一种识别喹硫磷农药的纳米抗体及酶联免疫分析方法

摘要

本发明公开了一种识别喹硫磷农药的纳米抗体及酶联免疫分析方法。本发明首先构建了一种噬菌体展示纳米抗体文库，并从噬菌体展示纳米抗体文库中筛选得到一种针对喹硫磷农药的纳米抗体，该纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该纳米抗体能够识别喹硫磷农药，对其他有机磷类农药交叉反应率低；具有较高的热稳定性、有机耐受性。本发明提供的酶联免疫分析方法，最低检测限为2.57ng/mL，线性范围为5.84‑88.34ng/mL，检测结果准确、稳定性好，可以广泛的应用于农产品中喹硫磷农药残留的检测。

权利要求

1.一种特异性识别喹硫磷农药的纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述特异性识别喹硫磷农药纳米抗体的核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述纳米抗体或权利要求2所述核苷酸在检测喹硫磷农药或制备检测喹硫磷农药免疫试剂盒中的应用。

4.一种检测喹硫磷农药的酶联免疫分析方法，其特征在于，采用权利要求1所述纳米抗体，进行酶联免疫检测。

5.根据权利要求4所述酶联免疫分析方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)将喹硫磷农药标准品或待测样品加入包被含喹硫磷农药完全抗原的酶标板微孔中，然后加入权利要求1所述纳米抗体；

(2)加入酶标记的二抗，孵育；

(3)再加入显色液，孵育；

(4)最后，加入终止液，测定吸光值并建立标准曲线计算样品中喹硫磷农药的含量。

6.根据权利要求5所述酶联免疫分析方法，其特征在于，步骤(4)中所述建立标准曲线是以各药物浓度的log10值为横坐标，以各浓度药物的吸光值B与对照孔吸光值B0的比值为纵坐标，建立标准曲线，进而根据待测样品的B/B0值来计算样品中喹硫磷农药的含量。

7.一种重组载体，其特征在于，含权利要求2所述核苷酸。

8.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求7所述重组载体。

9.权利要求7所述重组载体或权利要求8所述重组细胞在检测喹硫磷农药或制备检测喹硫磷农药免疫试剂盒中的应用。

10.一种检测喹硫磷农药的酶联免疫分析的试剂盒，其特征在于，含权利要求1所述纳米抗体。

说明书

一种识别喹硫磷农药的纳米抗体及酶联免疫分析方法

技术领域

[0001] 本发明属于有机磷农药残留检测技术领域。更具体地，涉及一种识别喹硫磷农药的纳米抗体及酶联免疫分析方法。

背景技术

[0002] 喹硫磷(Quinalphos)，又名爱卡士、喹恶磷等，其分子结构式为C12H15N2O3PS，工业产品为白色无味结晶，在几种常见有机溶剂如苯、丙酮、乙醚、乙腈、乙酸乙酯等中溶解度较高。喹硫磷是一种广谱性的有机磷杀虫剂，属于中等毒性，但在植物上降解速度快，残效期短，允许用于蔬菜作物。广泛用于水稻、棉花、柑橘、茶树、蔬菜等病虫害防治中。喹硫磷对人具有毒性，引发恶心、呕吐、腹痛、腹泻、昏迷等症状，急性中毒还可危及生命。

[0003] 目前，喹硫磷的滥用及残留问题依然比较突出，喹硫磷在环境中的降解较慢，一旦污染环境，则会导致长时间的污染。有研究表明，施药292天后，喹硫磷在棉田中的降解率为50.9％。因此，喹硫磷的滥用会对环境的安全和人类的健康带来严重的隐患，加强对喹硫磷农药的监测和检测十分必要。

[0004] 目前国内外喹硫磷农药残留检测技术方法较多，主要包括仪器法、酶抑制法、免疫分析法。仪器法虽然准确性高，但样品前处理过程繁杂，仪器设备价格昂贵，操作复杂等问题，并不能满足目前市场对大量农产品进行筛查的需要；酶抑制法中的酶制剂稳定性较差，且容易产生假阳性；基于单克隆抗体建立的免疫分析方法，具有快速、灵敏、高通量的优势，但是在极端条件下抗体往往稳定性差，容易失活。如现有技术中公开了一种喹硫磷农药残留的快速检测方法，利用化学发光原理，将喹硫磷浓度与相对发光强度建立数学模型，通过测定相对发光强度计算分析得出喹硫磷农药残留量，但是该方法中对样品处理和制备的过程复杂繁琐，并不能满足目前市场对大量农产品进行筛查的需要。而目前还鲜有报道能单独作用于喹硫磷农药残留检测的纳米抗体及检测方法，因此，需要开发出更多高效便捷、低成本的喹硫磷农药残留的现场快速检测分析方法。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种识别喹硫磷农药的纳米抗体及酶联免疫分析方法。

[0006] 本发明的第一个目的是提供一种特异性识别喹硫磷农药的纳米抗体。

[0007] 本发明第二个目的是提供一种编码所述特异性识别喹硫磷农药纳米抗体的核苷酸。

[0008] 本发明第三个目的是提供所述纳米抗体和核苷酸的应用。

[0009] 本发明第四个目的是提供一种检测喹硫磷农药的酶联免疫分析方法。

[0010] 本发明第五个目的是提供一种重组载体。

[0011] 本发明第六个目的是提供一种重组细胞。

[0012] 本发明第七个目的是提供所述重组载体和重组细胞的应用。

[0013] 本发明第八个目的是提供一种检测喹硫磷农药的酶联免疫分析的试剂盒。

[0014] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：

[0015] 本发明利用噬菌体展示技术，在构建的双峰驼免疫抗体文库中进行亲和淘筛，获得一种抗喹硫磷的纳米抗体VHH 8F，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。研究表明，通过对不同的有机磷农药进行交叉反应，本发明提供的纳米抗体VHH 8F对其他有机磷类农药交叉反应率低；同时，经过热稳定性分析和有机溶剂耐受性等实验分析表明，纳米抗体VHH 8F具有更强的热稳定性，在95℃中孵育5min后的抗原结合活性仍高于 80％；还具有较高的乙腈耐受性，当乙腈浓度为30％左右时，纳米抗体VHH 8F 仍能保持95％以上的抗原结合活性。

[0016] 本发明通过优化包被原浓度、抗体浓度、离子浓度等参数，建立了基于纳米抗体VHH 8F检测喹硫磷农药的酶联免疫分析方法，该纳米抗体检测喹硫磷农药的IC50为22.72ng/mL，最低检测限为2.57ng/mL，线性范围为5.84‑88.34ng/mL。

[0017] 本发明提供所述纳米抗体或所述核苷酸在检测喹硫磷农药或制备检测喹硫磷农药免疫试剂盒中的应用。

[0018] 本发明提供一种检测喹硫磷农药的酶联免疫分析方法，采用所述纳米抗体 VHH 8F，进行酶联免疫检测，包括以下步骤：

[0019] (1)将喹硫磷农药标准品或待测样品加入包被含喹硫磷农药完全抗原的酶标板微孔中，然后加入所述纳米抗体；

[0020] (2)加入酶标记的二抗，孵育；

[0021] (3)再加入显色液，孵育；

[0022] (4)最后，加入终止液，测定吸光值并建立标准曲线计算样品中喹硫磷农药的含量。

[0023] 优选地，所述建立标准曲线是以各药物浓度的log10值为横坐标，以各浓度药物的吸光值B与对照孔吸光值B0的比值为纵坐标，建立标准曲线，进而根据待测样品的B/B0值来计算样品中喹硫磷农药的含量。

[0024] 本发明提供一种重组载体，含所述核苷酸，其序列如SEQ ID NO.2所示。

[0025] 本发明提供一种重组细胞，含有上述重组载体。

[0026] 本发明提供所述重组载体或所述重组细胞在检测喹硫磷农药或制备检测喹硫磷农药免疫试剂盒中的应用。

[0027] 本发明还提供一种检测喹硫磷农药的酶联免疫分析的试剂盒，含有所述纳米抗体。

[0028] 本发明具有以下有益效果：

[0029] 本发明从噬菌体展示纳米抗体文库中筛选得到一种针对喹硫磷农药的纳米抗体，通过对不同的有机磷农药进行交叉反应，表明纳米抗体VHH 8F能与喹硫磷农药特异性结合，对其他有机磷类农药交叉反应率低；同时，经过热稳定性分析和有机溶剂耐受性等实验分析表明，本发明提供的纳米抗体VHH 8F具有更强的热稳定性，在95℃中孵育5min后的抗原结合活性仍高于80％；还具有较高的乙腈耐受性，当乙腈浓度为30％左右时，纳米抗体VHH 8F仍能保持95％以上的抗原结合活性。

[0030] 本发明提供检测喹硫磷农药的酶联免疫分析方法，采用纳米抗体VHH 8F进行检测，该纳米抗体检测喹硫磷农药的IC50为22.72ng/mL，最低检测限为2.57 ng/mL，线性范围为5.84‑88.34ng/mL。检测结果准确、效果好、稳定性好，该方法可以广泛的应用于农产品中喹硫磷农药残留的检测。

附图说明

[0031] 图1为双峰驼抗血清效价；

[0032] 图2为双峰驼抗血清抑制；

[0033] 图3为琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA；

[0034] 图4为SDS‑PAGE分析纯化后的纳米抗体VHH 8F；

[0035] 图5为纳米抗体8F和单克隆抗体在不同温度下的热稳定性；

[0036] 图6为纳米抗体8F和单克隆抗体在95℃下的热稳定性

[0037] 图7为纳米抗体8F与单克隆抗体对乙腈的耐受性分析；

[0038] 图8为纳米抗体8F检测喹硫磷标准曲线。

具体实施方式

[0039] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0040] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0041] 实施例1抗喹硫磷农药纳米抗体免疫文库的构建

[0042] 1、试验方法

[0043] (1)采用本发明研究实验室前期合成的半抗原H1与卵清白蛋白OVA (albumin)和匙孔血蓝蛋白KLH(keyhole limpet heocyanin)分别通过活泼酯法偶联制备出完全抗原H1‑OVA和H1‑KLH。

[0044] 具体操作方法如下：分别称取10mg H1，3mg NHS和5mg EDC，加入500 μL DMF溶解，4℃搅拌过夜。称量10mg OVA/KLH用3mL PBS溶解后逐滴加入上述过夜后的H1/NHS/EDC溶液中，继续4℃搅拌12h。搅拌好的溶液用PBS 透析5次，每次间隔12h。将透析后的溶液离心取上清后分装在‑20℃冻存。所述半抗原H1的化学式如下所示：

[0045]

[0046] 取0.5mg的H1‑KLH与等体积的弗氏完全佐剂乳化，对健康的3岁双峰驼颈部皮下进行多点免疫注射。每隔2周进行一次加强免疫，免疫剂量与首次免疫相同，每次免疫后第7天采集10mL静脉血。

[0047] 采用间接竞争ELISA方法测定血清效价及药物抑制，结果如图1和图2所示，抗血清效价在第3次免疫后显著提高，且随着免疫次数增加而不断提高。取血清抑制效果最好批次(第5次)的外周血进行淋巴细胞分离以及RNA的提取。

[0048] (2)采集双峰驼外周血后需尽快进行淋巴细胞分离，具体操作方法如下：将外周血与无菌生理盐水在无RNA酶的干净50mL离心管中等体积混合稀释。用商品化淋巴细胞分离液对稀释后的外周血进行离心分离，参考离心参数为：室温(25℃)，500g，30min。不同血细胞因密度的不同离心后分布在淋巴细胞分离液的不同深度，其中淋巴细胞在液面下约1/3深度处，形成白色细胞层。无 RNA酶的移液器小心收集淋巴细胞层到无RNA酶的干净50mL离心管中，用无菌生理盐水洗涤细胞表面多余的淋巴细胞分离液，离心收集细胞沉淀。用裂解液TRNsol重悬并裂解淋巴细胞，每10mL血液所分离的淋巴细胞大约需要1‑2 mL TRNsol，置于‑80℃保存备用，可保存至少一年。

[0049] (3)根据Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行总RNA的提取。提取总 RNA后取1‑2μL样品进行核酸电泳并用超微量分光光度计Nanodrop鉴定其纯度和浓度。从核酸电泳凝胶上可见清晰的28S和18S条带，结果如图3所示，无明显降解，无基因组DNA混杂。
Nanodrop测定其A260/A280在2.0左右，表明提取的总RNA质量较好。

[0050] 以提取的总RNA为模板，根据TARAKA公司第一链反转录试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。反转录完成后将产物先混合均匀，再分装于不同的无菌离心管，保存在‑80℃环境。

[0051] (4)利用Taq Mix DNA聚合酶经二轮PCR扩增获得骆驼重链抗体的可变区编码基因，采用引物如下表1所示。第一轮PCR使用引物为P1和P2，反应条件如下：94℃，4min，94℃，30s，55℃，1min，72℃，1min，30个循环， 72℃彻底延伸10min。

[0052] 把第一轮PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，通过DNA切胶回收试剂盒回收目的片段(600‑700bp)。以回收的目的片段为模板，利用表1中引物P3和P4进行第二轮扩增。PCR反应条件为：94℃，4min，94℃，30s，55℃，30s，72℃， 1min，30个循环，72℃彻底延伸10min。通过切胶回收得到纳米抗体基因片段 (400bp左右)，并置于‑20℃保存备用。

[0053] 将上述得到的纳米抗体基因片段及噬菌粒载体pComb3xss用sfi I在50℃下进行酶切，并回收酶切产物。然后在16℃下用T4连接酶连接过夜(pComb3xss 和纳米抗体片段摩尔比1：3)。

[0054] 表1扩增VHH基因的引物序列

[0055]

[0056] (5)将上述连接产物经PCR清洁回收试剂盒进行回收后，溶于20μL的无菌水中，取1μL纯化后的连接产物加入25μL TG1电转化感受态细胞中(‑80℃拿出来，冰上融化)，用手轻弹EP管混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。转移至冰预冷的0.1cm电击杯中，避免产生气泡，电击转化(1.8kv)。迅速加入 0.5mL无抗性的LB培养基，吹打电击杯底部数次混匀后，转移到50mL离心管中，37℃，250rpm培养1h。电转20次，将所有纯化后的连接产物全部电转至 TG1中。

[0057] 把电转后的20次菌液合在一起(约10mL)，取10μL用LB培养基稀释成 10‑4、10‑5、10‑6，涂布100μL各浓度菌液于LB‑Amp板上，剩余的电转菌液每 0.5mL涂布于一块直径13cm的
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LB‑Amp圆板上，共涂布20块，37℃倒置培养过夜。次日计算转化文库大小为1.43×10cfu/mL，并随机挑取25个单克隆，送公司测序，鉴定抗体库的多样性。库容依据克隆数目和多样性来计算。

[0058] (6)将培养基上的单克隆用LB培养基刮下，加甘油调至20％浓度后分装于1.5mL离心管，置于‑80℃冻存，即为抗喹硫磷农药VHH抗体基因菌库。

[0059] (7)取上述抗喹硫磷农药VHH抗体基因菌库1mL接种至200mL的LB培养基中，加入200μg/mL氨苄青霉素，37℃，250rpm/min，培养至OD600约0.5。加入辅助噬菌体M13K07静置侵染30min(感染复数比20:1)，37℃，250rpm/min， 1h，之后加入50μg/mL卡那霉素，过夜培养。次日，收集上清(12000rpm/min， 20min)，加入1/5的20％PEG‑NaCl溶液，冰上孵育2h。随后，12000rpm/min， 20min收集噬菌体，并用PBS重悬，即得到抗喹硫磷农药噬菌体展示纳米
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抗体库，测定抗体库的滴度为5×10 pfu/mL，其余保存于‑80℃备用。

[0060] 实施例2喹硫磷农药纳米抗体的筛选与鉴定

[0061] 采用实施例1中的在半抗原H1的羧基上偶联OVA蛋白的H1‑OVA为包被原，对实施例1中建立的纳米抗体文库进行4轮亲和淘筛，淘筛方案如表2所示。

[0062] 表2纳米抗体文库淘筛方案

[0063]

[0064] (1)包板：选用吸附性较强的酶标板进行淘筛。每轮包被3个去背景孔(KLH、 BSA及OVA，1mg/mL，100μL/孔)和包被原孔(100μL/孔)，37℃中孵育12‑14 h。次日，用PBST缓冲液洗板2次，每孔加入150μL封闭液，于37℃中孵育3 h。弃去封闭液，37℃中烘干1h，于4℃冰箱中保存。

[0065] (2)淘筛：取100μL纳米抗体文库加入到去背景孔，37℃中孵育1h。随后将液体转移至包被原孔，37℃中孵育1h。弃去包被原孔中液体，用PBST缓冲液洗涤5次，PBS缓冲液洗涤15次。第一轮采用酸洗脱，加入100μL 0.1M Gly‑HCl(pH 2.2)，37℃中孵育15min，吸出液体，立即加入50μL 1M Tris‑HCl (pH 8.0)中和。其余三轮采用竞争洗脱，加入100μL梯度稀释的喹硫磷溶液， 37℃中孵育1h。取10μL洗脱产物通过平板菌落数计算滴度，其余洗脱产物经辅助噬菌体救援扩增后用于下一轮淘筛。

[0066] (3)特异性噬菌体克隆的挑选与鉴定：随机挑取96个噬菌体克隆，接种到含500μL/孔LB培养基(Amp)深孔板中，37℃，180rpm震荡培养过夜。取20 μL过夜菌接种到1mL/孔培养基(Amp)深孔板中，37℃，180rpm震荡培养3h，每孔加入终浓度为1mM IPTG，28℃180rpm震荡培养过夜。次日，4500rpm离心20min，弃去上清，置于‑80℃超低温冰箱中3h。室温解冻后，沉淀用200μL PBS缓冲液重悬，将深孔板置于4℃中振摇1h。4500rpm离心20min，取上清进行ic‑ELISA检测，具体步骤如下：

[0067] 1)包板：用包被液将包被原H1‑OVA稀释至1μg/mL，每孔加入100μL稀释后的包被原，于37℃恒温箱中孵育12‑14h。

[0068] 2)封闭：次日，每孔用PBST缓冲液洗涤2次，拍干孔中液体，每孔加入 120μL 2％脱脂奶粉，于37℃恒温箱中封闭2h。用PBST缓冲液洗涤2次，拍干备用。

[0069] 3)孵育一抗：每孔加入50μL周质蛋白和50μL PBS缓冲液，此为效价孔。每孔加入50μL上清蛋白和50μL浓度为1μg/mL的喹硫磷溶液，此为抑制孔。 37℃恒温箱中孵育40min后，用PBST缓冲液洗涤5次，拍干。

[0070] 4)孵育二抗：每孔加入100μL兔抗VHH‑HRP二抗(5000倍稀释)，于37℃恒温箱中孵育40min，用PBST缓冲液洗涤5次，拍干。

[0071] 5)显色及终止：每孔加入100μL TMB双组分显色液，于37℃恒温箱中孵育10min后，每孔加入50μL 10％H2SO4，终止反应。

[0072] 6)读数：用酶标仪读取450nm处吸光值。

[0073] 根据ic‑ELISA测定结果，计算抑制率(Inhibition rate，I)，公式如下：

[0074] I(％)＝(1‑B/B0)×100

[0075] 式中，B0为效价孔对应的吸光值，B为抑制孔对应的吸光值。

[0076] 将抑制率大于50％的克隆，送至睿测序公司进行基因测序，对氨基酸序列进行对比分析得到纳米抗体VHH 8F，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码纳米抗体VHH 8F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0077] 实施例3抗喹硫磷纳米抗体的可溶性表达与鉴定

[0078] 提取实施例1中的pComb3xss‑VHH 8F质粒并通过化学转化方法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态。将含有pComb3xss‑VHH 8F质粒的BL21(DE3)重组菌培养至OD600值为0.6‑0.8，加入1mM的IPTG，37℃诱导表达20h。次日，离心收菌体。然后通过Tris‑蔗糖低温渗透压法提取周质腔可溶蛋白，经Ni柱亲和纯化后得到可溶性纳米抗体VHH 8F。

[0079] 经SDS‑PAGE分析鉴定结果如图4所示，VHH 8F的分子量大小在17‑18kDa 左右，纯度达90％以上。经微量分光光度计测定VHH 8F的表达量为3mg/L。实施例4纳米抗体VHH 8F间接竞争ELISA检测喹硫磷及类似农药的特异性及灵敏性

[0080] 选取对硫磷等其他9种禁用或滥用情况比较严重的有机磷农药：喹硫磷、三唑磷、蝇毒磷、毒死蜱、伏杀磷、杀螟硫磷、甲基对硫磷、苯线磷、乙拌磷作为结构类似物，采用ic‑ELISA分别绘制标准曲线，计算各自的IC50值，采用公式计算各有机磷农药与抗喹硫磷纳米抗体的交叉反应率，计算公式：CR(％) ＝100×IC50(喹硫磷)/IC50(类似物)，结果如下表3所示。

[0081] 表3纳米抗体VHH 8F ic‑ELISA方法检测喹硫磷类似物的灵敏度和特异性[0082]

[0083]

[0084] 由表3可知，纳米抗体VHH 8F能与喹硫磷农药特异性结合，对其他有机磷类农药交叉反应率较低，可用于实际中喹硫磷药物的检测。

[0085] 实施例5纳米抗体VHH 8F的热稳定性分析

[0086] 将纳米抗体VHH 8F与实验室前期制备的抗喹硫磷单克隆抗体稀释至工作浓度，分别置于20、37、50、65、80和95℃中孵育5min。待抗体恢复至室温后，抗体与抗原的结合能力采用ic‑ELISA法进行测定，以未加热的抗体与抗原结合能力作为100％，评价不同抗体在不同温度下加热5min的稳定性。

[0087] 将纳米抗体VHH 8F与单克隆抗体稀释至同一工作浓度，置于95℃中孵育 10、20、30、40、50和60min。待抗体恢复至室温后，采用ic‑ELISA测定抗体与抗原的结合能力，以未加热的抗体与抗原结合能力作为100％，评价不同抗体在极端高温条件下的稳定性。

[0088] 结果如图5所示，随着温度逐渐从4℃提高至95℃，纳米抗体仍保持较高活性，且VHH 8F在95℃中孵育5min后的抗原结合活性仍高于80％，而单克隆抗体在80℃中孵育5min已经失去结合抗原的能力。由图6可知，VHH 8F在95℃孵育1h后仍具有超过95％的抗原结合活性，而单克隆抗体在同等条件下已经失去结合抗原的能力。综合以上结果，相比较于单克隆抗体来说，纳米抗体VHH 8F 具有更强的热稳定性。

[0089] 实施例6纳米抗体VHH 8F的有机溶剂耐受性

[0090] 用不同浓度(10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％和80％)的乙腈作为抗体稀释液，将纳米抗体VHH 8F与单克隆抗体稀释至同一工作浓度，用采用 ic‑ELISA方法测定抗体与抗原的结合能力，以PBS缓冲液作为抗体稀释液的抗体抗原结合能力作为100％，评价不同抗体对乙腈的耐受性。

[0091] 结果如图7所示，当乙腈浓度为30％左右时，纳米抗体8F仍能保持95％以上的抗原结合活性，而在同一乙腈浓度下，单克隆抗体仅能保持40％左右的抗原结合活性，表明纳米抗体8F的乙腈耐受性要优于单克隆抗体。

[0092] 实施例7一种检测喹硫磷农药的酶联免疫分析方法

[0093] 通过优化包被原浓度、抗体浓度、离子浓度等参数，建立了基于VHH 8F检测喹硫磷的ic‑ELISA方法，具体步骤如下：

[0094] 将50μL纳米抗体VHH 8F和50μL梯度稀释(从4μg/mL开始，2倍稀释，共15个梯度)的喹硫磷农药加入提前包被H1‑OVA的孔内，37℃孵育30min。用200μL PBST洗板5次，拍干。加入100μL兔抗‑HA多抗‑HRP，37℃孵育30 min。用200μL PBST洗板5次，拍干。然后加入100μL TMB显色液，37℃孵育10min。最后加入50μL终止液(10％H2SO4)，读取450nm处吸光值。

[0095] 检测喹硫磷农药标准曲线如图8所示，IC50为22.72ng/mL，最低检测限为 2.57ng/mL，线性范围为5.84‑88.34ng/mL。

[0096] 综上可知，本发明从噬菌体展示纳米抗体文库中筛选得到一种针对喹硫磷农药的纳米抗体VHH 8F，能与喹硫磷农药特异性结合，对其他有机磷类农药交叉反应率低；VHH 8F具有较强的热稳定性和乙腈耐受性。此外，本发明提供的基于VHH 8F检测喹硫磷的ic‑ELISA方法，其IC50为22.72ng/mL，最低检测限为 2.57ng/mL，线性范围为5.84‑88.34ng/mL。检测结果准确、效果好、稳定性好。该方法可以广泛的应用于农产品中喹硫磷农药残留的检测。

[0097] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。