一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料合成和应用转让专利
申请号 : CN202210145256.6
文献号 : CN114716431B
文献日 : 2022-11-11
发明人 : 杜池敏 , 杜舒然
申请人 : 北京富百科生物技术有限公司
摘要 :
本发明涉及荧光染料领域，提出了一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料，具有如下结构式：通过上述技术方案，解决了现有技术中的荧光染料检测DNA时易受到溶液中其他带电物质的干扰、不能同时应用于蓝光仪和紫外凝胶成像仪的问题。
权利要求 :
1.一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料，其特征在于，具有如下结构式：。
2.根据权利要求1所述的一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料的应用，其特征在于，所述荧光染料用于聚合酶链式反应、核酸凝胶电泳染料、织物印染以及生物大分子染色。
3.根据权利要求1所述的一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料的合成，其特征在于，包括以下步骤：S1、在氮气保护下，式1的化合物与碘甲烷在210℃下反应4小时，制备式3的化合物；
S2、在氮气保护下，式4的化合物与6‑溴‑1‑己酸溶于无水乙醇中，在氮气保护下加热至
35℃反应4小时，制备式6的化合物；
S3、将式3的化合物和式6的化合物溶于乙醇中，在氮气保护下加入三乙胺，反应3小时，制备式7的化合物；
S4、将式7的化合物和2‑琥珀酰亚胺基‑1,1,3,3‑四甲基脲四氟硼酸酯溶于乙腈中，加入三乙胺，反应4小时，得到式8的化合物的乙腈溶液；
S5、将式9的化合物溶于DMF中，加入2‑琥珀酰亚胺基‑1,1,3,3‑四甲基脲四氟硼酸酯，搅拌30分钟后，加入三乙醇胺，在20‑25℃下反应30min，加入乙二胺，反应12‑16小时，制备式11的化合物；
S6、将式11的化合物溶于DMF中，加入式8的化合物的乙腈溶液，反应12‑16小时，得到一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料。
说明书 :
一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料合成和应用
技术领域
[0001] 本发明属于荧光染料领域，涉及一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料合成和应用。
背景技术
[0002] 荧光染料是指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光光波的物质，在吸收可见光和紫外光转变为波长较长的可见光波而反射出来，是一种广泛使用的荧光标示剂，又称为荧光探针，具有检测速度快、重复性好、用样量少、无辐射等优点，可用于检测DNA、蛋白质、酶、金属离子等等。
[0003] 在荧光染料用于检测DNA时，主要是利用底物与荧光染料之间的静电相互作用力而与荧光染料之间形成复合物。但是，应用静电相互作用力检测DNA有一个缺点，就是容易受到溶液中其他带电物质的干扰，不能同时应用于蓝光仪和紫外凝胶成像仪。
发明内容
[0004] 本发明提出一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料合成和应用，解决了现有技术中的荧光染料检测DNA时易受到溶液中其他带电物质的干扰、不能同时应用于蓝光仪和紫外凝胶成像仪的问题。
[0005] 本发明的技术方案是这样实现的：
[0006] 一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料，具有如下结构式：
[0007]
[0008] 上述荧光染料应用，所述荧光染料用于聚合酶链式反应、核酸凝胶电泳染料、织物印染、蛋白质以及生物大分子染色。
[0009] 上述荧光染料的合成，包括以下步骤：
[0010] S1、在氮气保护下，式1的化合物与碘甲烷在210℃下反应4小时，制备式3的化合物；
[0011]
[0012] S2、在氮气保护下，式4的化合物与6‑溴‑1‑己酸溶于无水乙醇中，在氮气保护下加热至35℃反应4小时，制备式6的化合物；
[0013]
[0014] S3、将式3的化合物和式6的化合物溶于乙醇中，在氮气保护下加入三乙胺，反应3小时，制备式7的化合物；
[0015]
[0016] S4、将式7的化合物和2‑琥珀酰亚胺基‑1,1,3,3‑四甲基脲四氟硼酸酯溶于乙腈中，加入三乙胺，反应4小时，得到式8的化合物的乙腈溶液；
[0017]
[0018] S5、将式9的化合物溶于DMF中，加入2‑琥珀酰亚胺基‑1,1,3,3‑四甲基脲四氟硼酸酯，搅拌30分钟后，加入三乙醇胺，在20‑25℃下反应30min，加入乙二胺，反应12‑16小时，制备式11的化合物；
[0019]
[0020] S6、将式11的化合物溶于DMF中，加入式8的化合物的乙腈溶液，反应12‑16小时，得到一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料。
[0021] 本发明的工作原理及有益效果为：
[0022] 1、本发明中，提出了一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料，该荧光染料在检测DNA时，不受溶液中其他带电物质的干扰，克服了现有技术中的荧光染料应用静电相互作用力检测时的缺点，显著提高了荧光染料辨别单双链DNA分子的能力以及检测DNA的灵敏度，并实现了同时应用于蓝光仪和紫外凝胶成像仪下核酸电泳染色。
[0023] 2.本发明中，菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料性能稳定，适合定量PCR同时适合蓝光仪和紫外凝胶成像仪下核酸电泳染色，可用于聚合酶链式反应、核酸凝胶电泳染料、织物印染、蛋白质以及生物大分子染色。
[0024] 3.本发明中，以菲啶类化合物和苯并噻唑类化合物为原料，经过一系列的反应，制得菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料，产物纯度高，性能稳定。
附图说明
[0025] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
[0026] 图1为本发明荧光染料SafeStain的核磁共振氢谱图；
[0027] 图2为本发明荧光染料SafeStain的质谱图；
[0028] 图3为本发明化合物7的核磁共振氢谱；
[0029] 图4为本发明化合物7的质谱图；
[0030] 图5为本发明化合物9的核磁共振氢谱图；
[0031] 图6为本发明化合物9的质谱图；
[0032] 图7为本发明化合物11的核磁共振氢谱图；
[0033] 图8为本发明化合物11的质谱图；
[0034] 图9为本发明荧光染料SafeStain的HPLC图；
[0035] 图10为本发明荧光染料SafeStain的实时荧光定量PCR扩增曲线电泳图；
[0036] 图11为本发明荧光染料SafeStain在紫外透视仪和蓝光凝胶成像仪下的电泳图，图中A图为在紫外透视仪下的电泳图，图B为在蓝光凝胶成像仪下的电泳图。
具体实施方式
[0037] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
[0038] 实施例1
[0039] 一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料，具有如下结构式：
[0040]
[0041] 其核磁共振氢谱如图1所示，测试条件为：1H NMR(400MHz，d6‑DMSO)；
[0042] 质谱如图2所示，ESI‑MS：实验值m/z＝831.6。
[0043] 实施例2
[0044] 实施例1的荧光染料的制备方法，包括以下步骤：
[0045] S1、化合物3的合成：
[0046] 将54.5g化合物1和112g碘甲烷(化合物2)加入到500mL的三口瓶中，氮气保护，加热至210℃反应4小时，TLC检测反应完全；将反应液冷却至室温后，向反应液中加入甲醇，搅拌打浆，过滤，滤饼用甲醇洗涤，得90g白色固体，即为化合物3，收率为91.8％；反应式如下：
[0047]
[0048] S2、化合物6的合成：
[0049] 将30g化合物4和50g 6‑溴‑1‑己酸(化合物5)加入到250mL三口瓶中，氮气保护，加热至35℃反应4小时，TLC检测反应结束；将反应液冷却至室温后，向反应液中加入乙醇，搅拌打浆，过滤，滤饼用丙烯酸乙酯洗涤，得到浅黄色固体，将得到的浅黄色固体用乙醇打浆，过滤，得55g白色粉末，即为化合物6，收率为90.5％；反应式如下：
[0050]
[0051] S3、化合物7的合成：
[0052] 将30g化合物3和36g化合物6溶于400mL无水乙醇中，氮气保护，在室温下缓慢滴加19mL三乙胺，反应液先变黑，后逐渐变红，将反应液搅拌3小时后，在室温下加入1L水，之后继续搅拌1小时处理反应，然后将反应液过滤，滤饼用100mL甲醇打浆，过滤，将滤饼真空干燥，得28g化合物7，收率77.8％；
[0053] 反应式如下：
[0054]
[0055] 化合物7的核磁共振氢谱如图3所示，测试条件为1H NMR(400MHz，d6‑DMSO)；
[0056] 化合物7的质谱图如图4所示，ESI‑MS：实验值m/z＝405.1。
[0057] S4、化合物8的合成：
[0058] 将25g化合物7和15g 2‑琥珀酰亚胺基‑1,1,3,3‑四甲基脲四氟硼酸酯(简写为TSTU)加入到625mL无水乙腈中，室温下滴加12.5mL三乙胺，滴毕后，在室温下反应4小时，TLC检测反应结束，得化合物8的乙腈溶液，反应式如下：
[0059]
[0060] S5、化合物11的合成：
[0061] 将15g化合物9溶于150mL DMF中，在小于20℃的条件下分三次加入TSTU，三次中每次TSTU的加入量分别为5g、5g和4g，搅拌30min，再滴加9.6g三乙醇胺，控制温度在20℃‑25℃，搅拌30min后，TLC检测(二氯甲烷/甲醇＝5:1，体积比)反应完全，在20‑25℃下，缓慢滴加1.2g乙二胺，2h滴加完毕，反应12小时，TLC检测(二氯甲烷/甲醇＝10:1，体积比)反应完全，用二氯甲烷与甲醇体积比为5:1的混合液过硅胶柱，得到14.5g红色固体，即为化合物11，收率92％；反应式如下：
[0062]
[0063] 化合物11的核磁共振氢谱如图7所示，测试条件为1H NMR(400MHz，d6‑DMSO)；
[0064] 化合物11的质谱图如图8所示，ESI‑MS：实验值m/z＝443.1；
[0065] 其中，化合物9按照文献Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,Volume 17,Issue 8,15April 2007,Pages 2267‑2273中的方法进行，反应收率为87％，化合物9的核磁1
共振氢谱如图5所示：(H NMR，d6‑DMSO)δ(ppm)8.53‑8.61(dd,2H),7.75(m,3H),7.54‑7.59(m,3H),7.35(m,2H),6.45(s,1H),4.49‑4.51(m,2H),2.18‑2.21(m,2H),1.52‑1.21(m,6H)+
化合物9的质谱数据如图6所示：ESI‑MS：实验值m/z＝400.17,found 401.0(M))。
共振氢谱如图5所示：(H NMR，d6‑DMSO)δ(ppm)8.53‑8.61(dd,2H),7.75(m,3H),7.54‑7.59(m,3H),7.35(m,2H),6.45(s,1H),4.49‑4.51(m,2H),2.18‑2.21(m,2H),1.52‑1.21(m,6H)+
化合物9的质谱数据如图6所示：ESI‑MS：实验值m/z＝400.17,found 401.0(M))。
[0066] S6、荧光染料的合成：
[0067] 将14.5g化合物11用DMF溶解后直接加入化合物8的乙腈溶液中，反应16小时，TLC检测反应完毕，向反应液中加入500mL水，搅拌10min后弃去清液，再重复2次，加入二氯甲烷与甲醇体积比为5:1的混合液溶清，然后加入40mL水分液，有红色粘稠状产品析出，弃去水，用二氯甲烷与甲醇体积比为5:1的混合液过硅胶柱，得到17.5g红色固体，即为菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料，即为SafeStain，收率为49％，荧光染料SafeStain的HPLC测试结果如图9所示；反应式如下：
[0068]
[0069] 实施例3：
[0070] 实施例1的荧光染料的应用
[0071] 一、聚合酶链式反应(PCR)实验
[0072] 荧光染料分别采用SYBR Green以及实施例1的荧光染料SafeStain，
[0073] 选用的上游引物和下游引物分别为：
[0074] 上游引物：CAACCGGTCCCCACGTTGCC
[0075] 下游引物：AACGGCTGGGAGAACCTGGTTCTCAATGTA
[0076] PCR反应体系如表1所示：
[0077] 表1 50μL PCR反应体系
[0078]组分 体积 最终浓度
2×SYBR Green 25μL 1×
DNA模板 2μL 10ng
10μM上游引物 1μL 0.2μM
10μM下游引物 1μL 0.2μM
最终体积(加水) 50μL
2×SYBR Green 25μL 1×
DNA模板 2μL 10ng
10μM上游引物 1μL 0.2μM
10μM下游引物 1μL 0.2μM
最终体积(加水) 50μL
[0079] PCR反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃‑65℃退火10s，72℃延伸30s，共40个循环。
[0080] 以pGDR11 KOD‑RS质粒为模板、以上/下游引物进行PCR扩增，扩增后的目标序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
[0081] 在上述PCR反应体系中，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，每循环一次进行荧光信号的收集，以循环数为横坐标，以荧光强度为纵坐标，得到实时荧光定量PCR扩增产物电泳图，如图10所示，从图10中可以看出，在相同荧光染料浓度、相同DNA浓度、相同循环数下，本发明实施例1的SafeStain荧光染料与DNA结合后产生的荧光强度强于SYBR Green荧光染料与DNA结合后的荧光强度，说明本发明合成的荧光染料用于检测DNA的灵敏度高，本发明合成的荧光染料SafeStain更适用于荧光染料定时定量PCR反应，更适合用于DNA的检测。
[0082] 二、琼脂糖凝胶电泳实验实验室材料和试剂：
[0083] 实验样品：质粒DNA，DNA标记(1kb DNAladde，100bp DNAladder和100bp plus DNA ladder)
[0084] 实验试剂：TAE电泳缓冲液(Tris 24.2g，冰乙酸5.71mL，EDTA2.92g，NaOH 1.6g，pH8.0定容5000mL)，溴酚蓝指示剂，1％的琼脂糖凝胶，1％琼脂糖凝胶电泳染料；
[0085] 实验仪器：天能电泳仪(100v)，移液器(0.5～10uL)，紫外透射仪
[0086] 实验步骤：
[0087] (1)制胶：将0.2g琼脂糖溶于20mL TAE电泳缓冲液中，加热至琼脂糖完全融化，将融好的琼脂糖溶液室温放置40～50℃时加入2uL的凝胶电泳染料，混匀；
[0088] (2)倒胶：将制好的琼脂糖凝胶缓慢倒于制胶托盘内，避免产生气泡；将点样梳子垂直置于电泳胶膜的一端，距离托盘底部约1mm；放置时尽量保持平稳，切勿晃动；
[0089] (3)置胶：待胶体凝固后，缓慢垂直向上拔起点样梳子，切勿用力过猛；
[0090] (4)将琼脂糖凝胶放入电泳槽内，加入TAE电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面高于凝胶面1‑2mm；
[0091] (5)将1uL溴酚蓝与2uLDNA标本混合，得到混合溴酚蓝指示剂的DNA样本，将其加入到点样孔内；
[0092] (6)盖上电泳槽盖，开启电源，使DNA从负极移向正极，电压恒定在100～120v之间，恒压电泳；
[0093] (7)当DNA条带距离点样孔1‑2cm后关闭电源，取出凝胶，分别在紫外透视仪和蓝光凝胶成像仪下观察。
[0094] 电泳结果如图11所示，从图11中可以看出，不管是在紫外透视仪观察，还是在蓝光凝胶成像仪下观察，条带均分离清晰，灵敏度都很高。因此，本发明的荧光染料可以实现同时紫外透视仪和蓝光凝胶成像仪下核酸电泳染色，并且灵敏度高，解决了现有技术中的荧光染料不能同时应用于紫外透视仪和蓝光凝胶成像仪的问题。
[0095] 以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。