一种ATP敏感K+通道调节物及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种ATP敏感K+通道调节物及制备方法和应用，属于重要技术领域。本申请提供了一种ATP敏感K+通道调节物，通过服用ATP敏感K+通道调节物能够明显抑制咳嗽，尤其是慢性咳嗽，还具有一定的降低肺部炎性细胞浸润的作用，本发明产品为中药天然活性萃取液，止咳作用显著，副作用小，药物开发潜力较大。

权利要求

1.一种鬼点灯活性萃取物，其特征在于，由以下工艺制备而成：

1）将鬼点灯进行清洗、粉碎，按鬼点灯8‑12倍质量加入有机溶剂，恒温回流2‑4次，每次

1‑2.5h，得有机溶剂提取液；所述有机溶剂为甲醇、75%乙醇或95%乙醇；且恒温回流温度为

80℃；

2）将有机溶剂提取液浓缩，恒温65℃，真空旋转蒸发至回收瓶无液体流入，得浓缩物；

3）在所述浓缩物中，加入其6‑10倍重量的蒸馏水，混悬后，加入1‑3倍体积的石油醚萃取2‑4次，合并石油醚萃取液，所得的水层用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂后，得到鬼点灯活性萃取物，所述混悬为超声混悬；所述回收溶剂为减压回收；

+

所述鬼点灯活性萃取物通过调节ATP敏感K通道治疗咳嗽、降低肺部炎性细胞浸润。

2.权利要求1所述的鬼点灯活性萃取物在制备治疗咳嗽、降低肺部炎性细胞浸润制剂中的应用，其中，所述咳嗽为慢性咳嗽。

说明书

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一种ATP敏感K 通道调节物及制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于中药技术领域，具体涉及一种ATP敏感K+通道调节物及制备方法和应用。

背景技术

[0002] 咳嗽是临床较为常见的疾病之一，许多疾病都会伴有咳嗽，虽然可以通过一些药物控制咳嗽，但是仍存在较多不乐观情况。慢性咳嗽更是一种常见又非常棘手的问题，严重影响患者的生活质量。据统计20％至46％的患者咳嗽原因不明，且对出院治疗无效。一项针对欧洲29个不同国家的调查显示70％的咳嗽患者医嘱均未完全治愈或者57％患者药物治疗效果有限，仅7％患者药物治疗有效，因此咳嗽的药物治疗有待进一步研究发展，争取最大化减轻患者痛苦。作为治疗慢性咳嗽的可靠靶点ATP(三磷酸腺苷)，普遍存在于细胞内，在细胞代谢和能量学中起着重要作用，生理和病理生理条件下从细胞中释放出来。 Mengru Zhang等从ATP与P2受体、ATP与TRPV1及TRPV4三个方面综述了ATP在慢性咳嗽病因学中的作用，发现ATP在气道炎症过程中被释放到细胞外空间，与相应的P2受体结合，介导咳嗽反射，参与咳嗽过敏症的形成，其潜在机制可能与TRPV4介导的Aδ传入迷走神经纤维的激活有关。陈晓芳利用豚鼠注射拮抗剂格列本脲的方法证明枇杷花醇提物止咳作用机制与ATP敏感K+通道有关。宋苏、丘琴等同样通过上述豚鼠实验证明研究药物止咳作用是否与ATP敏感K+通道有关。我国中医药技术传承与发展历史悠久，在咳嗽尤其是慢性咳嗽方面具有一定的优势，值得深入挖掘。

[0003] 鬼点灯[B.Tenellum(Hornem.)Fisch.Et Mey]又名细叠子草，雀灵草，小马耳朵，为紫草科植物柔弱斑种草的全草，以全草入药，味微苦、涩，性平，有小毒，归肺经，具有止咳、止血的功效。民间应用历史悠久，疗效确切。走访收集资料期间发现有许多民老中医在临床治疗中给予应用，且疗效显著，还有一些有经验的老人也会经常自己采摘用作不时之需。《民间常用草药汇编》、《中药大辞典》及《中华本草》均有明确记载：“止咳，炒焦治吐血”。然而，对于鬼点灯的现代研究即止咳作用的活性成分及机制研究却迟迟未曾开展，实属遗憾。故其研究意义深远，前景广阔，值得研究。

[0004] 另外，江苏省扬州市以及关中等多地区进行麦田杂草危害调查，结果显示均具有鬼点灯，其本身并无大害且具有一定的药用价值，却被视为杂草危害农田，严重颠覆了鬼点灯的药用价值。鬼点灯作为《民间常用草药汇编》及《中华本草》收录药材，如今却沦落为杂草行列，有失其用途。如果可以尽快将鬼点灯止咳作用活性部位制备成相关药物，明确机理，确定其药效，实现其价值，不仅能够变杂草为宝，减轻农业负担，降低过度使用农药带来的环境污染，还可以扩充中草药药库资源，为临床用药提供科学依据，一举多得，意义深远。根据以上麦田杂草危害调查可以判断鬼点灯的数量巨大，在农田除杂过程中也是相当困难的，过度使用除草剂不仅对麦田本身有很大伤害，对于环境污染也是具有很大程度的增加，问题十分严峻。本专利涉及内容不但可以解决“杂草问题”，利于环境保护，还能带动地方经济发展，为临床提供大量更加廉价且作用效果显著的中药材。

[0005] 因此，如何提供一种ATP敏感K+通道调节物及制备方法和应用是本领域亟待解决的问题。

发明内容

[0006] 本发明公开了一种ATP敏感K+通道调节物及制备方法和应用。

[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一种ATP敏感K+通道调节物，所述调节物为鬼点灯；

[0009] 优选的，所述鬼点灯为鬼点灯提取物；

[0010] 更优选的，所述鬼点灯提取物为水提物或有机溶提取物；

[0011] 一种ATP敏感K+通道调节剂的制备方法，提取步骤为：

[0012] 将鬼点灯进行清洗、粉碎，按鬼点灯8‑12倍质量加入有机溶剂，恒温回流 2‑次小时，每次1‑2.5小时，得有机溶剂提取液；

[0013] 优选的，还包括浓缩步骤：将有机溶剂提取液浓缩，恒温65℃，真空旋转蒸发至回收瓶无液体流入，得浓缩物；

[0014] 优选的，所述有机溶剂为甲醇、75％乙醇或95％乙醇；

[0015] 优选的，所述按鬼点灯10倍质量加入有机溶剂；

[0016] 优选的，恒温回流温度为80℃；

[0017] 如上所述的ATP敏感K+通道调节剂的制备方法，还包括萃取方法，步骤为：

[0018] 在所述有机溶剂提取液或浓缩物中，加入其6‑10倍重量的蒸馏水，混悬后，加入1‑3倍体积的石油醚萃取2‑4次，合并石油醚萃取液，所得的水层用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取
3次，回收溶剂后，鬼点灯活性萃取物；

[0019] 优选的，所述混悬为超声混悬；

[0020] 优选的，所述回收溶剂为减压回收；

[0021] 如上所述的通道调节物、制备方法在制备治疗咳嗽、降低肺部炎性细胞浸润制剂中的应用；

[0022] 优选的，所述咳嗽为慢性咳嗽；

[0023] 一种组合物，包括如上所述的ATP敏感K+通道调节物；

[0024] 一种试剂盒，所述试剂盒包括上述制备方法中制剂的一种或多种；

[0025] 如上所述的试剂盒在制备治疗咳嗽、降低肺部炎性细胞浸润制剂中的应用；

[0026] 优选的，所述咳嗽为慢性咳嗽。

[0027] 综上所述，本发明公开了一种ATP敏感K+通道调节物及制备方法和应用，本申请提供了一种TP敏感K+通道调节物，通过服用敏感K+通道调节物能够明显抑制咳嗽，尤其是慢性咳嗽，还具有一定的降低肺部炎性细胞浸润的作用，本发明产品为中药天然活性萃取液，止咳作用显著，副作用小，药物开发潜力较大。

[0028] 本发明产品可用于制备治疗慢性咳嗽的药物，是中药鬼点灯止咳作用的活性部位萃取液，为慢性咳嗽药物的研制提供天然萃取原料物质是其主要解决的技术问题。本发明产品作用于ATP敏感K+通道发挥止咳作用，是目前国内外研究治疗慢性咳嗽和不明原因咳嗽颇具潜力的TRPV4‑ATP‑P2X3通路的重要组成部分，另外，该产品还具有一定的降低肺部炎性细胞浸润的作用。本发明产品为中药天然活性萃取液，止咳作用显著，副作用小，药物开发潜力较大。

附图说明

[0029] 图1为小鼠肺部组织炎性细胞浸润情况，框标区域为炎性细胞浸润，1为细支气管，2为肺泡，3为小动脉，4为肺泡；

[0030] 图2为炎性细胞浸润放大图。

具体实施方式

[0031] 下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0032] 实施例1

[0033] 1活性萃取液的制备

[0034] 提取：取鬼点灯的干燥全草，剪断，段长约1‑3cm，过1号筛去掉泥土残渣，按每千克药材加入8‑12倍量的95％乙醇提取溶剂，恒温回流提取2‑4次，每次 1‑2.5小时，得95％乙醇溶剂提取液；合并提取液，减压浓缩，得浓缩物。

[0035] 萃取：加浓缩物重量6‑10倍的蒸馏水混悬，超声振荡器助悬，得混悬液，加入混悬液1‑3倍体积的石油醚萃取2‑4次，合并石油醚萃取液；所得水层用1‑3 倍体积的乙酸乙酯萃取2‑4次，减压回收溶剂，得到石油醚和乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物即为鬼点灯活性萃取物(EAE)。

[0036] 具体为：

[0037] 方法①：

[0038] 提取：取鬼点灯的干燥全草，剪断，段长约1‑3cm，过1号筛去掉泥土残渣，按每千克药材加入8‑12倍量的75％乙醇提取溶剂，恒温回流提取2‑4次，每次 1‑2.5小时，得75％乙醇溶剂提取液；合并提取液，减压浓缩，得浓缩物。

[0039] 萃取：加浓缩物重量6‑10倍的蒸馏水混悬，超声振荡器助悬，得混悬液，加入混悬液1‑3倍体积的石油醚萃取2‑4次，合并石油醚萃取液；所得水层用1‑3 倍体积的乙酸乙酯萃取2‑4次，减压回收溶剂，得到石油醚和乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物即为鬼点灯活性提取物。

[0040] 方法②：

[0041] 提取：取鬼点灯的干燥全草，剪断，段长约1‑3cm，过1号筛去掉泥土残渣，按每千克药材加入8‑12倍量的95％乙醇提取溶剂，恒温回流提取2‑4次，每次 1‑2.5小时，得95％乙醇溶剂提取液；合并提取液，减压浓缩，得浓缩物。

[0042] 萃取：加浓缩物重量6‑10倍的蒸馏水混悬，超声振荡器助悬，得混悬液，加入混悬液1‑3倍体积的石油醚萃取2‑4次，合并石油醚萃取液；所得水层用1‑3 倍体积的乙酸乙酯萃取2‑4次，减压回收溶剂，得到石油醚和乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物即为鬼点灯活性提取物。

[0043] 方法③：

[0044] 提取：取鬼点灯的干燥全草，剪断，段长约1‑3cm，过1号筛去掉泥土残渣，按每千克药材加入8‑12倍量的甲醇提取溶剂，恒温回流提取2‑4次，每次1‑2.5 小时，得甲醇溶剂提取液；合并提取液，减压浓缩，得浓缩物。

[0045] 萃取：加浓缩物重量6‑10倍的蒸馏水混悬，超声振荡器助悬，得混悬液，加入混悬液1‑3倍体积的石油醚萃取2‑4次，合并石油醚萃取液；所得水层用1‑3 倍体积的乙酸乙酯萃取2‑4次，减压回收溶剂，得到石油醚和乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物即为鬼点灯活性提取物。

[0046] 2供试品溶液的配备

[0047] (1)辣椒素配置：将30.5mg辣椒素溶解于1ml的吐温80液和1ml的无水乙醇中，再溶于8ml生理盐水中，配置成为10mmol/L原液，分装后存放于‑20℃，使用时取60ul原液加20ml生理盐水配制成30μmol/L溶液。(2)咳必清药液配置：取20mg咳必清，超声助溶于10ml生理盐水，形成均匀混悬液。(3)EAE 溶液配置：称取1.5g乙酸乙酯部加生理盐水10ml，超声助溶，混匀成悬液。(4) 格列本脲试剂配置：称取40mg格列本脲溶于10ml生理盐水中，超声悬液均匀，等。

[0048] 3药效实验方法

[0049] 小鼠适应性饲养1w后放入特制容器中，30μmol/L辣椒素用超声雾化器以 1ml/min的速度通入容器，雾化2min，记录5min内咳嗽次数，取咳嗽次数大于 8次、小于35次的小鼠50只，平均分5组(SPSS软件给予给药前各组小鼠咳嗽次数比较，P>0.05差异无统计学意义，即各组小鼠给药前质量平均分配合理)。 A组为空白组，灌胃4ml/kg生理盐水；B组为格列本脲组，腹腔注射20mg/kg 的格列本脲；C组为咳必清对照组，灌胃50mg/kg咳必清；D组为EAE实验组，灌胃1.5g/kg的乙酸乙酯部萃取物；E组为格列本脲+EAE组，腹腔注射20mg/kg 格列本脲+灌胃1.5g/kg EAE。连续给药3d，末次给药禁食不禁水12h。A组灌胃生理盐水1h后雾化记录5min内咳嗽次数；B组按腹腔注射格列本脲15min 后雾化记录5min内咳嗽次数；C组灌胃咳必清药液1h后雾化记录5min内咳嗽次数；D组灌胃EAE 1h后雾化记录5min内咳嗽次数；
E组灌胃EAE 45min后腹腔注射格列本脲，15min后雾化记录5min内咳嗽次数，记录完成后将小鼠处死取肺组织。

[0050] 抑咳率＝(给药前小鼠咳嗽次数－给药后小鼠咳嗽次数)/给药前小鼠咳嗽次数×100％

[0051] 4石蜡切片制备

[0052] 取材：取上述小鼠肺部组织。固定：将肺组织放入固定液中，用脱脂棉球将其压入液面以下，固定至肺组织沉入底部。脱水：①蒸馏水冲洗3次，每次 20min；②水洗后组织于5ml离心管内50％乙醇脱水1h‑3h；③75％乙醇脱水1h‑2 h或过夜；④80％乙醇脱水1h‑2h；
⑤90％乙醇脱水1h；⑥95％乙醇脱水0.5h 或者过夜；⑦无水乙醇脱水20min，继续换无水乙醇脱水(依据含水量多少，脱水20‑60min)；⑧无水乙醇+二甲苯1:15min(进行过渡，以防脱水不彻底，加入二甲苯直接浑浊)。透明：①二甲苯Ⅰ透明2min；②二甲苯Ⅱ透明2min。浸蜡：
①蜡缸Ⅰ2h；②蜡缸Ⅱ2h。组织包埋：先准备好包埋模具，将熔蜡倒入模具内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在模具底部，切面朝下，再轻轻提起模具，平放在冰冻台中，待其迅速冷却凝固10min后取出。切片：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。切片完毕，应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。展片：首先将切片分割开，投入到42℃的温水浴中，这时切片都浮在水面上，由于表面张力的作用使切片自然展平，将粘附性载玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置。60℃拷片30min以上。脱蜡及复水：二甲苯20min；二甲苯20min；100％乙醇5min；100％乙醇5min；95％乙醇5min；95％乙醇
5min； 70％乙醇5min

[0053] 5HE染色

[0054] (1)蒸馏水冲洗切片；(2)滴加苏木素染色，根据组织情况及染料情况控制染色时间(一般1min左右，随苏木素放置时间变长，苏木素染色效果会增强，时间应适当减短)；(3)蒸馏水洗至组织呈蓝紫色；(4)滴加1％盐酸乙醇分化2s，待组织变红；(5)蒸馏水洗至组织呈蓝紫色；(6)伊红染色，根据组织染色情况控制染色时间(一般2s～8s左右)；(7)蒸馏水冲洗切片；(8) 无水乙醇脱水；(9)滴加中性树胶，封片；(10)镜下观察拍照。

[0055] 6结果

[0056] 结果如表1所示：D组(EAE组，即发明产品组)的抑咳率为61.13％，与咳必清组比较无明显差异，即本发明产品具有明显的止咳作用。另外EAE与格列本脲同用时止咳作用被抑制而有所降低，因此可以判断EAE止咳作用是通过开放ATP敏感K+通道而发挥的(格列本脲本身对咳嗽没有影响，但是它可以抑制ATP敏感K+通道开放剂的作用)。

[0057] 肺部组织HE染色结果如图1所示：EAE具有一定的降低肺部组织炎性细胞浸润作用。A组可见大量炎性细胞浸润，给药后炎性细胞浸润减少，其中C 组炎性细胞浸润最少，其次是E组、D组和B组。图2为炎性细胞浸润不同比例放大图。

[0058] 表1各组小鼠咳嗽次数表

[0059]

[0060] 组内给药前后咳嗽次数比较：*P<0.05，**P<0.01；给药后咳嗽次数与A组比较：#P<## ▲ ▲▲0.05，P<0.01；抑咳率与A组比较：P<0.05， P<0.01。

[0061] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

[0062] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。