meso-2,3-丁二醇脱氢酶及其突变体和应用

摘要

本发明公开了一种meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶及其突变体和应用，该meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明发现了一种具有耐高温特性的meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶，并以该meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶为基础，通过加速采样分子动力学模拟方法，动态描述产物释放过程，解决高稳定性和高活性无法兼顾的问题，获得可以催化制备meso‑2,3‑丁二醇的突变体，该突变体具有非常好的耐高温特性。在100℃热处理30分钟后，残余酶活为23.9％。突变体催化乙偶姻形成meso‑2,3‑丁二醇中，活性提高约2‑5倍。反应获得的产物meso‑2,3‑丁二醇具有极高的光学纯度，为生物转化生产meso‑2,3‑丁二醇提供了广阔的应用前景。

权利要求

1.meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶突变体，其特征在于，具体突变为以下任意一种：（1）由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸突变为苏氨酸；

（2）由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸突变为苏氨酸且第192位组氨酸突变为色氨酸；

（3）由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸突变为苏氨酸，第202位天冬氨酸突变为色氨酸；

（4）由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸突变为苏氨酸，第192位组氨酸突变为色氨酸，第197位天冬酰胺突变为丝氨酸。

2.一种如权利要求1所述的meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶突变体的编码基因。

3.一种包含权利要求2所述编码基因的重组载体。

4.一种包含权利要求2所述编码基因的基因工程菌。

5.如权利要求1所述的meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶突变体在催化乙偶姻生成meso‑2,3‑丁二醇中的应用。

6.如权利要求4所述的基因工程菌在催化乙偶姻生成meso‑2,3‑丁二醇中的应用。

说明书

meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶及其突变体和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶及其突变体和 应用。

背景技术

[0002] 2,3‑丁二醇是一种多功能平台化学品，用于制造药物、化妆品、食品添加剂、燃 料和溶剂，其中meso‑2,3‑丁二醇除了是2‑丁醇的前体外，还是化妆品的防腐剂和保湿剂，广泛应用于生物燃料和食品工业。2,3‑丁二醇可以通过化学和生化途径合成。由 于使用低成本的可再生碳源，减少温室气体排放和选择性生产纯手性的2,3‑丁二醇， 生物途径更具环境和经济优势。生产过程中的碳源也可以使用农业中的可再生原料， 降低底物成本，使生物过程更加环保。预计到2027年，2,3‑丁二醇市场将投资约2.2 亿美元。因此，生物基2,3‑丁二醇的工业生产预计将在未来几年得到大力发展。

[0003] 传统上，2,3‑丁二醇是由800‑900℃的不可再生石油中的裂解气体化学催化产生 的，需要大量的能量。在裂解过程中，产生大量的温室气体，因此这是一个非环保的 过程。虽然化学路线是2,3‑丁二醇生产的常规方法，但它是昂贵和复杂的，并且产生 的2,3‑丁二醇是外消旋混合物，其纯化成本很高。反之，生物途径合成2,3‑丁二醇仅需要温和的操作条件，如较低的温度和压力。此外，可以从低成本的原材料和简单的 反应条件中生产出高光学纯度的2,3‑丁二醇。

[0004] 然而，微生物发酵法在实验室和工业规模生产2,3‑丁二醇的应用经常受到底物和 产物抑制。在发酵过程中，酶的活性被抑制一直是提高产量的瓶颈。另一方面野生的 meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶无法兼顾高活性和高稳定性。因此，通过基于结构的分子改造 双目标协同进化(稳定性和活性)获得meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶，有助于其更好的进行 工业应用。

[0005] 鉴于此，还需要进一步深入研究，通过基于结构的酶设计，来解决NAD(H)特异 性的meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶催化生产meso‑2,3‑丁二醇稳定性和活性无法兼顾的问 题。

发明内容

[0006] 为了解决来源于Lactococcus lactis的原始meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶(氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示)稳定性和活性无法兼顾的问题，本发明提供了一种meso‑2,3‑丁二 醇脱氢酶及其突变体和应用。

[0007] 具体技术方案如下：

[0008] 本发明提供了一种meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 该酶具有耐高温的特性。

[0009] 本发明还提供了meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶突变体，由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列 的第40位，第51位，第72位，第73位，第162位，第192位，第202位，第197 位，第204位进行单点突变或多点组合突变获得。

[0010] 进一步地，具体突变为以下任意一种：

[0011] (1)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第40位谷氨酰氨突变为赖氨酸；

[0012] (2)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第51位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸；

[0013] (3)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第72位谷氨酸突变为赖氨酸；

[0014] (4)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第73位赖氨酸突变为苏氨酸；

[0015] (5)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸突变为苏氨酸；

[0016] (6)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第192位组氨酸突变为甲硫氨酸，精氨 酸或酪氨酸；

[0017] (7)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第202位天冬氨酸突变为半胱氨酸，谷 氨酸，甘氨酸，脯氨酸或色氨酸；

[0018] (8)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第197位天冬酰胺突变为甘氨酸，赖氨 酸，丝氨酸或缬氨酸；

[0019] (9)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第204位色氨酸突变为酪氨酸；

[0020] (10)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸突变为苏氨酸且第192 位组氨酸突变为色氨酸；

[0021] (11)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸突变为苏氨酸，第202 位天冬氨酸突变为色氨酸；

[0022] (12)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸突变为苏氨酸，第192 位组氨酸突变为色氨酸，天冬酰胺突变为丝氨酸。

[0023] 本发明对来源于Lactococcus lactis的meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶(LlBDH，氨基酸序 列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)进行AlphaFold 2同源 四聚体结构建模，用天然底物乙偶姻进行分子对接，使用加速采样分子动力学模拟确 定底物结合/产物释放过程中的8个关键氨基酸残基，将其进行饱和突变，通过酶活测定以及金属浴100℃加热10min的残余酶活筛选meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶突变体。最 后将这些位点顺序迭代突变以及优势位点组合突变获得高活性和高稳定性的meso‑2,3 ‑丁二醇脱氢酶突变体。

[0024] 更进一步地，所述突变体为Q40K、F51M、E72K、K73T、I162T、H192W、N19 7S、W204Y。

[0025] 其中，Q40K表示：第40位的氨基酸由谷氨酰胺突变为精氨酸；F51M表示：第 51位的氨基酸由苯丙氨酸突变为甲硫氨酸；E72K表示：第72位的氨基酸由谷氨酸突 变为精氨酸；K73T表示：第73位的氨基酸由精氨酸突变为苏氨酸；I162T表示：第1 62位的氨基酸由亮氨酸突变为苏氨酸；H192W表示：第192位的氨基酸由组氨酸突 变为色氨酸；N197S表示：第197位的氨基酸由天冬酰胺突变为丝氨酸；W204Y表示： 第204位的氨基酸由色氨酸突变为酪氨酸。

[0026] 进一步地，所述meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶变体由多点组合突变获得，多点组合突变 形式为以下形式：

[0027] (1)按照第40位，第51位，第72位，第73位，第162位，第192位，第197 位，第204位的排列顺序，依次由相邻的两个或两个以上位点进行顺序迭代突变获得；

[0028] 其中，各突变位点及其突变前后的氨基酸单字母简写分别为：Q40K、F51M、E7 2K、K73T、I162T、H192W、N197S、W204Y；

[0029] 更进一步地，所述谷氨酸脱氢酶变体为以下多点突变中的一种：

[0030] I162T/H192W，I162T/D202E，I162T/H192W/N197S,I162T/H192W/N197S/W204 Y,I162T/H192W/N197S/W204Y/F51M,I162T/H192W/N197S/W204Y/F51M/Q40K；

[0031] 上文中的“/”表示“且，”即“/”前后两个位点同时突变；例如：I162T/H192W表示第 162位亮氨酸突变为苏氨酸，且第192位的氨基酸由组氨酸突变为色氨酸。

[0032] 本发明还提供了一种如上所述的meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶或者如上所述的meso‑2,3 ‑丁二醇脱氢酶突变体的编码基因。

[0033] 本发明还提供了一种包含所述编码基因的重组载体。进一步地，重组载体的原始 表达载体为pET28a‑SUMO。

[0034] 本发明还提供了一种包含所述编码基因的基因工程菌。进一步地，基因工程菌的 宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。

[0035] 本发明还提供了如上所述的meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶或者如上所述的meso‑2,3‑丁 二醇脱氢酶突变体在催化乙偶姻生成meso‑2,3‑丁二醇中的应用。

[0036] 本发明还提供了如上所述的基因工程菌在催化乙偶姻生成meso‑2,3‑丁二醇中的 应用。

[0037] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0038] (1)本发明发现了一种具有耐高温特性的meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶，并以该 meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶为基础，通过加速采样分子动力学模拟方法，动态描述产物释 放过程，解决高稳定性和高活性无法兼顾的问题，获得可以催化制备meso‑2,3‑丁二醇 的突变体，该突变体具有非常好的耐高温特性。在100℃热处理30分钟后，残余酶活 为23.9％。突变体催化乙偶姻形成meso‑2,3‑丁二醇中，活性提高约2‑5倍。反应获得 的产物meso‑2,3‑丁二醇具有极高的光学纯度，为生物转化生产meso‑2,3‑丁二醇提供了广阔的应用前景。

[0039] (2)本发明所使用的理性设计方法能以较小的突变文库、通过筛选快速获得高稳 定性和高活性的meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶突变体。

附图说明

[0040] 图1为纯化的meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶LlBDH在SDS‑PAGE上的电泳分析。

具体实施方式

[0041] 下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施 例，但本发明的保护范围不仅限于此。

[0042] 本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨 姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

[0043] 上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的基因组提取试剂盒、DpnI购自 TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；Exnase II无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生 物科技股份有限公司；质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限 公司；E.coli BL21(DE3)、质粒pET28a‑SUMO等购自Novagen公司；DNA marker、 低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成与 序列测序工作由擎科生物工程股份有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

[0044] 催化反应所用试剂：乙偶姻、meso‑2,3‑丁二醇、NAD+和NADH购自上海麦克林 生化科技有限公司。

[0045] meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶酶活标准检测方法：适量的酶液、12.5mM底物、0.56mM +NAD ，总体系为1000μL，反应介质为甘氨酸‑NaOH缓冲液(20mM，pH 10.0)。20℃ 反应5min，样品中生成/消耗的NADH通过酶标仪进行定量分析。

[0046] 酶活单位(U)的定义：在标准的反应条件下，酶活力单位(U)定义为每分钟消 耗或产生1μmol NADH所需要的酶量。

[0047] 实施例1meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶的克隆、表达、纯化和温度耐受性测定[0048] 一、meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶(简称LlBDH)的克隆

[0049] 从乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中克隆获得meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶基因，并 将该基因插入到pET28a‑SUMO质粒中，再转入E.coli BL21(DE3)中得到pET28a‑SU MO‑LlBDH表达菌株。

[0050] 具体步骤为：

[0051] 1、乳酸乳球菌基因组的提取

[0052] 使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0提取 Lactococcus lactis基因组，操作如下：

[0053] ①用1.5mL离心管收集培养好的Lactococcus lactis菌液，12000rpm离心2min，弃 上清；

[0054] ②加入180μL Buffer GL、20μL的Proteinase K(20mg/mL)和10μL的RNase A(10 mg/mL)充分振荡混匀，于56℃水浴温育10min，此时溶液应呈透明、澄清状；

[0055] ③加入200μL的Buffer GB和200μL的100％乙醇，充分吸打混匀；

[0056] ④将Spin Column安装在Collection Tube上，将处理好的细胞溶解液移至Spin Column 中，12000rpm离心2min，弃滤液；

[0057] ⑤将500μL的Buffer WA加入至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液；

[0058] ⑥将700μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液(Buffer WB使用前需加入指定体积的100％乙醇，确保沿Spin Column管壁四周加入Buffer WB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份)；

[0059] ⑦重复操作步骤⑥；

[0060] ⑧将Spin Column置于Collection Tube上，12000rpm离心2min；

[0061] ⑨将Spin Column置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入35μL65℃左右温热的灭菌ddH2O，室温静置10min，12000rpm离心3min洗脱DNA，如 需获得更大收量，可将离下液重新加入到Spin Column膜的中央，室温静置10min后， 12000rpm离心3min洗脱DNA。

[0062] 2、PCR反应克隆目的片段及线性化载体

[0063] 以NCBI中Lactococcus lactis菌株的基因组(NZ_CP059048)为模板进行引物的 设计。设计的引物如下：

[0064] 表1克隆目的片段及线性化载体所用引物

[0065]

[0066] 引物由北京擎科生物科技有限公司有限公司合成。

[0067] PCR反应体系1

[0068]

[0069]

[0070] PCR反应体系2

[0071]

[0072] PCR反应条件：

[0073]

[0074] PCR产物的回收：

[0075] 用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收PCR扩增产物，用于后续实验。具 体操作如下：

[0076] ①PCR产物经电泳分离后，在紫外灯下用干净的刀片从琼脂糖凝胶中切割下含目的 DNA片段的琼脂糖凝胶块，放入1.5mL离心管中，称重。注意尽可能多地去掉不含 目标DNA的琼脂糖，每管琼脂糖凝胶块不要超过400mg，同时尽量减少DNA在紫 外灯下曝光时间；

[0077] ②根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖加300‑600μL的比例加入Buffer B2；

[0078] ③将离心管置于50℃水浴5‑10min，间或混匀，直至凝胶完全溶化；

[0079] ④将溶化好的溶液全部转移入吸附柱，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体， 将吸附柱放入同一个收集管中；

[0080] ⑤向吸附柱中加入300μL Buffer B2，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体， 将吸附柱放入同一个收集管中；

[0081] ⑥向吸附柱中加入500μL Wash Solution，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液 体，将吸附柱放入同一个收集管中；

[0082] ⑦重复步骤⑥一次；

[0083] ⑧将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，清除柱子中残留乙醇；

[0084] ⑨弃收集管，将吸附柱放入新的1.5mL离心管，在吸附膜中央加入30μL温热的 ddH2O，室温静置10min，12000rpm离心3min，将所得到的DNA溶液置于‑20℃保 存用于后续实验。

[0085] 3、目的基因插入线性化的pET28a‑SUMO载体

[0086] 反应结束后，取5μL样品，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用电泳比较条带亮度 的方法对DNA进行定量。克隆载体使用量为0.03pmol，最适插入片段使用量为0.06 pmol。

[0087] 重组反应体系如下：

[0088]

[0089] ①使用移液器轻轻吸打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心将反应液收集至管底。37℃反 应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。

[0090] ②在冰上解冻克隆感受态细胞。

[0091] ③取10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上 静置30min。

[0092] ④42℃水浴热激90c后，立即置于冰上冷却2‑3min。

[0093] ⑤加入500μl LB培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200rpm)。

[0094] ⑥5000rpm离心5min，弃掉300μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒 在含有卡那霉素抗性的平板上轻轻涂匀。

[0095] ⑦37℃培养箱中倒置培养12‑16h。

[0096] 二、meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶的表达和纯化

[0097] 醇脱氢酶LlBDH的纯化操作过程为:

[0098] (1)含醇脱氢酶LlBDH的pET28a‑SUMO‑LlBDH表达菌株破碎后，将上清转移 到预冷的离心管中并冰浴待用；整个纯化过程的液体流速保持在1mL/min；将预装柱 用含3mM咪唑的Tris‑HCl缓冲液(20mM，pH＝8.0)以十倍柱体积平衡镍柱。

[0099] (2)上清液流过镍柱，此过程含有His标签的目的酶和部分杂蛋白会与镍特异性 结合。

[0100] (3)用十倍柱体积的含20mM咪唑Tris‑HCl缓冲液(20mM，pH＝8.0)溶液清 洗镍柱中的蛋白。

[0101] (4)用500mM咪唑Tris‑HCl缓冲液(20mM，pH＝8.0)洗脱镍柱，将蛋白洗收 集。

[0102] 纯化后的meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶用ULP1蛋白酶去除SUMO‑Tag，ULP1蛋白酶 具有很高的特异性，且在较宽范围的反应环境体系中保持较高的活力，为保证酶的活 性，在4℃下进行酶切。最终得到野生型meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶的纯酶液，纯化的结 果如图1所示，单体His6‑SUMO‑LlBDH蛋白的分子量为40.61kDa蛋白被ULP1蛋白 酶切割后，ULP1蛋白酶、His6‑SUMO标签(表观分子量13kDa)和未切割的蛋白质 留在亲和层析柱中。切割后的LlBDH蛋白的分子量为26.83kDa。SDS‑PAGE分析显 示蛋白质被成功纯化至95％以上的均一性(图1)。

[0103] 三、meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶的温度耐受性

[0104] LlBDH温度耐受性测定方法如下：

[0105] 将纯酶和酶活检测体系的各成分孵育在100℃金属浴中2、5、10、20、30、40、 50、60min。检测体系为:适量的酶液(本实施例步骤二获得的野生型meso‑2,3‑丁二 醇脱氢酶+
的纯酶液)、12.5mM meso‑2,3‑丁二醇、0.56mM NAD ，总体系为1000μL， 反应介质为甘氨酸‑NaOH缓冲液(20mM，pH 10.0)。未热处理时的酶活定义为100％。 最终发现该酶在100℃加热30min仍保留23.9％的活性(表1)。

[0106] 表1 meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶的100℃耐受性测定

[0107]

[0108] 实施例2基于产物释放过程的突变位点设计

[0109] 高斯加速分子动力学(GaMD)是一种无约束增强采样方法。使用LiGaMD以纳 秒时间尺度，模拟捕获小分子配体与酶重复解离和结合的过程。分子动力学模拟操作 均应用+Amber20软件进行。蛋白质使用ff19SB力场，NAD和NADH辅因子使用 Holmberg等人构建的力场。添加显式的OPC水分子，蛋白距盒子边缘为 然后 用0.15M NaCl的离子浓度进行电中和。能量最小化共分为三个阶段。第一阶段仅最 小化溶剂分子和离子的位置；第二阶段最小化氢原子；第三阶段不受约束地最小化模 拟体系内的所有原子。每一阶段的最小化包括2500步最速下降步骤和2500步共轭梯 度步骤。然后，恒定体积和使用周期边界条件，将温度从0增加到300K，对系统进 行温和加热。 的力常数应用在蛋白质和
小分子上，并采用Langevin thermostat方法控制温度。使用PME方法对远程静电作用进行建模。Lennard‑Jones和 静电相互作用采用 截止值。涉及到氢原子的键长使用SHAKE算法进行限制。随 后在恒定压力1atm和温度300K下，运行NPT‑MD 400ps，时间步长为2fs。运行3.0 ns的初始短的传统分子动力学模拟以计算GaMD加速参数，然后运行60ns的 GaMD平衡模拟。10个未结合底物/产物分子的meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶上执行三个独 立的100ns GaMD生产模拟，初始原子速度随机。所有GaMD模拟都在“dual‑boost” 水平下运行。一个升压势应用于二面角能量项，另一个应用于总势能项。对于所有模拟系统，每300 000步(0.6ns)计算一次系统势能的平均值和标准差。对于二面角和 总势能项，升压势标准差的上限δ0均设置为6.0kcal/mol，每1.0ps保存一帧轨迹 以供分析。使用MM/GBSA方法对0～
80ns范围内的每帧进行残基自由能分解，分解 过程由四个能量项组成：ΔGbind＝ΔEvdw+ΔEele+ΔGpol+ΔGnopol，ΔEvdw表示非键范德 华相互作用，ΔEvdw表示静电相互作用，ΔGpol和ΔGnopol分别表示极性和非极性相互作 用，它们构成了溶剂化自由能。输入文件中igb设置为
5，其他参数均为默认值。

[0110] 目视观察产物释放轨迹，发现H192‑D202之间的氢键首先断开，产物从酶催化口 袋释放，据此我们确定了H192和D202两个潜在的突变位点。分析产物释放过程中每个氨基酸残基的能量贡献，发现W204、N197、Q40、F51、E72、K73位点；另外根 据稳定多聚体界面提高酶活的策略，将I162突变为苏氨酸，在二聚体结合界面引入了 新的氢键。

[0111] 实施例3单点饱和突变的构建

[0112] 对LlBDH进行单点饱和突变。具体方法如下：

[0113] 1、全质粒PCR

[0114] 以pET28a‑SUMO‑LlBDH质粒为模版，设计覆盖突变点的上下游引物(表1)进 行全质粒PCR:

[0115] 表2单点突变库构建所用引物

[0116]

[0117] PCR扩增体系：

[0118]

[0119] PCR扩增条件：

[0120] 1)预变性：95℃5min；

[0121] 2)变性：98℃10s；退火：60℃15s；延伸：72℃10s；共循环30次；

[0122] 3)后延伸：72℃10min；

[0123] 4)4℃保存。

[0124] 2、模板消化：

[0125] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收后用DpnI酶消化其中的质粒模板消化体 系为：DpnI酶1μL，PCR产物45μL，Buffer 4μL。37℃下1小时可完成模板的消化。

[0126] 3、转化及验证：

[0127] 消化后产物经核酸琼脂糖凝胶电泳验证后，采用42℃热激法转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞。具体过程如下：

[0128] (1)将感受态细胞放置在冰上解冻5min；

[0129] (2)在无菌环境下将10μL DNA加入100μL感受态细胞中并轻轻混匀，冰上放 置30min；

[0130] (3)EP管静置于42℃金属浴中热激90s，结束后置于冰上冷却2min；

[0131] (4)向EP管中加入500μL LB培养基并用枪头混匀，置于220rpm摇床中37℃ 孵育60min；

[0132] (5)浓缩后取适量体积涂相应的抗性平板，于37℃培养箱中培养12‑16h后可出 现菌落。每块平板挑出3～4个单菌落进行培养，并测序验证突变是否成功。

[0133] 4、突变菌株培养及蛋白表达

[0134] 将测序成功的突变株经平板划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的 5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％的接种量转接至200mL同样含 50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.6～0.8左右时， 加入IPTG至其终浓度为0.5mM，37℃下诱导培养6h。

[0135] 培养结束后，将培养液4000g 4℃离心15min，弃上清，收集菌体。将收集到的 菌体，用20mM pH 8.0的Tris‑HCl缓冲液洗涤两次后，重悬于Tris‑HCl缓冲液中， 400W功率超声破碎30次，每次超声持续3s，间歇7s。将此细胞破碎液12000g 4℃ 离心30min去除沉淀，得到的上清为粗酶液。

[0136] 5、酶活测定

[0137] 用酶标仪测定上述突变体对底物乙偶姻的酶活，测定结果见表3：

[0138] 表3 meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶的酶活测定

[0139]

[0140]

[0141] 实施例4基于产物释放路径的顺序迭代突变库的构建与活性测定

[0142] 基于产物释放路径的顺序，对162，192，202，197共4个氨基酸残基位点进行顺 序迭代突变，具体地，设计以下突变体：

[0143] 1X：I162T

[0144] 2X‑1：I162T/H192W；

[0145] 2X‑2：I162T/D202E；

[0146] 3X：I162T/H192W/N197S；

[0147] 具体实验步骤如下：

[0148] 以pET28a‑SUMO‑LlBDH‑I162T质粒为模版，设计覆盖突变点的上下游引物(表 3)，进行全质粒PCR获得突变体2X‑1和2X‑2，然后以2X‑1为模板，以N197S_F和 N197S_R为上下游引物进行全质粒PCR获得突变体3X，所用引物见表4，详细PCR 操作、化转、菌株培养及蛋白表达步骤与实施例1相同。

[0149] 表4多点组合突变构建所用引物

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[0151] 用酶标仪测定上述突变体对天然底物meso‑2,3‑丁二醇的酶活，测定结果见表5。

[0152] 表5多点组合的meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶的酶活测定

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