一种L-丝氨酸转运蛋白及其提高丝氨酸产量的应用

摘要

本发明公开了一种L‑丝氨酸转运蛋白及其应用，属于生物工程技术领域。本发明在研究氨基酸转运蛋白基础上，提供了谷氨酸棒杆菌中NCgl0255序列具有转运L‑丝氨酸功能。本发明进一步将NCgl0255运用于L‑丝氨酸的生产菌株，用于提高L‑丝氨酸的产量，使得L‑丝氨酸积累量达到29.58g/L。

权利要求

1.一种提高L‑丝氨酸产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：先在谷氨酸棒杆菌中过表达如SEQ ID NO.2所示的L‑丝氨酸转运蛋白NCgl0255，得到过表达L‑丝氨酸转运蛋白NCgl0255的基因工程菌，再应用该基因工程菌进行发酵；所述谷氨酸棒杆菌的保藏编号为CGMCC NO.8668。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件：发酵温度28‑32℃，100‑

140 rpm条件下发酵60‑150 h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养基包括蔗糖90‑110 g/L，硫酸铵20‑40 g/L，碳酸钙50‑70 g/L，MgSO4·7H2O 0.5‑1 g/L，FeSO4·7H2O 0.01‑0.05 g/L，MnSO4·H2O 0.01‑0.05 g/L，原儿茶酸20‑40 mg/L，生物素40‑60 μg/L，硫胺素400‑500 μg/L。

说明书

一种L‑丝氨酸转运蛋白及其提高丝氨酸产量的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，尤其是指一种L‑丝氨酸转运蛋白及其提高丝氨酸产量的应用。

背景技术

[0002] L‑丝氨酸是一种非必需氨基酸，在医药、食品、化妆品等领域有着广泛的应用。谷氨酸棒杆菌是食品安全级菌株，广泛应用于L‑谷氨酸、L‑赖氨酸、L‑缬氨酸等氨基酸的生产。然而一般的谷氨酸棒杆菌却不能利用糖质原料发酵生产L‑丝氨酸。

[0003] 目前国内外对谷氨酸棒杆菌产L‑丝氨酸的研究集中在其合成和降解途径的分子改造，Stolz等以不产L‑丝氨酸的谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，构建的重组菌以葡萄糖和果糖为混合碳源时L‑丝氨酸产量36.2g/L(引自文献：Stolz M,Peters‑Wendisch P,Etterich H,et al.Reduced folate supply as a key to enhanced L‑serine production  by  Corynebacterium glutamicum.[J].Applied&Environmental Microbiology,2007,73(3):750.)。来书娟等在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中加强表达3‑磷酸甘油酸激酶(PGK)，增加了L‑丝氨酸前体3‑磷酸甘油酸的合成，提高了L‑丝氨酸的产量(引自文献：来书娟,张芸,刘树文,等.产L‑丝氨酸谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造和代谢流分析[J].中国科学:生命科学,2012,42(4):295‑303.)。

[0004] 发明人前期从自然界中筛选得到一株能利用糖质原料发酵产L‑丝氨酸的野生型谷氨酸棒杆菌SYPS‑062，以它为出发菌株通过多轮化学诱变获得突变株C.glutamicum SYPS‑062‑33a。该突变株L‑丝氨酸产量提高65％，达到11.0g/L，副产物L‑丙氨酸和L‑缬氨酸的积累量也明显提高。进一步在突变株上解除L‑丝氨酸合成途径关键酶反馈抑制，敲除降解途径，阻断和弱化副产物积累途径，所获得重组菌C.glutamicum SYPS‑06233aΔSSA(缩写为ΔSSA)(CGMCCNO.8668)其L‑丝氨酸摇瓶产量可以达到26.25g/L，是野生型菌株的3.9倍。

[0005] 尽管代谢工程改造L‑丝氨酸合成和降解途径的基因取得很好的效果，但是为了适用工业规模的生产，目前L‑丝氨酸的产量仍需要提高。氨基酸的转运出胞是其在培养基中积累的重要前提，所以为了实现氨基酸大量生产，转运系统受到越来越多的关注。近几十年，在谷氨酸棒杆菌中，只有7个蛋白被鉴定为氨基酸分泌转运蛋白，涉及13种氨基酸的分泌。BrnFE参与L‑蛋氨酸、L‑异亮氨酸、L‑缬氨酸和L‑亮氨酸的分泌；CgmA参与L‑精氨酸的分泌；LysE参与L‑赖氨酸、L‑精氨酸、L‑瓜氨酸和L‑鸟氨酸的分泌，MscCG参与L‑谷氨酸和L‑天冬氨酸的分泌；MscCG2参与L‑谷氨酸的分泌；仅SerE和ThrE蛋白被鉴定有分泌转运L‑苏氨酸和L‑丝氨酸的功能。

发明内容

[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种L‑丝氨酸转运蛋白及其提高丝氨酸产量的应用。

[0007] 本发明的第一个目的在于提供一种L‑丝氨酸转运蛋白NCgl0255，所述L‑丝氨酸转运蛋白NCgl0255的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0008] SEQ ID NO.2：MTTDFSYILLVVAVCAVITFALRAVPFLILKPLRESQFVGKMAMWMPAGILAILTASTFRSNAIDLKTLTFGLIAVAITVAAHLLGSRRTLLSVGAGTIVFVGLVNLF*

[0009] 在本发明的一个实施例中，编码所述L‑丝氨酸转运蛋白NCgl0255的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0010] SEQ ID NO.1：ATGACAACTGATTTCTCCTATATTCTCCTTGTTGTCGCAGTATGTGCAGTCATTACTTTTGCGCTCCGGGCGGTTCCGTTCTTAATCCTCAAGCCCCTGCGTGAATCACAATTTGTGGGCAAAATGGCGATGTGGATGCCAGCAGGAATCCTTGCCATTTTGACCGCATCAACGTTTCGCAGCAATGCGATAGATCTGAAGACTCTAACCTTTGGTCTCATTGCCGTTGCGATTACAGTGGCGGCGCATCTTCTTGGCAGTCGACGCACCTTGTTGAGCGTTGGCGCTGGCACCATCGTTTTTGTTGGACTGGTGAATCTTTTCTAA。

[0011] 本发明的第二个目的在于提供编码所述的L‑丝氨酸转运蛋白NCgl0255的基因。

[0012] 本发明的第三个目的在于提供含所述的基因的质粒或载体，所述载体选自pXMJ19载体、pDXW系列载体、pET系列载体或pPICZ系列载体。

[0013] 本发明的第四个目的在于提供表达所述的L‑丝氨酸转运蛋白NCgl0255的细胞。

[0014] 在本发明的一个实施例中，所述细胞的宿主为大肠杆菌、棒杆菌、芽孢杆菌、酵母菌或丝状真菌。

[0015] 在本发明的一个实施例中，所述细胞的宿主为谷氨酸棒杆菌SSAAI。

[0016] 本发明的第五个目的在于提供一种提高L‑丝氨酸产量的方法，包括以下步骤：先在谷氨酸棒杆菌中过表达权利要求1中所述L‑丝氨酸转运蛋白NCgl0255，得到过表达L‑丝氨酸转运蛋白NCgl0255的基因工程菌，再应用该基因工程菌进行发酵。

[0017] 在本发明的一个实施例中，所述发酵的条件：发酵温度28‑32℃，100‑140rpm条件下发酵60‑150h。

[0018] 在本发明的一个实施例中，所述发酵的培养基包括蔗糖90‑110g/L，硫酸铵20‑40g/L，碳酸钙50‑70g/L，MgSO4·7H2O 0.5‑1g/L，FeSO4·7H2O 0.01‑0.05g/L，MnSO4·H2O 
0.01‑0.05g/L，原儿茶酸20‑40mg/L，生物素40‑60μg/L，硫胺素400‑500μg/L。

[0019] 在本发明的一个实施例中，发酵培养基包括蔗糖100g/L，硫酸铵30g/L，碳酸钙60g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，MnSO4·H2O 0.02g/L，原儿茶酸30mg/L，生物素50μg/L，硫胺素450μg/L，调节初始pH为7.0。

[0020] 在本发明的一个实施例中，种子培养基包括脑心浸液37g/L；葡萄糖20g/L；(NH4)2SO410g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；K2HPO40.2g/L；NaH2PO40.3g/L。

[0021] 在本发明的一个实施例中，谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因敲除的方法包括以下步骤：

[0022] 步骤一：利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCC NO.8668)的基因组；

[0023] 步骤二：以ΔSSA的基因组作为模板，使用Takara公司的高保真酶，设计基因敲除特异的引物分别扩增目的基因上游序列和下游片段，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的同源臂片段；

[0024] 步骤三：将同源臂片段连接到谷氨酸棒杆菌敲除质粒pk18mobsacB，构建得到重组敲除质粒，并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素和10％蔗糖平板进行筛选，然后通过PCR验证，得到基因敲除的重组菌。

[0025] 在本发明的一个实施例中，谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因过表达的方法包括以下步骤：

[0026] 步骤一：利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCC NO.8668)的基因组；

[0027] 步骤二：以ΔSSA的基因组作为模板，使用Takara公司的高保真酶，以及基因特异的引物扩增得到基因片段；

[0028] 步骤三：将目的基因片段与表达质粒PDXW‑10连接，构建过表达重组质粒并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素筛选重组菌，并提取质粒进行验证，得到正确的重组菌。

[0029] 在本发明的一个实施例中，重组谷氨酸棒杆菌发酵培养方法包括以下步骤：

[0030] 将重组谷氨酸棒杆菌接种于种子平板上分三区划线，培养3d后，挑取单菌落于种子平板上密集划线，培养3d后，将平板上的菌接种于20mL种子液中，30℃、120rpm过夜培养约12‑16h，至OD562为25，加入到25mL发酵培养基中使OD562为1，30℃、120rpm培养5d，每12h测其OD562和氨基酸浓度。

[0031] 本发明的第六个目的在于提供所述的L‑丝氨酸转运蛋白NCgl0255在制药、食品或化妆品领域中的应用。

[0032] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

[0033] 转运在代谢工程改造菌株高产氨基酸过程中起重要的作用。迄今为止，发现谷氨酸棒杆菌中的多种氨基酸转运蛋白，但是目前仅有报道转运蛋白ThrE和SerE可以转运L‑丝氨酸。本发明提供一种新型L‑丝氨酸转运蛋白NCgl0255，它具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，全长327个核苷酸，编码109个氨基酸。通过基因工程手段，将NCgl0255在高产L‑丝氨酸的谷氨酸棒杆菌ΔSSA实现过表达，能够将L‑丝氨酸的产量提高至29.58g/L。这为代谢工程改造菌株提高L‑丝氨酸产量提供了新思路。

附图说明

[0034] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

[0035] 图1是thrE敲除和过表达重组菌发酵特性评价，其中，A：重组菌ΔSSAΔthrE；B：重组菌ΔSSA‑thrE。

[0036] 图2是敲除NCgl0255基因重组菌ΔSSAΔNCgl0255发酵特性评价。

[0037] 图3是过表达NCgl0255基因重组菌ΔSSA‑NCgl0255发酵特性评价。

[0038] 图4是NCgl0255蛋白的转运功能验证。

具体实施方式

[0039] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0040] (一)培养基

[0041] 种子培养基：脑心浸液37g/L；葡萄糖20g/L；(NH4)2SO410g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；K2HPO40.2g/L；NaH2PO40.3g/L。

[0042] CGXⅡ基本培养基：葡萄糖40g/L，尿素5g/L，(NH4)2SO420g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.25g/L，MOPS 42g/L，CaCl210mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，ZnSO41mg/L，CuSO40.2mg/L，NiCl2·6H2O 0.02mg/L，生物素0.2mg/L，原儿茶酸0.03g/L。

[0043] 发酵培养基：蔗糖100g/L，硫酸铵30g/L，碳酸钙60g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，MnSO4·H2O 0.02g/L，原儿茶酸30mg/L，生物素50μg/L，硫胺素450μg/L，调节初始pH为7.0。

[0044] (二)谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因敲除的方法

[0045] 步骤一：利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCC NO.8668)的基因组；

[0046] 步骤二：以ΔSSA的基因组作为模板，使用Takara公司的高保真酶，设计基因敲除特异的引物分别扩增目的基因上游序列和下游片段，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的同源臂片段；

[0047] 步骤三：将同源臂片段连接到谷氨酸棒杆菌敲除质粒pk18mobsacB，构建得到重组敲除质粒，并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素和10％蔗糖平板进行筛选，然后通过PCR验证，得到基因敲除的重组菌。

[0048] (三)谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因过表达的方法

[0049] 步骤一：利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCC NO.8668)的基因组；

[0050] 步骤二：以ΔSSA的基因组作为模板，使用Takara公司的高保真酶，以及基因特异的引物扩增得到基因片段；

[0051] 步骤三：将目的基因片段与表达质粒PDXW‑10连接，构建过表达重组质粒并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素筛选重组菌，并提取质粒进行验证，得到正确的重组菌。

[0052] (四)重组谷氨酸棒杆菌发酵培养方法

[0053] 活化菌株：将重组谷氨酸棒杆菌接种于种子平板上分三区划线，培养3d后，挑取单菌落于种子平板上密集划线，培养3d后，将平板上的菌接种于20mL种子液中，30℃、120rpm过夜培养约12‑16h，至OD562为25，加入到25mL发酵培养基中使OD562为1，30℃、120rpm培养5d，每12h测其OD562和氨基酸浓度。

[0054] (五)L‑丝氨酸转运蛋白功能的验证

[0055] 氨基酸二肽的添加是氨基酸转运蛋白功能验证常用的实验方法。为了对L‑丝氨酸的转运蛋白进行验证，在南京肽业公司合成了L‑丝氨酸二肽(L‑ser‑ser)用于L‑丝氨酸转运实验。将谷氨酸棒杆菌于固体种子平板上活化，后接种至液体种子培养基中过夜培养，长至对数生长期。收集对数生长期的菌体，使用CGXⅡ基本培养基洗涤2次，接种到CGXⅡ基本培养基中，加入3mM L‑ser‑ser二肽，30℃预培养2h。收集预培养的菌体，使用预冷的CGXⅡ基本培养基洗涤2次。按初始OD562＝8‑10将菌体接种到50mL CGXⅡ基本培养基中，加入L‑ser‑ser二肽开始转运实验，使得终浓度为3mM。每隔15min取样1mL，取样立即离心，取出上清保存至‑80℃冰箱，至120h后终止反应，随后高效液相色谱法测定胞外的L‑丝氨酸浓度。

[0056] (六)高效液相色谱法测定L‑丝氨酸浓度

[0057] 1.溶液配制

[0058] 三乙胺乙腈：取0.7mL的三乙胺添加到4.3mL的乙腈中。

[0059] 异硫氰酸苯酯乙腈(PITC)溶液：取异硫氰酸苯酯25μL添加到2mL的乙腈中。

[0060] 流动相A：称15.2g无水乙酸钠，水1850mL,溶解后用冰醋酸调pH至6.5，加入140mL乙腈，混匀后用0.45μm有机滤膜过滤。

[0061] 流动相B：80％的乙腈。

[0062] 2.氨基酸样品衍生

[0063] 取氨基酸标准样品及稀释过的发酵液样品200μL，每管中加入20μL正亮氨酸内标溶液。随后，分别加入100μL的三乙胺乙腈和异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀后室温静置1h，加入正己烷400μL,剧烈震荡混匀后静置10min,取下层溶液200μL，加入800μL超纯水稀释后，用0.45μm有机滤膜过滤后上样。

[0064] 3.HPLC反应条件

[0065] 色谱柱：Venusil AA，4.6×250nm，5μm；紫吸收波长：254nm；柱温：40℃；流速：1mL/min；进样体积：10μL。流动相梯度洗脱，洗脱程序为:0‑4min，100％流动相A:4‑16min，97％流动相A：16‑17min，89％流动相A：17‑32min，79％流动相A；32‑34min，66％流动相A；34‑38min，0％流动相A；38.01min，100％流动相A。

[0066] 谷氨酸棒杆菌ΔSSA公开于文献：罗玉常.产L‑丝氨酸谷氨酸棒杆菌SYPS‑062的代谢工程[D].江南大学,2012.

[0067] 实施例1L‑苏氨酸和L‑丝氨酸转运蛋白ThrE对ΔSSA产L‑丝氨酸的影响[0068] ThrE是谷氨酸棒杆菌中L‑苏氨酸的转运蛋白。因为L‑苏氨酸和L‑丝氨酸在化学结构上具有相似性，文献报道ThrE也有转运丝氨酸的作用，所以本实施例说明ThrE对谷氨酸棒杆菌ΔSSA产L‑丝氨酸的影响。

[0069] 1、按照谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因敲除的方法实现thrE的敲除。

[0070] (1)利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCC NO.8668)的基因组；

[0071] (2)利用特异性引物thrE‑1:5’‑GCTCTAGACATCAATCTGGTCAACGAA和thrE‑2:5’‑GACATGGAGATGAGCTAAGAATGCGGCCACGAAGGGTC扩增目的基因的左同源臂；利用特异性引物thrE‑3:5’‑CTTAGCTCATCTCCATGTCTCAACCCATACCGTGCATT和thrE‑4:5’‑CCCAAGCTTATCATCCATATAAGATCCG扩增目的基因的右同源臂，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的同源臂片段；

[0072] (3)将同源臂片段连接到谷氨酸棒杆菌敲除质粒pk18mobsacB，构建得到重组敲除质粒，并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素和10％蔗糖平板进行筛选，然后通过PCR验证，得到基因敲除的重组菌ΔSSAΔthrE。

[0073] 2、按照谷氨酸棒杆菌ΔSSA中过表达的方法实现thrE的过表达。

[0074] (1)利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCC NO.8668)的基因组；

[0075] (2)以谷氨酸棒杆菌ΔSSA的基因组作为模板，使用Takara公司的高保真酶，以及基因特异的引物thrE‑F：5’‑GAAGATCTAGAAGGAGATATACCATGTTGAGTTTTGCGACCCT和thrE‑R：5’‑CCCAAGCTTTTACCTTTTATTACCGAATC)扩增得到基因片段；

[0076] (3)将目的基因片段与表达质粒连接，构建过表达重组质粒并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素筛选重组菌，并提取质粒进行验证，得到正确的重组菌。

[0077] 在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSAΔthrE、ΔSSA‑thrE的发酵特性，用于说明其对ΔSSA产L‑丝氨酸的影响。从图1A中可以看出，敲除L‑苏氨酸的转运蛋白ThrE，对菌株生长和L‑丝氨酸的产量未造成显著的影响；从图1B中可以发现，过表达ThrE后，L‑丝氨酸产量并未提高，说明L‑苏氨酸转运蛋白ThrE对于提高L‑丝氨酸产量没有显著影响。

[0078] 实施例2敲除NCgl0255基因对ΔSSA产L‑丝氨酸的影响

[0079] 通过菌株ΔSSA与ATCC13032的转录组测序对比发现NCgl2463(见SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)、NCgl0074(见SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)、NCgl0255(见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)转录水平均有上调，猜测上述基因与L‑丝氨酸的转运出胞有关。

[0080] 敲除NCgl0255基因的步骤如下：

[0081] (1)利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCC NO.8668)的基因组；

[0082] (2)利用特异性引物NCgl0255‑1:CTATGACATGATTACGAATTAGCCAGAAACGTTCACCA和NCgl0255‑2:GGTACTTCTTCTTGGCATGCCCTCAATTTGAAGGG扩增目的基因的左同源臂；利用特异性引物NCgl0255‑3:CAAATTGAGGGCATGCCAAGAAGAAGTACCGGATG和NCgl0255‑4:TGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCTGGTCATCGCCCTC扩增目的基因的右同源臂，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的同源臂片段；

[0083] (3)将同源臂片段连接到谷氨酸棒杆菌敲除质粒pk18mobsacB，构建得到重组敲除质粒，并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素和10％蔗糖平板进行筛选，然后通过PCR验证，得到基因敲除的重组菌ΔSSAΔNCgl0255。

[0084] 在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSAΔNCgl0255的发酵特性，结果见图2。从图2中可以看出，敲除NCgl0255后，L‑丝氨酸的产量却发生显著的下降。发酵120h，重组菌ΔSSAΔNCgl0255的L‑丝氨酸积累量为21.7g/L，与出发菌株ΔSSA相比下降了17.3％，说明NCgl0255是L‑丝氨酸一个极其重要的转运蛋白。

[0085] 实施例3L‑丝氨酸转运蛋白NCgl0255的功能验证

[0086] 本实施例是为了验证L‑丝氨酸转运蛋白NCgl0255的L‑丝氨酸转运功能。

[0087] 氨基酸二肽的添加是氨基酸转运蛋白功能验证常用的实验方法。为了对L‑丝氨酸的转运蛋白进行验证，在南京肽业公司合成了L‑丝氨酸二肽(L‑ser‑ser)用于L‑丝氨酸转运实验。将谷氨酸棒杆菌于固体种子平板上活化，后接种至液体种子培养基中过夜培养，长至对数生长期。收集对数生长期的菌体，使用CGXⅡ基本培养基洗涤2次，接种到CGXⅡ基本培养基中，加入3mM L‑ser‑ser二肽，30℃预培养2h。收集预培养的菌体，使用预冷的CGXⅡ基本培养基洗涤2次。按初始OD562＝8‑10将菌体接种到50mL CGXⅡ基本培养基中，加入L‑ser‑ser二肽开始转运实验，使得终浓度为3mM。每隔15min取样1mL，取样立即离心，取出上清保存至‑80℃冰箱，至120h后终止反应，随后高效液相色谱法测定胞外的L‑丝氨酸浓度。

[0088] 从图3可以看出，在CGXⅡ培养基中不添加L‑丝氨酸二肽时，敲除重组菌ΔSSAΔNCgl0255培养基中L‑丝氨酸浓度比ΔSSA降低了14.9％，即敲除了NCgl0255的蛋白的L‑丝氨酸转运功能急速下降，说明NCgl0255具有转运L‑丝氨酸的功能。

[0089] 实施例4加强表达NCgl0255提高L‑丝氨酸的产量

[0090] 将L‑丝氨酸转运蛋白运用于提高丝氨酸产量的研究，在谷氨酸棒杆菌ΔSSA中构建加强表达NCgl0255的重组菌ΔSSA‑NCgl0255。

[0091] 加强表达NCgl0255的步骤如下：

[0092] (1)利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCC NO.8668)的基因组；

[0093] (2)以谷氨酸棒杆菌ΔSSA的基因组作为模板，使用Takara公司的高保真酶，以及基因特异的引物NCgl0255‑F:5’‑TTCACACAGGAAACAGAATTCATGACAACTGATTTCTCCTA和NCgl0255‑R:5’‑CATCCGCCAAAACAGAAGCTTTTAGAAAAGATTCACCAGTC扩增得到基因片段；

[0094] (3)将目的基因片段与表达质粒连接，构建过表达重组质粒并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素筛选重组菌，并提取质粒进行验证，得到正确的重组菌ΔSSA‑0255。

[0095] 在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSA‑NCgl0255的发酵特性，结果见图4。从图4中可以看出，过表达NCgl0255后，L‑丝氨酸积累量为29.58g/L，比出发菌株ΔSSA提高了12.7％，说明成功地将NCgl0255应用于提高L‑丝氨酸产量。

[0096] 对比例1

[0097] 按照本申请提供的基因敲除方法敲除其他蛋白NCgl2463，得到重组菌ΔSSAΔNCgl2463。

[0098] 在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSAΔNCgl2463的发酵特性，结果表明，敲除NCgl2463后，发酵敲除菌株120h，重组菌ΔSSAΔ2463的L‑丝氨酸积累量为26.3g/L，与出发菌株ΔSSA相比，L‑丝氨酸提升1.9％，对菌株生长与L‑丝氨酸产量并未产生显著影响。

[0099] 对比例2

[0100] 按照本申请提供的基因敲除方法敲除其他蛋白NCgl0074，得到重组菌ΔSSAΔNCgl0074。

[0101] 在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSAΔNCgl0074的发酵特性，结果表明，敲除NCgl0074后，发酵敲除菌株120h，重组菌ΔSSAΔY的L‑丝氨酸积累量为27.5g/L，与出发菌株ΔSSA相比，L‑丝氨酸提升4.8％，对菌株生长与L‑丝氨酸产量并未产生影响。

[0102] 蛋白NCgl2463序列情况：

[0103] ATGGCTAACGCCACCGCACAGAAGGGCCGCTTCGGCCTTCCCGGCTGGATGACTGGCTTTGGTGCCCAGGTTATCGCCGGCCTCATTCTTGGCCTTATTCTCGGCCTTGTCGCCCGAGGCATGGACAGCGGCGCTACAGACGGTGAAGCAAGCTGGCTTACCGGTCTTCTTGGCGGCGTCGGTTCTGCTTATGTTTCCCTACTTAAAGTAATGGTTCCACCACTGGTGTTCGCTGCAGTGGTTACCAGTGTGGCAAAGCTGCGCGAGGTAGCTAACGCTGCTCGTCTGGCTGTTTCCACCTTGGTGTGGTTCGCCATTACTGCATTCTTCTCTGTGCTCGCGGGTATCGCCGTAGCGCTGATTATGCAGCCTGGTGTTGGATCCACTGTTGACGCATCTAATGCTGCAGATCCTTCCCATGTTGGCAGCTGGCTGGGCTTTATCCAGTCCGTTATTCCATCAAACATTCTGGGACTTTCCGGTTCTTACAGTGAGAACTCTGGTGTGAACCTGTCCTTCAACGTGCTGCAGATCCTGGTGATCTCCATTGCGATTGGTGTTGCAGCGCTAAAGGCTGGCAAGTCCGCTGAGCCTTTCTTGAAGTTCACCGAGTCCTTCCTCAAGATCATCCAGATAGTGTTGTGGTGGATTATTCGCCTGGCTCCAATTGGTTCCGCTGCGCTGATCGGTAATGCTGTTGCTACCTACGGTTGGTCTGCACTTGGATCCCTGGGCAAGTTTGTTCTTGCGATCTACGTTGGTCTGGCAATCGTCATGTTCGTTATCTACCCAGTCGTGCTGAAGCTCAATGGAATTCCTGTTCTTGGATTCTTTAAGCGCGTTTGGCCTGTCACAAGCCTTGGCTTTGTTACCCGTTCCTCCATGGGCGTTATGCCAGTTACCCAGCGCGTTACTGAGCAGTCCTTGGGTGTTCCATCTGCGTACGCTTCCTTTGCTATCCCACTGGGTGCGACCAGCAAGATGGACGGCTGCGCTGCTGTCTACCCAGCTGTTGCCGCTATCTTCGTGGCACAGTTCTACGGCATTGACTTGAGCATCATGGATTACGTACTGATCATGATCGTCTCTGTCCTGGGCTCTGCTGCTACTGCAGGCACCACTGGCGCAACCGTCATGCTGACCCTGACCCTATCCACCTTGGGTCTGCCACTTGCTGGTGTTGGTCTGCTGCTGGCTATCGAGCCAATCATCGACATGGGACGTACCGCAACCAACGTCACCGGTCAGGCACTGGTTCCTGCGATCGTTGCTAAGCGCGAGGGCATTCTGGATCAGGATGTGTGGGATGCTGCTGAAAAGGGTGGCGCTGCTATTGATAAGGCAACCGTCTCTGAGAAAGAAACTGAGCCTGCAGAGGTTCGCTCCTAA(SEQ ID NO.3)

[0104] MANATAQKGRFGLPGWMTGFGAQVIAGLILGLILGLVARGMDSGATDGEASWLTGLLGGVGSAYVSLLKVMVPPLVFAAVVTSVAKLREVANAARLAVSTLVWFAITAFFSVLAGIAVALIMQPGVGSTVDASNAADPSHVGSWLGFIQSVIPSNILGLSGSYSENSGVNLSFNVLQILVISIAIGVAALKAGKSAEPFLKFTESFLKIIQIVLWWIIRLAPIGSAALIGNAVATYGWSALGSLGKFVLAIYVGLAIVMFVIYPVVLKLNGIPVLGFFKRVWPVTSLGFVTRSSMGVMPVTQRVTEQSLGVPSAYASFAIPLGATSKMDGCAAVYPAVAAIFVAQFYGIDLSIMDYVLIMIVSVLGSAATAGTTGATVMLTLTLSTLGLPLAGVGLLLAIEPIIDMGRTATNVTGQALVPAIVAKREGILDQDVWDAAEKGGAAIDKATVSEKETEPAEVRS*(SEQ ID NO.4)。

[0105] 蛋白NCgl0074序列情况：

[0106] ATGTCTAACGCATCTTTTAAAGGCGACGATAAAGCACTCATTGGCATAGTTTTATCAGTTCTCACATTTTGGCTTTTTGCTCAGTCAACCCTAAATATCGGCCCAGATATGGCAACTGATTTAGGGATGAGCGATGGCACCATGAACATAGCTGTCGTGGCCGCCGCGTTATTCTGTGGAACATTTATCGTCGCAGCCGGCGGCATCGCAGATGTCTTTGGCCGAGTACGAATCATGATGATTGGCAACATCCTTAACATCCTGGGATCTCTCCTCATCGCCACGGCAACGACTTCTTTAGCCACCCAAATGGTGATCACCGGCCGAGTTCTCCAAGGACTGGCAGCAGCGGCCATCATGTCTGCATCCCTAGCATTAGTTAAGACATATTGGTTAGGTACTGACCGCCAACGAGCAGTCTCCATTTGGTCCATTGGTTCATGGGGTGGCACCGGATTCTGCGCACTTTTCGCGGGTCTTGTTGTAGCAAGCCCCTTTGGCTGGAGAGGAATCTTCGCCCTCTGCGCGATCGTCTCCATCGTTGCTATTGCCCTTACCCGCCACATCCCGGAATCCCGTCCGGCTCAACCCATTGGCATGCACTTGGATTGGAGTGGCATCATCGTTCTTGCCCTCAGTGTTCTATCTCTTGAATTGTTTATTACCCAAGGAGAATCACTTGGCTGGACGCACTGGATGGCCTGGACTCTCCTTGCCGTTTCTTTGACATTTCTCGCTGTTTTCGTCTTCATTGAACGCGTCGCCAGCTGGCCAGTTCTCGACTTCAACCTTTTCAAAGACCACGCCTTCAGCGGTGCGACCATCACCAACTTCATTATGAGCGCTACTGGCGGAGTAGTTGCCGTTGTCATGTGGGTTCAGCAAATGGGATGGGGTGTCTCCCCAACAATCTCGGGACTCACCAGCATCGGCTTCGCAGCCTTTGTCATCCTTTTCATTCGAGTTGGAGAAAAGGCCATGCAGAAAGTTGGCGCCCGAGCAGTGATCATCACCGCTGGCATCTTGGTAGCGACTGCGACCGCCCTCCTAATGATCACCGCAGTCAGCGAGTCAACGTACATCGTCATCTCCCTCGCCGGCTTCTCCCTTTATGGCCTTGGCCTCGGACTCTTCGCCACCCCAGTCACAGATACCGCCCTTGGAACACTTCCCAAAGACCGTACCGGCGCTGGTGCAGGTGTATTCAAGATGTCTTCTTCCCTCGGCGCAGCACTCGGCATCGCAATCTCCACTTCAGTGTTCCTCGCACTTCGCGACGGCACCTCCATCAACTCCGACGTCGCACTCGCCGGAACAGTTTCACTTGGCATCAACGTTGTATTCGCAGCAACAGCCACCATCACCGCAGCAGTCCTTATTCCAAAAGCCGCTGGCAAAGTCTCACAAACCAGCATCACCCTTCCTGAGCCAGCTATCGCTGTAAAAATCTAA(SEQ ID NO.5)。

[0107] MSNASFKGDDKALIGIVLSVLTFWLFAQSTLNIGPDMATDLGMSDGTMNIAVVAAALFCGTFIVAAGGIADVFGRVRIMMIGNILNILGSLLIATATTSLATQMVITGRVLQGLAAAAIMSASLALVKTYWLGTDRQRAVSIWSIGSWGGTGFCALFAGLVVASPFGWRGIFALCAIVSIVAIALTRHIPESRPAQPIGMHLDWSGIIVLALSVLSLELFITQGESLGWTHWMAWTLLAVSLTFLAVFVFIERVASWPVLDFNLFKDHAFSGATITNFIMSATGGVVAVVMWVQQMGWGVSPTISGLTSIGFAAFVILFIRVGEKAMQKVGARAVIITAGILVATATALLMITAVSESTYIVISLAGFSLYGLGLGLFATPVTDTALGTLPKDRTGAGAGVFKMSSSLGAALGIAISTSVFLALRDGTSINSDVALAGTVSLGINVVFAATATITAAVLIPKAAGKVSQTSITLPEPAIAVKI*(SEQ ID NO.6)。

[0108] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。