无背景宽场与低损超分辨两用成像装置及成像方法

摘要

本发明提供了一种无背景宽场与低损超分辨两用成像装置及成像方法，该装置包括：第一泵浦光单元，用于生成第一波长光束；第二泵浦光单元，用于生成第二波长光束；样品单元，放置有包括荧光信标的待测样品，样品单元用于接收第一波长光束，对荧光信标的电荷态进行初始化，接收第二波长光束，对荧光信标的电荷态进行调制，以及输出经由荧光信标发射的第一波长光束信号、第二波长光束信号和对应于不同电荷态荧光信标的荧光光子信号其中至少之一；收集单元，用于输出经滤波处理得到的目标光子信号；控制单元，用于接收目标光子信号，以及根据目标光子信号生成无背景宽场图像或低损超分辨图像。

权利要求

1.一种无背景宽场与低损超分辨两用成像装置，包括：

第一泵浦光单元，用于生成第一波长光束；

第二泵浦光单元，用于生成第二波长光束，所述第二波长光束包括第二波长高斯光束或第二波长空心光束；

样品单元，放置有包括荧光信标的待测样品，所述样品单元用于接收所述第一波长光束，对所述荧光信标的电荷态进行初始化，接收所述第二波长光束，对所述荧光信标的电荷态进行调制，其中，第二波长光束为低功率连续红外光，调制荧光信标的辐射光子数，调制‑ 0过程使NV分子的电荷态在NV与NV之间转换，调整NV电荷态布局，以及输出经由所述荧光信标发射的第一波长光束信号、第二波长光束信号和对应于不同电荷态荧光信标的荧光光子信号其中至少之一；

收集单元，用于接收所述第一波长光束信号、所述第二波长光束信号和所述荧光光子信号其中至少之一，以及输出经滤波处理得到的目标光子信号；

控制单元，用于接收所述目标光子信号，以及根据所述目标光子信号生成无背景宽场图像或低损超分辨图像；

其中，在所述低损超分辨图像下，所述第二波长空心光束在所述第二波长高斯光束的基础上进行转换得到，在所述无背景宽场图像下，直接使用所述第二波长高斯光束；

所述无背景宽场图像的成像方法包括：获取针对待测样品拍摄得到的第一图像和第二图像，其中，所述第一图像包括在利用所述第一波长光束照射包括第二初始化荧光信标的待测样品的情况下获得的图像，所述第二图像包括在利用所述第一波长光束和所述第二波长光束照射包括第二增强荧光信标的待测图像的情况下获得的图像，所述第二初始化荧光信标是基于所述第一波长光束对所述待测样品中的荧光信标照射得到，所述第二增强荧光信标是基于所述第一波长光束和所述第二波长光束对所述第二初始化荧光信标照射得到，所述荧光信标为金刚石；根据所述第二图像与所述第一图像的差值，确定与所述待测样品相对应的无背景宽场图像；

所述低损超分辨图像的成像方法包括：针对待测样品中的每个待测像素点，获取N个第一荧光强度和N个第二荧光强度，其中，所述待测样品中包括多个待测像素点，所述第一荧光强度包括在利用所述第一波长光束照射第一初始化荧光信标的情况下的荧光强度，所述第二荧光强度包括在利用所述第一波长光束和所述第二波长光束同时照射第一增强荧光信标的情况下的荧光强度，所述第一初始化荧光信标是基于所述第一波长光束对所述待测样品中的荧光信标照射得到，所述第一增强荧光信标是基于所述第一波长光束和所述第二波长光束对所述第一初始化荧光信标照射得到，N为正整数；根据所述N个第二荧光强度的平均值，确定与所述待测像素点相对应的目标荧光强度；根据与所述多个待测像素点相对应的多个所述目标荧光强度，确定与所述待测样品相对应的低损超分辨图像。

2.根据权利要求1所述的装置，其中，

所述第一泵浦光单元包括：

第一光源，用于生成所述第一波长光束；

第一脉冲发生器，用于接收由所述控制单元发送的第一序列脉冲；

第一调制器，用于根据所述第一序列脉冲控制所述第一波长光束，生成序列化的第一波长光束；

第一光纤耦合‑准直系统，用于接收所述第一波长光束，以及输出第一准直光束；

所述第二泵浦光单元包括：

第二光源，用于生成所述第二波长高斯光束；

第二脉冲发生器，用于接收由所述控制单元发送的第二序列脉冲；

第二调制器，用于根据所述第二序列脉冲控制所述第二波长光束，生成序列化的第二波长光束；

第二光纤耦合‑准直系统，用于接收所述第二波长光束，以及输出第二准直光束。

3.根据权利要求2所述的装置，其中，所述第一泵浦光单元还包括如下中的至少之一：滤光片，用于调节所述第一波长光束的功率；

反射镜，用于调节所述第一波长光束的方向；

第一可调扩束器，用于调节所述第一波长光束的直径大小；

第一四分之一波片，用于将线偏振的第一波长光束转换为圆偏振的第一波长光束。

4.根据权利要求2所述的装置，其中，所述第二泵浦光单元还包括如下中的至少之一：半波片，用于调节所述第二波长光束的偏振方向；

偏振分束器，用于结合所述半波片，调节所述第二波长光束的功率；

第二可调扩束器，用于调节所述第二波长光束的直径大小；

涡旋相位板，用于将所述第二波长高斯光束转换为所述第二波长空心光束；

第二四分之一波片，用于将线偏振的第二波长光束转换为圆偏振的第二波长光束；

1:1非偏振分束器，用于将所述第二波长光束按1：1的功率比例分束得到第一分束光束和第二分束光束；

光功率计，用于测量所述第一分束光束或所述第二分束光束的功率，以及将测量结果发送至所述控制单元。

5.根据权利要求1所述的装置，还包括：

合束单元，用于接收所述第一波长光束和所述第二波长光束，输出合束光束。

6.根据权利要求5所述的装置，其中，所述合束单元包括如下中的至少之一：快速偏摆镜，用于调节所述第二波长光束的方向，以及调节所述第二波长光束经显微镜头聚焦后的焦点位置；

可变焦距透镜，用于调节所述第二波长光束经显微镜头聚焦后的焦平面位置；

透镜组，用于调节所述第二波长光束的位置、方向和发散角；

短通二向色镜，用于透射所述第一波长光束以及反射所述第二波长光束，以及接收所述第一波长光束信号、所述第二波长光束信号和所述荧光光子信号其中至少之一，滤除所述第一波长光束，反射所述第二波长光束信号和所述荧光光子信号其中至少之一；

长通二向色镜，用于透射所述第二波长光束，以及接收所述第二波长光束信号和所述荧光光子信号其中至少之一，滤除所述第二波长光束，反射所述荧光光子信号。

7.根据权利要求1所述的装置，其中，所述样品单元包括：所述待测样品，所述荧光信标包括纳米金刚石颗粒；

显微镜头，用于接收所述第一波长光束和/或所述第二波长光束，将所述第一波长光束和/或所述第二波长光束聚焦至所述待测样品上，以及收集所述待测样品中的荧光信标发射的第一波长光束信号、第二波长光束信号和荧光光子信号其中至少之一；

压电陶瓷位移台，用于将所述待测样品的待测像素点以纳米精度移动到预设位置；

温控箱，用于维持所述待测样品所处环境的温度及湿度的稳定。

8.根据权利要求7所述的装置，其中，所述收集单元包括：滤波片组，用于接收所述第一波长光束信号、所述第二波长光束信号和所述荧光光子信号其中至少之一，进行滤波处理，得到所述目标光子信号；

电荷耦合器件相机，用于收集所述目标光子信号，以及将所述目标光子信号发送至所述控制单元；

单光子计数器，用于收集所述目标光子信号，以及将所述目标光子信号发送至所述控制单元。

说明书

无背景宽场与低损超分辨两用成像装置及成像方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物显微成像领域，更具体地，涉及一种无背景宽场与低损超分辨两用成像装置及成像方法。

背景技术

[0002] 成像技术的发展使荧光显微镜能够研究细胞内感兴趣的物质和动力学，甚至研究单分子水平的生物过程。然而，活体荧光成像的灵敏度和分辨率往往由于荧光探针和背景发射光谱之间的重叠，受到自发荧光和其他背景噪声的限制。

发明内容

[0003] 有鉴于此，本发明提供了一种无背景宽场与低损超分辨两用成像装置及成像方法。

[0004] 本发明的一个方面提供了一种无背景宽场与低损超分辨两用成像装置，包括：第一泵浦光单元，用于生成第一波长光束；第二泵浦光单元，用于生成第二波长光束，所述第二波长光束包括第二波长高斯光束或第二波长空心光束；样品单元，放置有包括荧光信标的待测样品，所述样品单元用于接收所述第一波长光束，对所述荧光信标的电荷态进行初始化，接收所述第二波长光束，对所述荧光信标的电荷态进行调制，以及输出经由所述荧光信标发射的第一波长光束信号、第二波长光束信号和对应于不同电荷态荧光信标的荧光光子信号其中至少之一；收集单元，用于接收所述第一波长光束信号、所述第二波长光束信号和所述荧光光子信号其中至少之一，以及输出经滤波处理得到的目标光子信号；控制单元，用于接收所述目标光子信号，以及根据所述目标光子信号生成无背景宽场图像或低损超分辨图像。

[0005] 可选地，所述第一泵浦光单元包括：第一光源，用于生成所述第一波长光束；第一脉冲发生器，用于接收由所述控制单元发送的第一序列脉冲；第一调制器，用于根据所述第一序列脉冲控制所述第一波长光束，生成序列化的第一波长光束；第一光纤耦合‑准直系统，用于接收所述第一波长光束，以及输出第一准直光束。

[0006] 可选地，所述第二泵浦光单元包括：第二光源，用于生成所述第二波长高斯光束；第二脉冲发生器，用于接收由所述控制单元发送的第二序列脉冲；第二调制器，用于根据所述第二序列脉冲控制所述第二波长光束，生成序列化的第二波长光束；第二光纤耦合‑准直系统，用于接收所述第二波长光束，以及输出第二准直光束。

[0007] 可选地，所述第一泵浦光单元还可以包括如下中的至少之一：滤光片，用于调节所述第一波长光束的功率；反射镜，用于调节所述第一波长光束的方向；第一可调扩束器，用于调节所述第一波长光束的直径大小；第一四分之一波片，用于将线偏振的第一波长光束转换为圆偏振的第一波长光束。

[0008] 可选地，所述第二泵浦光单元还可以包括如下中的至少之一：半波片，用于调节所述第二波长光束的偏振方向；偏振分束器，用于结合所述半波片，调节所述第二波长光束的功率；第二可调扩束器，用于调节所述第二波长光束的直径大小；涡旋相位板，用于将所述第二波长高斯光束转换为所述第二波长空心光束；第二四分之一波片，用于将线偏振的第二波长光束转换为圆偏振的第二波长光束；1:1非偏振分束器，用于将所述第二波长光束按1：1的功率比例分束得到第一分束光束和第二分束光束；光功率计，用于测量所述第一分束光束或所述第二分束光束的功率，以及将测量结果发送至所述控制单元。

[0009] 可选地，无背景宽场与低损超分辨两用成像装置还包括：合束单元，用于接收所述第一波长光束和所述第二波长光束，输出合束光束。

[0010] 可选地，所述合束单元包括如下中的至少之一：快速偏摆镜，用于调节所述第二波长光束的方向，以及调节所述第二波长光束经显微镜头聚焦后的焦点位置；可变焦距透镜，用于调节所述第二波长光束经显微镜头聚焦后的焦平面位置；透镜组，用于调节所述第二波长光束的位置、方向和发散角；短通二向色镜，用于透射所述第一波长光束以及反射所述第二波长光束，以及接收所述第一波长光束信号、所述第二波长光束信号和所述荧光光子信号其中至少之一，滤除所述第一波长光束，反射所述第二波长光束信号和所述荧光光子信号其中至少之一；长通二向色镜，用于透射所述第二波长光束，以及接收所述第二波长光束信号和所述荧光光子信号其中至少之一，滤除所述第二波长光束，反射所述荧光光子信号。

[0011] 可选地，所述样品单元包括：所述待测样品，所述荧光信标包括纳米金刚石颗粒；显微镜头，用于接收所述第一波长光束和/或所述第二波长光束，将所述第一波长光束和/或所述第二波长光束聚焦至所述待测样品上，以及收集所述待测样品中的荧光信标发射的第一波长光束信号、第二波长光束信号和荧光光子信号其中至少之一；压电陶瓷位移台，用于将所述待测样品的待测像素点以纳米精度移动到预设位置；温控箱，用于维持所述待测样品所处环境的温度及湿度的稳定。

[0012] 可选地，所述收集单元包括：滤波片组，用于接收所述第一波长光束信号、所述第二波长光束信号和所述荧光光子信号其中至少之一，进行滤波处理，得到所述目标光子信号；电荷耦合器件相机，用于收集所述目标光子信号，以及将所述目标光子信号发送至所述控制单元；单光子计数器，用于收集所述目标光子信号，以及将所述目标光子信号发送至所述控制单元。

[0013] 本发明的另一个方面提供了一种低损超分辨成像方法，包括：针对所述待测样品中的每个待测像素点，基于无背景宽场与低损超分辨两用成像装置，获取N个第一荧光强度和N个第二荧光强度，其中，所述待测样品中包括多个待测像素点，所述第一荧光强度包括在利用所述第一波长光束照射第一初始化荧光信标的情况下的荧光强度，所述第二荧光强度包括在利用所述第一波长光束和所述第二波长光束同时照射第一增强荧光信标的情况下的荧光强度，所述第一初始化荧光信标是基于所述第一波长光束对所述待测样品中的荧光信标照射得到，所述第一增强荧光信标是基于所述第一波长光束和所述第二波长光束对所述第一初始化荧光信标照射得到，N为正整数；根据所述N个第二荧光强度的平均值，确定与所述待测像素点相对应的目标荧光强度；根据与所述多个待测像素点相对应的多个目标荧光强度，确定与所述待测样品相对应的低损超分辨图像。

[0014] 本发明的另一个方面提供了一种无背景宽场成像方法，包括：基于无背景宽场与低损超分辨两用成像装置，获取针对所述待测样品拍摄得到的第一图像和第二图像，其中，所述第一图像包括在利用所述第一波长光束照射包括第二初始化荧光信标的待测样品的情况下获得的图像，所述第二图像包括在利用所述第一波长光束和所述第二波长光束照射包括第二增强荧光信标的待测图像的情况下获得的图像，所述第二初始化荧光信标是基于所述第一波长光束对所述待测样品中的荧光信标照射得到，所述第二增强荧光信标是基于所述第一波长光束和所述第二波长光束对所述第二初始化荧光信标照射得到；根据所述第二图像与所述第一图像的差值，确定与所述待测样品相对应的无背景宽场图像。

[0015] 根据本发明的实施例，通过采用第一泵浦光单元生成第一波长光束，对待测样品中荧光信标的电荷态进行初始化，采用第二泵浦光单元生成第二波长光束，对荧光信标的电荷态进行调制。由于不同电荷态荧光信标的荧光信号不同，因此可以根据收集到的目标光子信号对待测样品进行无背景成像以及超分辨成像。本发明技术方案利用低功率连续红外光调制荧光信标的辐射光子数，具有不影响待测样品性质，生物兼容性良好，抵抗生物自发背景荧光，荧光信号稳定，高空间分辨率、高信背比，光学系统与电子系统结构简单，操作成本和费用成本低的优点。

附图说明

[0016] 为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0017] 图1示意性示出了根据本发明实施例的无背景宽场和低损超分辨两用成像装置的结构图；

[0018] 图2示意性示出了根据本发明实施例的无背景宽场与低损超分辨两用成像装置的光路图；

[0019] 图3示意性示出了根据本发明实施例的低损超分辨成像方法的流程图；

[0020] 图4示意性示出了根据本发明实施例的无背景宽场成像方法的流程图；

[0021] 图5示意性示出了根据本发明实施例的低功率连续光辅助成像的原理图；

[0022] 图6示意性示出了根据本发明实施例的对纳米金刚石颗粒进行成像的场景的示意图；

[0023] 图7示意性示出了根据本发明实施例的对纳米金刚石颗粒进行成像时控制信号与读取信号的序列图；

[0024] 图8A示意性示出了根据本发明实施例的采用传统聚焦成像方法对纳米金刚石颗粒进行成像得到的低损超分辨成像图；

[0025] 图8B示意性示出了根据本发明实施例的采用本发明装置对纳米金刚石颗粒进行成像得到的低损超分辨成像图；

[0026] 图8C示意性示出了根据本发明实施例的针对图8B所示的低损超分辨成像图采用去卷积算法提取暗点凹陷的结果图；

[0027] 图9示意性示出了根据本发明实施例的成像分辨率‑光束功率密度的曲线图；

[0028] 图10示意性示出了根据本发明实施例的对吞噬了纳米金刚石颗粒的线虫进行成像的场景的示意图；

[0029] 图11示意性示出了根据本发明实施例的对吞噬了纳米金刚石颗粒的线虫进行成像时控制信号与读取信号的序列图；

[0030] 图12A示意性示出了根据本发明实施例的采用传统宽场成像方法对线虫内吞的纳米金刚石颗粒进行成像得到的有背景宽场成像图；以及

[0031] 图12B示意性示出了根据本发明实施例的采用本发明装置对线虫内吞的纳米金刚石颗粒进行成像得到的无背景宽场成像图。

具体实施方式

[0032] 以下，将参照附图来描述本发明的实施例。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本发明实施例的全面理解。然而，明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

[0033] 在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例，而并非意在限制本发明。在此使用的术语“包括”、“包含”等表明了所述特征、步骤、操作和/或部件的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作或部件。

[0034] 在此使用的所有术语（包括技术和科学术语）具有本领域技术人员通常所理解的含义，除非另外定义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。

[0035] 在使用类似于“A、B和C等中至少一个”这样的表述的情况下，一般来说应该按照本领域技术人员通常理解该表述的含义来予以解释（例如，“具有A、B和C中至少一个的系统”应包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C、和/或具有A、B、C的系统等）。在使用类似于“A、B或C等中至少一个”这样的表述的情况下，一般来说应该按照本领域技术人员通常理解该表述的含义来予以解释（例如，“具有A、B或C中至少一个的系统”应包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C、和/或具有A、B、C的系统等）。

[0036] 荧光是自然界常见的一种发光现象。基于荧光寿命差异来区分信号和背景的荧光寿命成像技术，在荧光物寿命相似的情况下会受到限制。

[0037] 荧光纳米金刚石是一种明亮、光稳定、具有良好的细胞吸收能力、超低的细胞毒性的荧光材料。基于荧光纳米金刚石自旋态磁调制的无背景宽场成像技术，是基于磁调制或是微波调制的方法，需要用磁场或微波对金刚石中的NV（nitrogen‑vacancy，氮‑空位）色心进行操纵，需要较复杂的系统，操作成本高。

[0038] 荧光分子在吸收能量后，可以从能量低的基态跃迁到能量高的激发态。荧光分子自发从激发态跃迁回基态，并发射光子，称为自发荧光辐射过程。激发态荧光分子在外界辐射下产生与外界辐射同频率、同相位和同偏振的辐射，称为受激荧光辐射过程。此过程产生的荧光超过自发荧光辐射时，便会竞争抑制自发辐射的荧光，该种现象称为STED（stimulated emission depletion，受激辐射耗尽）。传统光学荧光显微镜受到衍射极限的限制，空间分辨率只能达到300nm左右，满足不了现代科学的研究需求。超分辨STED显微技术，受激辐射耗尽所需要的能量较大，通常在兆瓦每平方厘米左右，强的泵浦光会影响待测目标的性质甚至损坏生物样品，极大限制了其在生物活体原位成像的应用。

[0039] 本发明一方面提供了一种无背景宽场和低损超分辨两用成像装置。

[0040] 图1示意性示出了根据本发明实施例的无背景宽场和低损超分辨两用成像装置的结构图。

[0041] 如图1所示，无背景宽场和低损超分辨两用成像装置100可以包括第一泵浦光单元110、第二泵浦光单元120、样品单元130、收集单元140以及控制单元150。

[0042] 第一泵浦光单元110，用于生成第一波长光束。

[0043] 第二泵浦光单元120，用于生成第二波长光束。第二波长光束包括第二波长高斯光束或第二波长空心光束。

[0044] 样品单元130，放置有包括荧光信标的待测样品。样品单元用于接收第一波长光束，对荧光信标的电荷态进行初始化，接收第二波长光束，对荧光信标的电荷态进行调制，以及输出经由荧光信标发射的第一波长光束信号、第二波长光束信号和对应于不同电荷态荧光信标的荧光光子信号其中至少之一。

[0045] 收集单元140，用于接收第一波长光束信号、第二波长光束信号和荧光光子信号其中至少之一，以及输出经滤波处理得到的目标光子信号。

[0046] 控制单元150，用于接收目标光子信号，以及根据目标光子信号生成无背景宽场图像或低损超分辨图像。

[0047] 根据本发明的实施例，第一泵浦光单元110可以产生光束大小可调的第一波长光束。利用第一波长光束照射待测样品，可以使待测样品中能够被第一波长光束照射到的第一位置范围内的荧光信标的电荷态初始化，包括使第一位置范围内的荧光信标从当前电荷态的基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态，并可激发第一位置范围内的荧光信标以光子辐射的形式释放出能量，发射荧光信号。

[0048] 根据本发明的实施例，荧光信标可以包括金属颗粒、纳米孔、介质颗粒、荧光分子、量子点、点缺陷等等。本发明实施例中的荧光信标可以包括金刚石中的NV（nitrogen‑0 ‑
vacancy，氮‑空位）色心，电荷态可以包括荧光较弱的暗态NV 和荧光较强的明态NV。随着第
0 ‑
一波长光束和第二波长光束的照射，暗态NV和明态NV的布局比例可以发生变化。

[0049] 根据本发明的实施例，第二泵浦光单元120可以产生光束大小可调的第二波长光束，第二波长光束与第一波长光束的功率可以不同，第二波长光束可以包括第二波长高斯光束或第二波长空心光束。利用第二波长光束照射待测样品，可以使待测样品中能够被第二波长光束照射到的第二位置范围内的荧光信标的电荷亮态布局度增加，荧光强度增强。

[0050] 需要说明的是，第一波长光束以及第二波长光束可以是激光光束以及其他任何一种光的光束，如红外光、紫外光、微波、X射线等等。第一波长光束以及第二波长光束也可为其他能量，如电能、化学能等待。本发明实施例并不对此做任何的限定。

[0051] 根据本发明的实施例，样品单元130可以放置有待测样品。待测样品可以包括荧光材料以及使用荧光材料进行修饰的材料等其中任一。使用荧光材料进行修饰的材料例如可以包括纳米金刚石标记的细胞。荧光材料通常存在着不同电荷态，不同的电荷态的荧光光谱不同，荧光强度不同，电荷态的寿命较长。荧光材料的大多数分子在通常状态下处于具有最低能量的基态能级，在收到外界激发后，荧光材料可以吸收能量并进行跃迁。根据荧光材料在不同状态下的能级结构，可以确定跃迁至目标能级所需吸收的能量，使用相应波长的电磁波可将荧光材料的分子泵浦到不同的量子态。

[0052] 例如，对于金刚石中的氮‑空位（nitrogen vacancy，NV）色心而言，NV的两种电荷‑ 0态为荧光强度较强的亮态NV以及荧光强度较弱的暗态NV。使用1064 nm激光进行泵浦，可‑ 0
以使NV分子的电荷态在NV与NV之间转换，调整NV电荷态布局。使用532 nm激光可以使NV分子的电荷态初始化为平衡布局。

[0053] 需要说明的是，第一波长光束可以对应一种荧光信标电荷态布局度。第二波长空心光束的光束部分的功率和中心部分的功率不同，可以对应不同的荧光信标电荷态布居度，即不同的荧光强度。

[0054] 根据本发明的实施例，在低损超分辨模式下，第二波长空心光束可以在第二波长高斯光束的基础上进行转换。例如，一束光束强度分布为高斯分布的光束，使用相应波长的涡旋相位板对光束相位按照入射面上的角分布进行不同的调制，可以将光束转化为空心光束。涡旋相位板可采用VPP‑1a涡旋相位板，获得的空心光束的中心光功率密度与最高光功率密度比为1:50。在无背景宽场模式下，可以直接使用第二波长高斯光束。

[0055] 根据本发明的实施例，第一位置范围可以为第一波长光束聚焦在样品上的照射范围。第二位置范围可以为空心光束聚焦在样品上时中心孔洞以外的其他照射位置。例如，当光束聚焦在样品时，两波长光束的直径均为1cm，第二波长空心光束的中心孔洞直径为0.1cm，则第一位置范围可以为直径1cm的圆形区域，第二位置范围可以为外直径1cm，内直径0.1cm的圆环区域。

[0056] 需要说明的是，第一位置范围可以为第二位置范围，也可以为第一波长光束聚焦在样品的不包含第二位置范围的其他区域范围，也可以为第二波长空心光束中心孔洞的区域范围，也可以为任意指定的光束照射在样品的任何一块区域的范围。在本发明实施例中，第一位置范围可以根据实验者或用户的需求确定，在此不做限定。

[0057] 根据本发明的实施例，在需要成像的情况下，第二位置范围与第一位置范围交集部分的荧光信标荧光较强，第二位置范围以外的第一位置范围的荧光信标荧光较弱，第一位置范围以外的荧光信标不辐射荧光。

[0058] 根据本发明的实施例，收集单元140可以收集待测样品中的荧光信标发出的荧光光子信号，滤除其他波长的光子信号，例如可以得到目标光子信号。通过将目标光子信号传输至如计算机控制单元，例如可以根据荧光光子信号的光强信息结合软件进行宽场成像或扫描成像。可以结合的软件例如可以包括MATLAB（Matrix Laboratory，矩阵实验室）、LabVIEW（一种程序开发环境）等。

[0059] 根据本发明的实施例，第一泵浦光单元110可以包括：第一光源，用于生成第一波长光束。第一脉冲发生器，用于接收由控制单元发送的第一序列脉冲。第一调制器，用于根据第一序列脉冲控制第一波长光束，生成序列化的第一波长光束。第一光纤耦合‑准直系统，用于接收第一波长光束，以及输出第一准直光束。

[0060] 根据本发明的实施例，第二泵浦光单元120可以包括：第二光源，用于生成第二波长高斯光束。第二脉冲发生器，用于接收由控制单元发送的第二序列脉冲。第二调制器，用于根据第二序列脉冲控制第二波长光束，生成序列化的第二波长光束。第二光纤耦合‑准直系统，用于接收第二波长光束，以及输出第二准直光束。

[0061] 根据本发明的实施例，第一光源和第二光源可以包括激光光源及其他光源等其中至少之一。激光光源可以包括半导体激光器以及其他类型的激光器等其中至少之一。激光光源具有准直性高，亮度高、单色性好等优势，采用激光光源，可以达到较好的效果。

[0062] 需要说明的是，第一光源和第二光源可以为同一台机器发射的不同波长的泵浦光，也可以为两台不同的机器分别发射的两束泵浦光。第一光源和第二光源生成的两束泵浦光可以同时照射待测样品，也可以依次照射待测样品，也可根据预设的时间照射待测样品。预设时间可以包括多次实验总结出的效果最好的照射时间。例如，第一波长光束照射时间可以为10 μs，第二波长光束照射时间可以为10 μs，第一波长光束作为激发光可以再照射1 ms等。

[0063] 根据本发明的实施例，第一调制器、第二调制器可以分别对应的置于第一波长光束、第二波长光束的焦点处。调整第一调制器、第二调制器的三维位置与角度，使第一波长光束、第二波长光束分别对应的通过第一调制器、第二调制器后发生衍射，可以产生与第一波长光束、第二波长光束各自相对应的高阶衍射光束。第一调制器、第二调制器可以通过控制单元150来控制。例如，在第一调制器接收到控制单元150的高电压TTL信号的情况下，第一调制器可以将第一波长光束转换为高阶衍射光束输出。在第一调制器接受低电压TTL信号的情况下，第一调制器可以不输出任何光束。

[0064] 第一调制器、第二调制器可采用声光调制器，高阶衍射光可选为一阶衍射光，衍射效率可达80%，消光比可以约为2000:1。TTL信号可由PCI（Peripheral Component Interconnect，计算机与其外围设备互联标准）板卡产生，并可通过LabVIEW程序进行控制。

[0065] 根据本发明的实施例，第一光纤耦合‑准直系统可以通过将自由空间的第一波长光束耦合入保偏光纤出射得到第一准直光束。第二光纤耦合‑准直系统可以通过将自由空间的第二波长光束耦合入保偏光纤出射得到第二准直光束。

[0066] 根据本发明的实施例，第一泵浦光单元还可以包括如下中的至少之一：滤光片，用于调节第一波长光束的功率。反射镜，用于调节第一波长光束的方向。第一可调扩束器，用于调节第一波长光束的直径大小。第一四分之一波片，用于将线偏振的第一波长光束转换为圆偏振的第一波长光束。

[0067] 需要说明的是，第一四分之一波片可以是适用于第一波长光束的四分之一波片。第一波长光束的偏振可以为任意方向，选择圆偏振可以达到最佳效果。

[0068] 根据本发明的实施例，第二泵浦光单元还可以包括如下中的至少之一：半波片，用于调节第二波长光束的偏振方向。偏振分束器，用于结合半波片，调节第二波长光束的功率。第二可调扩束器，用于调节第二波长光束的直径大小。涡旋相位板，用于将第二波长高斯光束转换为第二波长空心光束。第二四分之一波片，用于将线偏振的第二波长光束转换为圆偏振的第二波长光束。1:1非偏振分束器，用于将第二波长光束按1：1的功率比例分束得到第一分束光束和第二分束光束。光功率计，用于测量第一分束光束或第二分束光束的功率，以及将测量结果发送至控制单元。

[0069] 根据本发明的实施例，涡旋相位板可以是适用于第二波长光束的涡旋相位板，可以在低损超分辨模式下将第二波长高斯光束转化为第二波长空心光束。在无背景宽场模式下可以除去此元件，直接使用第二波长高斯光束。第二四分之一波片可以是适用于第二波长光束的四分之一波片，第二波长光束的偏振可以为任意方向，选择圆偏振可以达到最佳效果。

[0070] 根据本发明的实施例，样品单元130可以包括：待测样品，荧光信标可以包括纳米金刚石颗粒。显微镜头，用于接收第一波长光束和/或第二波长光束，将第一波长光束和/或第二波长光束聚焦至待测样品上，以及收集待测样品中的荧光信标发射的第一波长光束信号、第二波长光束信号和荧光光子信号其中至少之一。压电陶瓷位移台，用于将待测样品的待测像素点以纳米精度移动到预设位置。温控箱，用于维持待测样品所处环境的温度及湿度的稳定。

[0071] 根据本发明的实施例，可以将含有荧光信标通过生物或化学等方法导入到生物样品中，得到待测样品。待测样品可以置于载玻片上进行成像。温控箱可以维持测量过程中的待测样品和光束位置的稳定。例如，本发明实施例中，温度可以稳定在10 mK以内，湿度可以稳定在0.5%以内。

[0072] 根据本发明的实施例，无背景宽场与低损超分辨两用成像装置还可以包括合束单元。合束单元可以接收第一波长光束和第二波长光束，输出合束光束。

[0073] 根据本发明的实施例，合束单元可以用于使第一波长光束与第二波长光束的光轴重合，以及调节通过显微镜头聚焦后的第二波长光束的焦平面的位置。

[0074] 根据本发明的实施例，合束单元可以包括如下中的至少之一：快速偏摆镜，用于调节第二波长光束的方向，以及调节第二波长光束经显微镜头聚焦后的焦点位置。可变焦距透镜，用于调节第二波长光束经显微镜头聚焦后的焦平面位置。透镜组，用于调节第二波长光束的位置、方向和发散角。短通二向色镜，用于透射第一波长光束以及反射第二波长光束，以及接收第一波长光束信号、第二波长光束信号和荧光光子信号其中至少之一，滤除第一波长光束，反射第二波长光束信号和荧光光子信号其中至少之一。长通二向色镜，用于透射第二波长光束，以及接收第二波长光束信号和荧光光子信号其中至少之一，滤除第二波长光束，反射荧光光子信号。

[0075] 根据本发明的实施例，透镜组可以对第二波长光束进行调整整形，使快速偏摆镜对第二波长光束的作用等效在显微镜头后焦面上，以便于实现较好的成像效果。例如，可采用可变焦透镜将第二波长光束的焦平面与第一波长光束的焦平面重合，采用两个透镜调节第二波长光束的大小，使第一波长光束与第二波长光束聚焦后光斑大小一致。短通二向色镜和长通二向色镜均可以具有高穿透率。高穿透率短通二向色镜可以在不影响第一波长光束的同时收集荧光信标的荧光光子信号。高穿透率长通二向色镜可以在不影响第二波长光束的同时收集荧光信标的荧光光子信号。

[0076] 根据本发明的实施例，第二波长光束通过长通二向色镜透射，经短通二向色镜反射后，可以与通过短通二向色镜透射的第一波长光束共同入射进显微镜头。利用快速偏摆镜、可变焦距透镜、透镜组可以调节第二波长光束的位置、方向和发散角，最终使第一波长光束与第二波长光束重合，并且经显微镜头聚焦后的焦点也重合。经过合束的泵浦光可以提高光束利用效率，获取更多的荧光信号，有利于对待测样品进行成像。

[0077] 需要说明的是，当第一波长光束和第二波长光束分别在各自的预设时间内依次照射待测样品时，可以无需合束单元。

[0078] 根据本发明的实施例，收集单元140可以包括：滤波片组，用于接收第一波长光束信号、第二波长光束信号和荧光光子信号其中至少之一，进行滤波处理，得到目标光子信号。电荷耦合器件相机，用于收集目标光子信号，以及将目标光子信号发送至控制单元150。单光子计数器，用于收集目标光子信号，以及将目标光子信号发送至控制单元150。

[0079] 根据本发明的实施例，滤波片组可以将第二电荷态的荧光信标的荧光信号与泵浦光等其他波长光信号分离，滤除干扰信号，以获得目标光子信号。控制单元150可以基于电荷耦合器件相机收集的目标光子信号，进行宽场成像，得到无背景宽场图像。控制单元150可以基于单光子计数器收集的目标光子信号进行扫描成像，得到低损超分辨图像。

[0080] 根据本发明的实施例，收集单元140还可以包括如下中的至少之一：1:1非偏振分束器，可以用于将荧光光子信号按比例分束，以用于CCD（电荷耦合器件）相机的无背景宽场成像和单光子计数器的低损超分辨成像。消色差透镜组，可以用于将荧光光子信号聚焦在CCD相机和单光子计数器上，以及配合小孔进行空间滤波。小孔，可以用于对荧光光子信号进行共聚焦系统的空间滤波。

[0081] 根据本发明的实施例，在需要成像时，由于泵浦光照射到待测样品上，样品区域的各种物体会反射泵浦光，如可以包括反射第一波长光束信号、第二波长光束信号等泵浦光。不可避免的，泵浦光会与荧光光子信号共同入射进后端的收集单元140，而荧光的光强较弱，与泵浦光混合后难以分辨，故需要用二向色镜将从待测样品处发射出的光子分离。此外，由于泵浦光和荧光的光强悬殊太大，导致荧光光子信号中只要混入少量的泵浦光，就会对收集等后续操作造成影响，故还需要用滤波片对收集的光子进行进一步的分离，滤除掺入的泵浦光光子，得到纯度较高的荧光光子，获得更佳的成像效果。

[0082] 图2示意性示出了根据本发明实施例的无背景宽场与低损超分辨两用成像装置的光路图。

[0083] 如图2所示，对应于第一泵浦光单元110，111为由第一波长激光器构成的第一光源，可以连续发射第一波长光束。115为圆形连续可变反射型中性密度滤光片，可以调节第一波长光束的功率。116为反射镜，可以用于改变第一波长光束的光束方向。112为脉冲发生器，可以控制声光调制器113产生序列化的第一波长光束。114为光纤耦合‑准直系统，可以对第一波长光束进行光束准直和调整方向。117为可调扩束器，可以调整第一波长光束的直径大小。118为四分之一波片，可以改变第一波长光束的偏振状态。经由第一泵浦光单元110的工作，可以得到第一波长光束。

[0084] 如图2所示，对应于第二泵浦光单元120，121为由第二波长激光器构成的第二光源，可以连续发射第二波长光束。125为电控旋转半波片，配合偏振分束器126可以调整第二波长光束的功率。123为声光调制器，可以通过脉冲发生器122控制，产生序列化的第二波长光束。124为光纤耦合‑准直系统，可以对第二波长光束进行光束准直和调整方向。127为可调扩束器。128为m=2 涡旋相位板，用于产生第二波长空心光束。129为四分之一波片。1210为1:1非偏振分束器，用于将第一波长信号分成两部分。1211为光功率计，用于测量一部分第二波长光束的功率。经由第二泵浦光单元120的工作，可以得到第二波长光束。

[0085] 如图2所示，对应于样品单元130，131为待测样品。132为高数值孔径显微镜头，可以用于将合束光束聚焦到待测样品131上。133为压电陶瓷位移台，可以用于控制待测样品131的位置。134为温控箱，可以用于维持待测样品131所处环境的温度、湿度稳定。

[0086] 如图2所示，对应于合束单元160，161为快速偏摆镜，可以改变第二波长光束的方向。162为可变焦距透镜，可以调整第二波长光束的发散角。163为透镜组。165为长通二向色镜，可以分离荧光光子信号和泵浦光。164为短通二向色镜，可以分离荧光光子信号、泵浦光以及合束信号，合束信号可以为对应于合束光束的信号。经由合束单元160的工作，可以基于短通二向色镜164得到要发送至样品单元130的合束光束，基于长通二向色镜165得到要发送至收集单元140的目标光子信号。

[0087] 如图2所示，对应于收集单元140，141为滤波片组，可以对目标光子光束进行后端滤波。144为1:1非偏振分束器，可以将目标光子光束分束。145、146、147、148为消色差透镜，可以对目标光子光束进行光束聚焦和准直。149为小孔，可以对目标光子光束进行空间滤波。143为单光子计数器，可以用于实现扫描成像。142为CCD相机，可以用于实现宽场成像。

[0088] 如图2所示，150为计算机控制单元，可以结合CCD相机142收集的目标光子信号、单光子计数器143收集的目标光子信号以及光功率计1211测量的第二波长光束的功率，生成低损超分辨图像和/或无背景宽场图像。计算机控制单元150还可以用于控制电控旋转半波片125、快速偏摆镜161、可变焦距透镜162、压电陶瓷位移台133、脉冲发生器112、122与声光调制器113、123，处理相机与单光子计数器发送回的荧光信号。

[0089] 本发明另一方面提供了一种低损超分辨成像方法。

[0090] 图3示意性示出了根据本发明实施例的低损超分辨成像方法的流程图。

[0091] 如图3，该方法包括操作S310 S330。~

[0092] 在操作S310，针对待测样品中的每个待测像素点，基于无背景宽场与低损超分辨两用成像装置，获取N个第一荧光强度和N个第二荧光强度。待测样品中包括多个待测像素点。第一荧光强度包括在利用第一波长光束照射第一初始化荧光信标的情况下的荧光强度，第二荧光强度包括在利用第一波长光束和第二波长光束同时照射第一增强荧光信标的情况下的荧光强度。第一初始化荧光信标是基于第一波长光束对待测样品中的荧光信标照射得到，第一增强荧光信标是基于第一波长光束和第二波长光束对第一初始化荧光信标照射得到。N为正整数。

[0093] 在操作S320，根据N个第二荧光强度的平均值，确定与待测像素点相对应的目标荧光强度。

[0094] 在操作S330，根据与多个待测像素点相对应的多个目标荧光强度，确定与待测样品相对应的低损超分辨图像。

[0095] 根据本发明的实施例，结合参见图2所示，在低损超分辨模式下，调节第一波长光束和第二波长光束的直径大小与功率，可以在待测样品处获得小的聚焦光束。使用单光子探测器143收集目标光子信号中的荧光光子，可以收集得到荧光光子的光强变化信息，与目标光子信号相关的光束可以由消色差透镜148聚焦到单光子探测器143的探头。每当一个荧光光子被测量到，单光子探测器143可以发出一个TTL脉冲信号。TTL脉冲信号可以被控制单元150的数据采集卡记录，从而得到荧光强度计数。成像时，可以通过位置扫描装置将待测样品的待测像素点移动到探测位置，对每一个像素点辐射的荧光光子进行收集，然后将像素点位置作为x‑y坐标，将荧光光强作为该点z数值进行成像。位置扫描装置可为压电陶瓷位移台133，压电陶瓷位移台133可选择P‑562.3CD（纳米定位系统）。例如，对面积为2μm*2μm的目标区域进行成像时，可以选择步长为10nm，将区域分为200*200个像素点，利用压电陶瓷位移台133将样品依次移动到200*200个坐标位置，分别测量每个坐标点的荧光强度，可以对该待测样品进行低损超分辨成像。

[0096] 需要说明的是，控制单元150需配合数据采集卡和脉冲信号发生器使用。数据采集卡可采用PCIe6363系列，脉冲信号发生器可采用PCI脉冲器。控制程序可基于LabVIEW软件编写，可用于对光源开关和位置移动的控制，获取荧光强度和位置信息并进行处理后成像。

[0097] 根据本发明的实施例，在对每一个待测像素点进行成像时，需要对每一块区域或每一个待测像素点循环多次以获得足够的荧光光子计数。也即，光束开关控制序列需要循环多次。通过该种方式，可以获得足够多的光子计数，得到较高信噪比的信号，有利于提高成像质量。

[0098] 根据本发明的上述实施例，由于使用的第一波长光束和第二波长光束的功率极低，并且为连续光，因此对样品损伤极小，可有效实现低损超分辨成像。

[0099] 图4示意性示出了根据本发明实施例的无背景宽场成像方法的流程图。

[0100] 如图4，该方法包括操作S410 S420。~

[0101] 在操作S410，基于无背景宽场与低损超分辨两用成像装置，获取针对待测样品拍摄得到的第一图像和第二图像。第一图像包括在利用第一波长光束照射包括第二初始化荧光信标的待测样品的情况下获得的图像，第二图像包括在利用第一波长光束和第二波长光束照射包括第二增强荧光信标的待测图像的情况下获得的图像。第二初始化荧光信标是基于第一波长光束对待测样品中的荧光信标照射得到，第二增强荧光信标是基于第一波长光束和第二波长光束对第二初始化荧光信标照射得到。

[0102] 在操作S420，根据第二图像与第一图像的差值，确定与待测样品相对应的无背景宽场图像。

[0103] 根据本发明的实施例，结合参见图2所示，在无背景宽场模式下，可以使用CCD相机142收集目标光子信号中的荧光光子，与目标光子信号相关的光束可以由消色差透镜145聚焦到CCD相机142。CCD相机142可以将每个像素点感受到的光信号传回控制单元150，控制单元150可以将第二波长光束开、关状态下的图像做差得到无背景宽场成像图像。

[0104] 根据本发明的实施例，在宽场模式下，调节可调扩束器117、127改变第一波长光束与第二波长光束的大小与发散角，可使聚焦后的照射范围变大。此外，通过调节电控旋转半波片125的角度可以改变第二波长光束的功率，使第二位置范围变为去除中心孔洞的整个第一位置范围。使用CCD相机收集光强变化信息，由于生物自发背景荧光不受第二波长光束的影响，因此可以滤除背景信号，获得高信背比的无背景宽场图像。

[0105] 需要说明的是，本发明实施例的无背景宽场成像方法与低损超分辨成像方法的具体实现过程可参照上述实施例中无背景宽场与低损超分辨两用成像装置的各功能模块的具体实现，在此不再赘述。

[0106] 图5示意性示出了根据本发明实施例的低功率连续光辅助成像的原理图。

[0107] 根据本发明的实施例，NV有两种电荷态，荧光较弱的暗态NV0和荧光较强的明态‑NV。在进行成像时，如图5所示，在532 nm激光的照射下，1064 nm激光可使NV在两种电荷态之间转换，不同功率1064 nm光作用下平衡时两种电荷态布局不同。由于两种电荷态荧光强‑ 0
度不同，因此1064 nm光功率不同， NV平衡态的荧光强度不同。NV辐射的荧光波长比NV 更
0 ‑
长，可将600 nm长通滤波片加入滤波片组滤除NV荧光，从而只探测NV辐射的荧光光子。

[0108] 为了更好的理解本发明实施例的原理和思想，请参阅图6至图12，以下结合几种具体的应用场景介绍利用本发明实施例的无背景宽场与低损超分辨两用成像装置分别对纳米金刚石颗粒、吞噬了纳米金刚石颗粒的线虫进行成像的原理。

[0109] 图6示意性示出了根据本发明实施例的对纳米金刚石颗粒进行成像的场景的示意图。

[0110] 图7示意性示出了根据本发明实施例的对纳米金刚石颗粒进行成像时控制信号与读取信号的序列图。

[0111] 如图6所示，待测样品为玻璃片610上的纳米金刚石颗粒620，成像模式为低损超分辨成像模式。参见图7所示，在需要对纳米金刚石颗粒进行低损超分辨成像的情况下，对一个待测像素点进行测量时，可以首先用功率为20 μW的532 nm高斯光束照射200 μs，将纳米金刚石颗粒中的NV电荷态布局初始化。然后，可以使用功率为20 μW的532 nm高斯光束照射10 ms，并用单光子计数器记录荧光强度。接着，可以用功率为20 μW的532 nm高斯光束和功‑
率为10 mW的1064 nm空心光束共同照射200 μs，将光束中心以外的纳米金刚石中的NV比例提高并达到平衡，使荧光计数增强。之后，可以使用功率为20 μW的532 nm高斯光束和功率为10 mW的1064 nm空心光束再共同照射10 ms。该“初始化‑计数‑增强‑计数”序列可以循环多次，如10次。然后，可以取计数增强值的平均作为该像素点的信号值。在需要测量下一个待测像素点的信号的情况下，可以通过压电陶瓷位移台控制样品进行移动。由于光束中‑
心的NV较少，图像中暗点凹陷可以代表NV所处的位置。可选的，使用去卷积算法可以将图像中的暗点凹陷提取出来，转变为亮点。

[0112] 图8A示意性示出了根据本发明实施例的采用传统聚焦成像方法对纳米金刚石颗粒进行成像得到的低损超分辨成像图。

[0113] 图8B示意性示出了根据本发明实施例的采用本发明装置对纳米金刚石颗粒进行成像得到的低损超分辨成像图。

[0114] 图8C示意性示出了根据本发明实施例的针对图8B所示的低损超分辨成像图采用去卷积算法提取暗点凹陷的结果图。

[0115] 传统聚焦成像时，参见图8A所展示的成像结果，纳米金刚石颗粒的分辨率约为325 nm。基于图7所示的序列，对纳米金刚石颗粒的荧光进行特异性调节并利用结构光成像，可以得到如图8B所示的结果。参见图8B所示，纳米金刚石在光斑中心处形成暗点。使用去卷积算法，可以得到如图8C所示的结果。参见图8C所示，得到的纳米金刚石颗粒成像结果的分辨率约为100 nm。

[0116] 图9示意性示出了根据本发明实施例的成像分辨率‑光束功率密度的曲线图。

[0117] 根据本发明的实施例，参见图9所示，通过继续提高用于照射待测样品的第一波长光束和/或第二波长光束的功率，可以将纳米金刚石颗粒的分辨率提高至30 nm左右，远低于光学荧光显微镜的衍射极限。

[0118] 图10示意性示出了根据本发明实施例的对吞噬了纳米金刚石颗粒的线虫进行成像的场景的示意图。

[0119] 图11示意性示出了根据本发明实施例的对吞噬了纳米金刚石颗粒的线虫进行成像时控制信号与读取信号的序列图。

[0120] 如图10所示，待测样品为线虫中的纳米金刚石颗粒，成像模式为无背景宽场成像模式。参见图11所示，在需要对对具有强荧光背景的线虫进行宽场成像的情况下，可以首先用功率为100 μW的532 nm高斯光束照射100 ms，将纳米金刚石颗粒中的NV电荷态布居初始化，拍摄第一张图像。然后，可以使用功率为100 μW的532nm高斯光束和功率为10 mW的1064 ‑nm高斯光束共同照射200 μs，将区域内的纳米金刚石中的NV比例提高并达到平衡，使荧光计数增强。之后，可以使用功率为100 μW的532 nm高斯光束和功率为10 mW的1064 nm高斯光束再共同照射100 ms，拍摄第二张图像。然后，可以取第二张图像与第一张图像的差值作为一帧无背景宽场图像。重复此过程拍摄以如200.2 ms为刷新时间的多帧图像，图像中的亮点可以代表纳米金刚石颗粒。

[0121] 图12A示意性示出了根据本发明实施例的采用传统宽场成像方法对线虫内吞的纳米金刚石颗粒进行成像得到的有背景宽场成像图。

[0122] 图12B示意性示出了根据本发明实施例的采用本发明装置对线虫内吞的纳米金刚石颗粒进行成像得到的无背景宽场成像图。

[0123] 传统宽场成像时，参见图12A所展示的成像结果，纳米金刚石颗粒被淹没在自发荧光背景中。基于图11所示的序列，对线虫中的纳米金刚石颗粒的荧光进行特异性调节并利用结构光成像，可以得到如图12B所示的无背景宽场成像结果。参见图12B，可以确定基于本发明提供的装置和方法进行无背景宽场成像是，可以很好地去除背景，提高了信背比，并可容易的实现将纳米金刚石颗粒从线虫荧光背景中提取出来。

[0124] 通过本发明的上述实施例，提供了一种全光的、适用于生物活体样品原位成像的无背景宽场与低损超分辨两用成像装置及成像方法。相关装置及方法使用低功率连续光调制荧光信标电荷态进而调制荧光信号光子数，不仅可以实现对待测样品的无背景宽场成像，也可以实现低损超分辨成像，而且不影响待测样品的性质，信背比高。与现有技术相比，由于电荷态寿命长，可以达到秒量级，故功率较低的泵浦光便可控制荧光信标的电荷态，不影响待测样品的性质，对样品损伤小，生物兼容性好。此外，本发明实施例采用全光方法，系统结构和操作简单，使用和组装方便，节省了操作成本和费用成本，提高了用户的使用体验。

[0125] 需要说明的是，结合本文中所公开的实施例描述的各示例的单元及算法步骤，能够以电子硬件、计算机软件或者二者的结合来实现。为了清楚地说明硬件和软件的可互换性，在上述说明中已经按照功能一般性地描述了各示例的组成及步骤。这些功能究竟以硬件还是软件方式来执行，取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。专业技术人员可以对每个特定的应用来使用不同方法来实现所描述的功能，但是这种实现不应认为超出本发明的范围。

[0126] 结合本文中所公开的实施例描述的方法或算法的步骤可以直接用硬件、处理器执行的软件模块，或者二者的结合来实施。软件模块可以置于随机存储器（RAM）、内存、只读存储器（ROM）、电可编程ROM、电可擦除可编程ROM、寄存器、硬盘、可移动磁盘、CD‑ROM、或技术领域内所公知的任意其它形式的存储介质中。

[0127] 以上对本发明所提供的无背景宽场与低损超分辨两用成像系统及方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围。