑1光照，70％湿度，土培或者无菌组培8‑10天龄水稻幼苗；

[0085] 2)配制酶解液(1.5％纤维素酶R10，0.4％果胶酶R10，0.4M甘露醇，20mM MES pH5.7，20mM KCl，10mM CaCl2和0.1％BSA)15mL，并用针筒和0.45 μm孔径的滤膜过滤，加入至直径10cm的细胞培养皿中；

[0086] 3)选取约200颗生长健康、颜色嫩绿的水稻苗，用刀片把叶鞘切成0.5‑1mm 的茎段；

[0087] 4)将茎段放入前述酶解液中，注意用接种环将各个茎段分散，避免粘连，并使其完全浸没于酶解液中，置于50‑60rpm转速的水平摇床上，避光酶解3小时；

[0088] 5)酶解完成后，加入10mL W5(154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl 和2mM MES pH5.7)溶液，用适当的力度摇晃培养皿，使原生质体释放于溶液中，此时可以看到溶液变淡绿，用孔径45μm的尼龙膜过滤酶解产物，收集滤液至圆底离心管中；

[0089] 6)在水平离心机中以150g离心5分钟，然后用真空泵吸去尽可能多的上清液，淡绿色原生质体沉于圆底管底部；

[0090] 7)缓慢加入10mL W5溶液，轻轻摇晃圆底管以重悬细胞，随后于冰上静置0.5‑1小时；

[0091] 8)冰上静置后，以150g水平离心3分钟，吸去上清，缓慢加入2mL MMg (0.4M甘露醇，15mM MgCl2和4mM MES pH5.7)溶液并轻摇圆底管以重悬原生质体，用血球计数板在显6
微镜下确定细胞浓度，再次加入适量MMg溶液调整细胞浓度至2×10个/mL。

[0092] 水稻原生质体转染：

[0093] 向2mL圆底管中依次加入300μL前述调整好细胞浓度的水稻原生质体、 30μL(66μg)质粒和330μL PEG(40％PEG4000(v/v)，0.2M甘露醇和0.1M CaCl2)，反应液轻柔地充分混匀，避光静置15分钟，随后加入1.2mL W5溶液，混匀，从而终止转染。水平离心机200g离心5分钟，吸去上清，加入150μL W5 溶液重悬，并转移至1mL WI溶液(0.5M甘露醇，20mM KCl和4mM MES pH 5.7)中。室温黑暗培养48小时，水平离心机250g离心5分钟，吸上清，淡黄色原生质体细胞聚集于管底，之后迅速冻于液氮，于‑80℃冰箱保存。

[0094] 5、水稻原生质体基因组中靶序列的深度测序和碱基替换分析

[0095] 1)使用购自天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN Biotech.Co.,Ltd.) 的快捷型植物基因组DNA提取系统(DNAquick Plant System,#4992710)提取水稻原生质体DNA；

[0096] 2)设计带有barcode标签序列的第一轮特异性引物扩增靶序列上下游200bp 左右的片段，在第一轮PCR产物的基础上使用通用建库引物进行第二轮建库 PCR引物信息列于表2；

[0097] 3)按等摩尔比混合前述第二轮建库PCR产物，纯化后送往北京诺禾致源科技股份有限公司(Novogene Co.,Ltd.)进行扩增子测序。使用NovaSeq平台进行双端PE150测序；

[0098] 4)在公共数据分析平台上(https://usegalaxy.org/)[11]根据barcode拆分前述[12] [13]测序数据，最后使用CRISPResso2 或BE‑Analyzer 网站进行靶序列突变分析，用Excel呈现靶位点碱基替换情况。

[0099] 表2引物信息

[0100]

[0101]

[0102]

[0103]

[0104]

[0105]

[0106] 6、基于正交R‑loop的高通量碱基编辑器特异性检测方法

[0107] 参照已公开发表的论文中阐述的方法[14]。本实施例中选择了8个水稻内源靶点，包括4个SpCas9的向导RNA靶向的中靶位点(OsAAT1，OsCDC48， OsNAL1与OsPDS1)，与4个nSaCas9的向导RNA靶向的脱靶位点(OsCDC48, OsNRT1.1B,OsDEP1,OsAAT1)。为了模拟碱基编辑器在细胞内的真实工作情况，将前述靶位点按照SpCas9与SaCas9一一对应的方式随机分组，获得 Sp‑OsAAT1与Sa‑OsCDC48,Sp‑OsCDC48与Sa‑OsNRT1.1B,Sp‑OsNAL1与 Sa‑OsDEP1和Sp‑OsPDS1与Sa‑OsAAT1共4个组合。在每个组合的试验中，每个水稻原生质体的处理组须等量地转染碱基编辑器质粒(特别地，Split‑AID10 和Split‑AID10‑N5‑C4碱基编辑器则须转染等量pHBT‑Split‑AID10‑N(N5)质粒和 pHBT‑Split‑AID10‑C(C4)质粒)，SpCas9向导RNA质粒(如 pUC119‑OsAAT1‑sgRNA)，nSaCas9质粒(pHBT‑nSaCas9)以及nSaCas9向导 RNA质粒(如pUC119‑OsCDC48‑Sa‑gRNA)。针对每个组合试验中的每个处理组，同时进行SpCas9靶点(中靶)和nSaCas9靶点(脱靶)的深度测序和分析。

[0108] 7、水稻遗传转化载体的构建和水稻的遗传转化

[0109] 1)碱基编辑器BE3的遗传转化载体为pH‑nCas9‑PBE(addgene:#98163)，其中所用启动子为ZmUbi‑1启动子，所用终止子为E9终止子。靶向编辑目的基因OsSWEET11/13/14：商业化合成3个向导RNA的表达框 OsU6apro‑OsSWEET14‑OsU6bpro‑OsSWEET13‑OsU6apro‑OsSWEET11，通过简单酶切连接融合进前述pH‑nCas9‑PBE载体中(靶序列信息列于表1)。靶向编辑目的基因OsSLR1：商业化合成单个向导RNA的表达框OsU6apro‑OsSLR1,通过简单酶切连接融合进前述pH‑nCas9‑PBE载体中(靶序列信息列于表1)；

[0110] 2)Split‑AID10碱基编辑器的遗传转化载体,第一步，以pHBT‑Split‑AID10‑N 载体为模板，经简单PCR与酶切连接获得pH‑Split‑AID10‑N载体。第二步，首先从水稻中花11基因组上经PCR获得OsUBQ2启动子序列，再以载体 pHBT‑Split‑AID10‑C和pH‑nCas9‑PBE为模板通过简单重叠PCR获得 Split‑AID10‑C‑E9 term多核苷酸序列，通过简单PCR将前两者融合获得 Split‑AID10‑N的表达框OsUBQ2pro‑Split‑AID10‑C‑E9 term多核苷酸序列。最后通过简单酶切连接将前述Split‑AID10‑N的表达框融合进pH‑Split‑AID10‑N载体的E9终止子之后，获得拥有2个完整表达框的pH‑Split‑AID10‑N‑C双元载体。靶向编辑目的基因OsSWEET11/13/14和OsSLR1的2个双元载体如前所述克隆至pH‑PIGS‑AID10中。

[0111] 3)水稻遗传转化：将上述载体利用冻融转化法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105感受态细胞，后续委托武汉伯远生物科技有限公司 (BioRun Co.,Ltd.)进行水稻的遗传转化工作。

[0112] 8、实验结果

[0113] 首先，采用前述基于正交R‑loop的方法(图3A，3B)在水稻原生质体中评估2种基于双分子脱氨酶互补的胞嘧啶碱基编辑系统Split‑AID10和 Split‑AID10‑N5C4的中靶与脱靶效率，同时选择传统碱基编辑器N‑BE3作对照 (图2)。中靶编辑方面，分别针对4个SpCas9向导RNA靶点所处的基因组区域进行深度测序，分析结果显示，碱基编辑器Split‑AID10和Split‑AID10‑N5C4 均能对水稻内源靶位点进行有效的碱基编辑，平均C到T碱基替换效率约为 4.6％和6.6％，大于传统碱基编辑器N‑BE3(BE3)的3.3％(图3A，3C)。脱靶编辑方面，分别针对4个nSaCas9向导RNA靶点进行深度测序分析，结果显示 Split‑AID10和Split‑AID10‑N5C4在4个位点的平均脱靶编辑效率(0.05％和0.8％) 均显著低于传统碱基编辑器BE3(1.6％)。尤其是碱基编辑器Split‑AID10，其平均脱靶效率仅为0.05％，与空白对照的0.02％基本一致(图3B，3C)。

[0114] 随后，将前述原生质体中表现最优的Split‑AID10碱基编辑器与向导RNA 融合构建遗传转化载体进行水稻的遗传转化，在水稻转基因植株中评估该碱基编辑器，同时选择传统碱基编辑器N‑BE3作对照。获得转基因植株后，针对不同靶基因位点设计特异性引物进行PCR，将产物送擎科生物技术有限公司 (Tsingke Biotech.Co.,Ltd.)进行桑格测序。针对4个靶点的分析结果显示，碱基编辑器Split‑AID10在转基因植株中也成功进行碱基编辑，有效编辑窗口为靶序列的C5位到C13位(以PAM为21‑23位)，不同位置的胞嘧啶碱基替换效率从3％到55.2％(图3A)。最后，我们使用在线分析工具CRISPR‑GE  (http://skl.scau.edu.cn/)分析了全部4个靶点可能的Cas9依赖型脱靶情况。以该工具脱靶得分>0.7为标准，仅在中靶位点OsSWEET13中寻找到2个可能的脱靶位点(图3B)。随后针对3种碱基编辑器BE3和Split‑AID10所有在该位点成功编辑的转基因水稻植株共38株进行2个脱靶位点的桑格测序。如图3B所示， Split‑AID10仅在平均50％的已编辑植株发现前述Cas9依赖型的DNA脱靶情况，显著小于BE3的100％。

[0115] 综上所述，在水稻中2种基于双分子脱氨酶互补的胞嘧啶碱基编辑系统 Split‑AID10和Split‑AID10‑N5C4均能进行有效碱基编辑，且相比传统碱基编辑器如BE3，显著降低了碱基编辑的全基因组随机脱靶概率(同“Cas9非依赖型脱靶”)，同时维持了较高的中靶编辑效率。进一步，Split‑AID10在转基因水稻植株水平也展现了良好的碱基编辑中靶效率，同时发现其降低Cas9依赖型脱靶发生机率。

[0116] 实施例2使用基于双分子脱氨酶互补的胞嘧啶碱基编辑系统Split‑AID10也可在转基因拟南芥植株中实现高效碱基编辑。

[0117] 1、实验材料

[0118] 本实施例所用野生型拟南芥为Col‑0生态型(Arabidopsis thaliana Col‑0)。

[0119] 2、拟南芥遗传转化

[0120] 本实施例所用拟南芥遗传转化载体的构建参考公开发表文章[15]和实施例1 所述方法，针对2个不同靶点分别构建各自遗传转化载体(向导RNA靶序列信息见表1)。将前述载体分别通过电击转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系GV3101，利用花粉管导入法转化拟南芥植株。具体地，将含有目标载体的 GV3101菌液，按1:100的比例接种于含卡那霉素(50mg/L)的液体LB培养基中，在28℃摇床中以转速220rpm培养2天。5000g收集菌体，弃去培养基，加入含0.05％Silwet L77的5％蔗糖溶液重悬。取已开花的拟南芥植株，倒置并使花序完全浸入农杆菌菌液中，轻轻搅动约10秒后取出，置于湿润黑暗环境中1天后，转移至正常生长环境，直至收获成熟种子。

[0121] 3、转基因阳性苗筛选及基因型鉴定

[0122] 将前述获得的成熟种子在无菌环境下播撒于含有50mg/L的潮霉素B (hygromycin B)的无菌1/2MS固体培养基中。10天左右，将生根的潮霉素阳性苗移至土壤中恢复培养。半个月后，使用购自购自天根生化科技(北京)有限公司的快捷型植物基因组DNA提取系统提取阳性苗的叶片基因组。设计靶基因特异性引物进行PCR，并送擎科公司进行桑格测序。

[0123] 4、实验结果

[0124] 如图4A所示，对2个独立内源靶点AtALS和AteTM166的转基因拟南芥基因型鉴定结果显示，Split‑AID10在转基因拟南芥植株中可以成功进行有效的 C到T碱基编辑，平均编辑效率为7.7％。如图4B所示，在使用Split‑AID10编辑拟南芥内源ALS基因所获得的T1代转基因植株中，其靶位点上发生预想的 G13到A13的碱基替换，从而导致其内源ALS基因编码序列上第122位丙氨酸到苏氨酸(A122T)的氨基酸取代。对2月龄的前述所有T1代转基因拟南芥植株 (不论是否发生碱基编辑)进行咪唑啉酮类除草剂(Shandong Cynda Chemical Co.,Ltd.)的喷施，1月后发现存活植株均包含内源ALS基因上G13到A13的碱基替换，说明使用Split‑AID10碱基编辑系统靶向编辑拟南芥内源基因ALS赋予了转基因拟南芥植株对咪唑啉酮类除草剂的抗性。本实施例证明Split‑AID10碱基编辑系统在转基因拟南芥植株中可进行有效地C到T碱基编辑，并且能赋予拟南芥优良的农艺性状(如除草剂抗性)。

[0125] 实施例3基于双分子脱氨酶互补的胞嘧啶碱基编辑系统Split‑AID10和 Split‑BE3在单细胞真核生物酵母中也展现出良好的中靶编辑和极低的全基因组随机脱靶。

[0126] 1、实验材料

[0127] 本实施例所用为酿酒酵母BY4741株系(Saccharomyces cerevisiae BY4741)。

[0128] 2、碱基编辑相关酵母表达载体构建

[0129] 碱基编辑相关表达载体构建参考公开发表文章[16]，获得表达载体 pGAL1‑rAPOBEC1‑nCas9‑UGI(N‑BE3),pGAL1‑Split‑AID10和pGAL1‑Split‑BE3。其中，pGAL1‑Split‑AID10表达载体所包含的Split‑AID10‑N 和Split‑AID10‑N氨基酸序列如前所述，pGAL1‑Split‑BE3表达载体所包含的 Split‑BE3‑N的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，Split‑BE3‑C的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。酵母U6启动子直接从基因组中PCR扩增获得，然后通过重叠PCR的策略组装向导RNA完整表达原件，完成一系列向导RNA的载体构建pGAL1‑yGFP‑SNR35p‑sgRNAs，酵母中向导RNA靶点信息见表3。

[0130] 表3酵母细胞中向导RNA靶点信息

[0131]

[0132]

[0133] 3、酵母遗传转化和表达

[0134] 所采用的酿酒酵母遗传转化参考公开发表文章[17]。通过常规醋酸锂LiOAC 化学转化法将前述载体转入酿酒酵母BY4741株系中，利用质粒上的营养缺陷基因筛选阳性转化子。具体地，从营养缺陷平板上挑取含有目标质粒的阳性转化克隆到液体缺陷培养基中，在2％葡萄糖碳源的培养基培养两天至饱和，然后按照1:1000的稀释比例接种于2％棉子糖碳源培养基培养两天至饱和，最后按照 1:10000的稀释比例接种于1％半乳糖碳源培养基培养两到三天至饱和，收集适量的菌液进行后续基因组提取。

[0135] 4、酵母细胞中靶序列的深度测序及全基因组深度测序

[0136] 1)对于中靶序列的深度测序，参考公开发表文章[18]进行基因组提取和靶点的扩增子建库。

[0137] 2)对于全基因的深度测序，取适量半乳糖诱导的饱和菌液进行平板划线，待克隆长成后，挑取10～20个单克隆进行一代测序，鉴定对应靶点有没有编辑；将靶点已编辑的克隆接种到3mL的YPDA液体培养基中并摇菌至饱和，然后用商业化的试剂盒(HiPure Yeast DNA Kit,#D3147,Guangzhou Magen Biotech.Co., Ltd.)抽提酵母菌的基因组DNA，再利用商业化的二代测序建库试剂盒完成文库构建(VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina,#ND607,Vazyme Biotech.Co.,Ltd.)，最后送测序公司进行双端PE150高通量测序，要求每个克隆测序覆盖深度超过100×，大约每个基因组需1G数据。

[0138] 5、实验结果

[0139] 如图6A所示，针对酵母基因组内源6个靶点的分析结果显示，碱基编辑器 N‑BE3平均编辑效率为6.5％～94.9％，有效编辑窗口为靶序列的C3位到C10位；碱基编辑器Split‑AID10平均编辑效率为56.9％～97.3％，有效编辑窗口为靶序列的C5位到C15位；碱基编辑器Split‑BE3平均编辑效率为57.8％～96.8％，有效编辑窗口为靶序列的C5位到C14位。此外，与经典的碱基编辑器N端融合策略 N‑BE3相比，Split‑AID10和Split‑BE3的编辑窗口都发生了偏移，更靠近PAM 识别区域。

[0140] 如图6B所示，无论是使用脱氨酶AID10的Split‑AID10系统还是使用脱氨酶rAPOBEC1的Split‑BE3系统，其均能够显著降低全基因范围的脱靶效应。尽管酵母基因组非常小(只有10Mb左右)，碱基编辑器N‑BE3还是导致了全基因组范围内平均可以检测到100个左右脱靶编辑事件，而Split‑AID10和Split‑BE3 都能够极大地降低脱靶效应，平均只能检测不到10个的脱靶编辑，与单分子碱基编辑器对照组Split‑AID10‑N/Split‑AID10‑C和Split‑BE3‑N/Split‑BE3‑C数目相当，接近本底水平。

[0141] 本实施例证明双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统在真核细胞酿酒酵母中具有高效的编辑活性，同时，能够显著地降低全基因组范围的脱靶效应，具有非常高的安全性能。

[0142] 实施例4基于双分子胞苷脱氨酶互补的Split‑AID10和Split‑BE3系统在人胚胎肾细胞系293T中也展现出良好的中靶编辑和极低的全基因组随机脱靶。

[0143] 1、实验材料

[0144] 人胚胎肾细胞系293T(HEK293T)来自美国模式培养物集存库(ATCC)。

[0145] 2、人碱基编辑相关载体的构建

[0146] 参考已公开发表的文章[19]，核心载体整合了CMV启动子和人源U6启动子，载体骨架为pX330(Addgene#42230)，然后构建相关碱基编辑器 pCMV‑rAPOBEC1‑nCas9‑UGI(N‑BE3),pCMV‑Split‑AID10和pCMV‑Split‑BE3表达载体,其中pCMV‑Split‑AID10表达载体所包含的Split‑AID10‑N和 Split‑AID10‑C氨基酸序列如前所述，pCMV‑Split‑BE3表达载体包含的 Split‑BE3‑N和Split‑BE3‑C氨基酸序列也如前所述；本实施例对向导RNA表达载体做了如下改造，在CMV下游插入红色荧光蛋白mScarlet，用于指示细胞转染的效率，同时在U6和gRNA Scaffold之间通过BbsI酶切消化，插入对应靶点的向导RNA退火双链分子，完成向导RNA表达元件的构建，HEK293T细胞中向导RNA靶点信息见下表4。

[0147] 表4人基因组中向导RNA靶序列信息

[0148]

[0149] 3、细胞培养和转染

[0150] HEK293T细胞为人胚胎肾细胞，贴壁生长，采用DMEM高糖培养基和10％胎牛血清培养，置于37℃和5％二氧化碳的培养箱培养。进行碱基编辑器质粒转染前一天，铺合适数目的细胞于48孔板中，第二天采用常规的脂质体进行细胞转染，表达48‑72小时后，收集细胞并进行基因组提取。

[0151] 4、HEK293T细胞中靶序列的深度测序和分析

[0152] 为了更好的评估互补的双分子脱氨酶碱基编辑器的性能，本实施例设计了6 个匹配的靶点，同时进行碱基编辑器的中靶效果和脱靶效果检测。具体实施如下：以SaCas9搜索基因组合适的靶位点，然后筛选符合SpCas9相邻间隔原基序PAM的要求，获得重叠的靶序列，从而针对同一个位点进行靶向编辑的效率评估和正交的R‑Loop检测。其中，R‑Loop正交检测使用了pX601(Addgene #61591)作为表达载体，为了提高检测效率，表达载体pX601有适当改造，包括使用nSaCas9切口酶和增加了尿嘧啶糖基化酶抑制功能结构域UGI，正交检测的靶位点信息详见表4。

[0153] 深度测序建库采用两步法策略：1)首先设计靶点特异性的结合引物进行捕获，并且在引物末端带上Illumina Nextera接头的部分序列；2)然后以第一步反应的PCR产物为模板，进行完整文库的扩增，包括8个碱基的样品条形码和P5/P7 的完整序列。最后，两轮PCR扩增的产物进行纯化、浓度测定和文库均一化混匀等一系列常规操作，送至苏州安升达公司(Genewiz Inc.,sz)进行高通量测序。

[0154] 扩增子深度测序结果分析主要包含文库拆分和编辑效率计算两个部分。文库拆分利用Illumina官方的bcl2fastq软件进行，将原始下机的BCL数据根据混合样品的条形码表格挨个拆分成独立的FASTQ格式文件，包括读长1(Read1) 和读长2(Read2)；然后针对每个[12]靶点单独进行CRISPResso2 分析，获得靶点附近碱基替换的矩阵，最后完成编辑效率的计算。

[0155] 5、Cas9依赖性的脱靶检测

[0156] 本实施例还针对4个靶点进行了Cas9蛋白依赖性的脱靶检测，通过预测软件Cas‑OFFinder针对每个靶点序列进行小于6的容错搜索，从人类全基因组范围内寻找Cas9蛋白依赖性脱靶位置；然后再根据CRIPSR/Cas9系统的核心种子区域进行筛选，保留靠近PAM区域5个碱基长度没有错配的潜在脱靶位点序列；最后根据已发表的大量文献和方法，设计一套相对简易的打分算法，对潜在的脱靶位点序列特征进行分析，进一步筛选获得打分较高的位点，设计特异性的捕获引物进行后续扩增子的建库和测序。

[0157] 6、实验结果

[0158] 实验结果如图7所示，由图7A可知，基于胞苷脱氨酶rAPOBEC1的Split‑BE3 系统和基于胞苷脱氨酶AID10的Split‑AID10系统在HEK293T细胞能够成功实现靶序列C到T的碱基替换，编辑效率与常用的N‑BE3碱基编辑器相当，平均编辑效率在50％左右。由图7B～D可知，Split‑AID10和Split‑BE3不仅能够减少 Cas9依赖性的脱靶编辑，还能够显著地降低Cas9非依赖性的脱靶风险。本实施例证明双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统在人源HEK293T细胞中具有高效的编辑活性，同时，不仅能够减少Cas9依赖性的脱靶编辑，而且能够显著地降低全基因组范围的脱靶效应，表现出优异的安全性能，具有广阔的实际应用前景。

[0159] 实施例5 Split‑A3A和Split‑A3B系统在真核生物中具有良好的基因编辑能力。

[0160] 1、碱基编辑相关酵母表达载体构建

[0161] 参照实施例3所述方法，Split‑A3A系统的表达载体为pGAL1‑Split‑A3A‑N 和pGAL1‑Split‑A3A‑C；编码Split‑A3A‑N的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，编码Split‑A3A‑C的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；Split‑A3B系统的表达载体为pGAL1‑Split‑A3B‑N和pGAL1‑Split‑A3B‑C，编码Split‑A3B‑N的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，编码Split‑A3B‑C的氨基酸序列如SEQ ID NO： 13所示。

[0162] 2、实验结果

[0163] 如图8A‑8D所示，基于胞苷脱氨酶A3A的Split‑A3A系统和基于胞苷脱氨酶A3B的Split‑A3B系统在代表性真核生物酵母中成功实现靶序列C到T的碱基替换。Split‑A3A系统的编辑窗口为C1到C15，在编辑窗口内不同位置的C碱基的编辑效率为22.1％～84.7％；Split‑A3B系统的编辑窗口为C5到C15在编辑窗口内不同位置的C碱基的编辑效率为9.5％～
95.5％。

[0164] 实施例6基于双分子脱氨酶互补的腺嘌呤碱基编辑系统Split‑ABE8e和 Split‑ABE8e‑N7‑C2可在植物中实现高效腺嘌呤碱基编辑。

[0165] 1、实验材料

[0166] 本实施例中水稻材料如实施例1相同，拟南芥材料如实施例2相同。

[0167] 2、拟南芥原生质体瞬时转化载体的构建

[0168] 传统腺嘌呤碱基编辑器ABE7.10和ABE8e的拟南芥瞬时表达载体为 pHBT‑ABE7.10和pHBT‑ABE8e，其中所用启动子为AtUBQ10启动子，终止子为NOS终止子。前述载体均为本实[15]验室构建，已公开发表 ；Split‑ABE8e系统和Split‑ABE8e‑N7‑C2系统表达载体的构建参照实施例1所述Split‑AID10系统以及Split‑AID10‑N5‑C4系统的构建方法，在pHBT‑PIGS‑ABE8e载体的基础上获得Split‑ABE8e系统的pHBT‑Split‑ABE8e‑N载体和pHBT‑Split‑ABE8e‑C载体以及Split‑ABE8e‑N7‑C2系统的pHBT‑Split‑ABE8e‑N7载体和 pHBT‑Split‑ABE8e‑C2载体。其中，编码Split‑ABE8e‑N的氨基酸序列如SEQ NO: 29，编码Split‑ABE8e‑C的氨基酸序列如SEQ NO:30，编码Split‑ABE8e‑N7的氨基酸序列如SEQ NO:31，编码Split‑ABE8e‑C2的氨基酸序列如SEQ NO:32；适用于拟南芥的向导RNA瞬时表达载体基于Li,Z.et al.2019.Current protocols in molecular biology,https://doi.org/10.1002/cpmb.89公开发表文章所述 pUC119‑AtU6‑26pro‑sgRNA)载体，构建pUC119‑AtU6‑26pro‑AtFLS2‑sgRNA表达载体(靶序列参见表1)。

[0169] 3、拟南芥原生质体基因组中靶序列的深度测序和碱基替换分析

[0170] 本实施例的拟南芥原生质体基因组中靶序列的深度测序和碱基替换分析与实施例1相同。

[0171] 4、植物遗传转化载体的构建

[0172] 参考实施例1所述Spit‑AID10水稻遗传转化载体的构建方法构建本实施例 Split‑ABE8e系统适用于水稻的遗传转化载体pH‑Split‑ABE8e‑N‑C；在此基础上将商业化合成的单向导RNA表达框AtU6‑26pro‑AtALS/AtPDS3/ AtBAK1‑sgRNA核酸片段通过简单酶切连接各自融入前述pH‑Split‑ABE8e‑N‑C 载体中，获得本实施例中靶向AtALS或AtPDS3或AtBAK1的水稻遗传转化载体(向导RNA靶序列信息见表1)。

[0173] 参考实施例2所述Spit‑AID10拟南芥遗传转化载体的构建方法构建本实施例Split‑ABE8e系统适用于拟南芥的遗传转化载体pH‑EC‑Split‑ABE8e‑N‑C；在此基础上将商业化合成的单向导RNA表达框AtU6‑26pro‑OsACC/OsNRT1.1B/ OsDEP1‑sgRNA核酸片段通过简单酶切连接各自融入前述 pH‑EC‑Split‑ABE8e‑N‑C载体中，获得本实施例中靶向OsACC或OsNRT1.1B或 OsDEP1的拟南芥遗传转化载体(向导RNA靶序列信息见表1)。

[0174] 5、植物遗传转化

[0175] 水稻遗传转化方法参照实施例1所述，拟南芥遗传转化方法参照实施例2 所述。

[0176] 6、实验结果

[0177] 为快速验证基于双分子脱氨酶互补的腺嘌呤碱基编辑系统Split‑ABE8e和 Split‑ABE8e‑N7‑C2的可行性，将表达Split‑ABE8e系统所必须的两组分 Split‑ABE8e‑N表达载体和Split‑ABE8e‑C表达载体与靶向AtABI3‑2位点的向导 RNA表达载体共同转染拟南芥原生质体，同时也将表达Split‑ABE8e‑N7‑C2系统所必须的两组分Split‑ABE8e‑N7表达载体和Split‑ABE8e‑C2表达载体与前述向导RNA表达载体共同转染另一组原生质体，除此之外还设置了传统腺嘌呤碱基编辑器ABE7.10和ABE8e的对照组。48小时后，提取原生质体基因组DNA 并对靶位点AtFLS2进行深度测序。结果如图9A所示，使用2种新型腺嘌呤碱基编辑系统Split‑ABE8e和Split‑ABE8e‑N7‑C2均能有效编辑拟南芥内源靶点 AtFLS2，对该靶点7位的A碱基的平均编辑效率为3.3％和3.2％，与传统碱基编辑器ABE8e的3.2％编辑效率相似，同时高于传统ABE7.10的0.3％。

[0178] 为进一步确认该新型编辑系统的有效性，拟在两种代表性植物的转基因植株水平评估该碱基编辑系统的腺嘌呤碱基编辑效率。如图9B所示，在转基因拟南芥植株中，使用Spit‑ABE8e系统分别靶向内源基因AtALS，AtPDS3和 AtBAK1，腺嘌呤碱基编辑效率在3.1％到35.2％之间，平均为16.6％。如图9C 所示，在转基因水稻植株中，使用Spit‑ABE8e系统分别靶向内源基因OsACC， OsDEP1和OsNRT1.1B，腺嘌呤碱基编辑效率在55.1％到53.8％之间，平均为 54.7％。

[0179] 本实施例提供的数据证明，基于双分子脱氨酶互补的腺嘌呤碱基编辑系统 Split‑ABE8e和Split‑ABE8e‑N7‑C2在植物中可以进行有效地腺嘌呤碱基编辑。特别是Split‑ABE8e系统在单子叶代表性植物水稻和双子叶代表性植物拟南芥的转基因植株中均能对内源靶基因进行高效腺嘌呤碱基编辑，揭示了该系统在植物中广泛的适用性。

[0180] 实施例7 Split‑ABE8e系统可在酵母和人胚胎肾细胞系HEK293T中实现有效腺嘌呤碱基编辑。

[0181] 1、实验材料

[0182] 本实施在酵母中的实验材料与方法参考实施例3；在HEK293T细胞系中的实验材料与方法参考实施例4。

[0183] 2、Split‑ABE8e系统在酵母中的表达载体为pGAL1‑Split‑ABE8e‑N和pGAL1‑Split‑ABE8e‑C，其余对照载体为pGAL1‑nSpCas9、pGAL1‑N‑ABE7.10 和pGAL1‑N‑ABE8e；Split‑ABE8e系统在HEK293T细胞系中的表达载体为 pCMV‑Split‑ABE8e‑N和pCMV‑Split‑ABE8e‑C；前述酵母和人Split‑ABE8e表达载体所包含的Split‑ABE8e‑N和Split‑ABE8e‑C的编码氨基酸序列如前所述；酵母和人细胞中向导RNA表达载体如实施例3，4所述，向导RNA靶序列信息见表3和表4。

[0184] 3、实验结果

[0185] 首先，将Split‑ABE8e系统与靶向酵母内源Can1‑8位点的向导RNA共同导入酵母细胞中，对靶点附近进行深度测序，结果如图10A所示，Split‑ABE8e系统在酵母中成功对Can1‑8位点进行了腺嘌呤碱基编辑，编辑窗口为A4‑A13，A 碱基到G碱基的替换效率从25％‑82％。图10B展示Split‑ABE8e系统在酵母细胞中另一个内源位点Can1‑9的成功编辑情况。
随后将Split‑ABE8e系统与靶向内源HEK Site 1位点的向导RNA共同转染进HEK293T细胞系中，表达3天后，提取细胞基因组，使用引物F和R对HEK Site 1进行简单PCR，所得产物进行桑格测序。结果如图10C所示，Split‑ABE8e系统在HEK293T细胞系中成功实现了腺嘌呤碱基编辑，将内源靶位点HEK Site 1中A5替换为G5。图10D展示 Split‑ABE8e系统在HEK293T细胞系中另一个内源位点HEK Site 2的成功编辑情况。

[0186] 本实施例所展示的实验结果证明，Split‑ABE8e系统在代表性单细胞生物如酵母和哺乳动物如人胚胎肾细胞系293T中均能实现对内源靶点有效地A到G 碱基替换，进一步证实了该系统广泛的适应性。

[0187] 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围加以限制。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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