通用的CAR拷贝数检测剂及其应用和应用方法转让专利
申请号 : CN202210391049.9
文献号 : CN114717317B
文献日 : 2023-05-02
发明人 : 梅恒 , 李成功 , 胡豫 , 邓君 , 周芬
申请人 : 华中科技大学同济医学院附属协和医院
摘要 :
本发明属于生物技术领域,公开了通用的CAR拷贝数检测剂及其应用和应用方法。具体的,CAR拷贝数检测剂为探针和引物对及其混合物或试剂盒中任一;检测探针,其具有如SED ID NO:1所示序列;检测引物对,其分别具有如SED ID NO:3和SED ID NO:4所示序列。针对HIV前病毒保守序列的检测剂在制备CAR修饰免疫细胞治疗中CAR拷贝数检测产品中的应用,其中,CAR基于HIV改造的慢病毒载体转染至效应细胞。应用方法包括用前叙探针、引物对配成PCR反应体系及后续定量PCR的检测步骤。本发明的探针和引物对针对HIV保守的前病毒序列5’LTR,可以精确检测所有以HIV改造慢病毒载体转导CAR的拷贝数,具有通用性和普适性;检测的灵敏度高;不需要标准品。
权利要求 :
1.CAR拷贝数检测剂,其特征在于,其包含下述i)检测探针,其具有如SED ID NO:1所示序列:
5’‑AACCCACTGCTTAAGC‑3’;
ii)检测引物对,序列为:
FR:5’‑CCTGGGAGCTCTCTGGCTAA‑3’,RP:5’‑CACTGACTAAAAGGGTCTGAGGG‑3’。
2.根据权利要求1所述的CAR拷贝数检测剂,其特征在于,CAR修饰的细胞免疫治疗中CAR以HIV改造的慢病毒载体转导。
3.根据权利要求2所述的CAR拷贝数检测剂,其特征在于,CAR产品为瑞基奥仑赛。
4.根据权利要求1所述的CAR拷贝数检测剂,其特征在于,所述检测探针中,荧光报告基团至少选自FAM、Hex、VIC、ROX、Cy5中任一,荧光淬灭基团至少选自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2、BHQ3、MGB中任一。
5.权利要求1所述的CAR拷贝数检测剂在制备CAR拷贝数检测产品中的应用;其中,CAR基于HIV改造的慢病毒载体转染至效应细胞。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述HIV前病毒保守序列为HIV5’LTR序列;
CAR拷贝数为CAR修饰免疫治疗中的CAR拷贝数。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,CAR修饰免疫治疗中细胞治疗物为瑞基奥仑赛。
8.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述应用为针对HIV前病毒保守序列的检测剂在制备CAR修饰免疫治疗中CAR转导效率、CAR浓度、CAR体内扩增和持续检测产品中的应用;所述效应细胞包括T细胞、NK细胞。
说明书 :
通用的CAR拷贝数检测剂及其应用和应用方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域,尤其涉及通用的CAR拷贝数的检测剂及其应用和应用方法。
背景技术
[0002] 嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗在血液肿瘤中展示了极高的有效性,被《science》评为2013年度“十大科学突破之首”,入选中国2020年度十大生命科学进展。目前已有Kymriah,Yescarta,Tecartus,Abecma, (西达基奥仑赛)5款细胞治疗产品获得FDA批准用于治疗急性B细胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤,我国食品药品监督管理局也批准了阿基伦赛、瑞基奥仑赛2款细胞治疗产品上市。CAR‑T细胞在体内的定植、扩增、存续与其临床安全性和疗效密切相关,已有研究表明CAR‑T扩增高峰和回输后28天内扩增的曲线下面积与临床反应和安全性相关,体内存续与缓解时间相关,因此密切监测体内CAR‑T细胞对于临床管理十分重要。然而,由于CAR‑T结构的复杂性和多样性,目前尚无统一的准确定量方法。
[0003] 随着CAR‑T技术的发展和成熟,出现了CAR修饰的其他效应细胞,包括CAR‑NK、CAR‑巨噬、CAR‑抑制性T细胞等。以CAR‑NK疗法为例,NK细胞因其特殊的识别靶细胞的机制、短暂的生理周期、广泛的肿瘤杀伤能力等优势,被视为同样有潜力通过CAR修饰增强其抗肿瘤能力的效应细胞。NK细胞是一类对肿瘤细胞具有强力杀伤作用且MHC非依赖的淋巴细胞,其对肿瘤细胞的识别主要依赖于其表面活化性受体和抑制性受体的相互交叉调控。当识别肿瘤细胞之后,NK细胞通过释放杀伤介质穿孔素和颗粒酶使靶细胞凋亡、表达膜TNF家族分子诱导靶细胞凋亡和抗体依赖的细胞毒作用等多种途径杀伤肿瘤细胞。
[0004] 荧光定量PCR是一种依据倍比稀释的标准品扩增的Ct值来推算待测样本中目标分子含量的一种定量PCR技术,是目前监测CAR拷贝数最常用的手段。然而,由于CAR结构的多样性和复发性,目前已知的引物和探针是针对FMC63和4‑1BB‑CD3z的接头区(1.Cancers(Basel).2020Sep 30;12(10):2820;2.Mol Ther Methods Clin Dev.2020Dec 10;20:535‑541.),部分CAR‑T产品如瑞基奥仑赛尚无有效的引物和探针;其次,荧光定量PCR需要已知浓度的标准品,限制了其在各大医院的常规检测;另外,荧光定量PCR需要至少3次重复,检测阈值受环境和操作影响较大,难以准确定量和定性。
[0005] 数字化PCR具有高度的敏感性、特异性和可重复性,是一种可以用于准确定量稀有事件的定量PCR技术。大部分CAR是借助慢病毒载体转染到T细胞上的,目前常用的慢病毒载体是基于HIV病毒改造的,保守的前病毒序列会随着CAR一起转染到宿主细胞,针对前病毒序列设计探针和引物可以检测所有基于HIV的慢病毒转染CAR的拷贝数。
发明内容
[0006] 针对上述问题,本发明给出了通用的CAR拷贝数检测剂及其应用和应用方法,主要解决了现有的检测探针引物普适性差,检测精度低等问题。
[0007] 为了解决上述问题,本发明采用如下技术方案:
[0008] CAR拷贝数检测剂,其至少包含下述中之一
[0009] i)检测探针,其具有如SED ID NO:1所示序列:
[0010] 5’‑AACCCACTGCTTAAGC‑3’;
[0011] ii)检测引物对,序列为:
[0012] FR:5’‑CCTGGGAGCTCTCTGGCTAA‑3’,
[0013] RP:5’‑CACTGACTAAAAGGGTCTGAGGG‑3’。
[0014] 在一些方式中,CAR修饰免疫细胞治疗中的CAR为HIV改造的慢病毒为载体转导的CAR。
[0015] 在一些方式中,CAR‑T细胞产品为瑞基奥仑赛。
[0016] 在一些方式中,所述检测探针中,
[0017] 荧光报告基团选自FAM、Hex、VIC、ROX、Cy5中任一,荧光淬灭基团选自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2、BHQ3、MGB中任一。
[0018] 针对HIV前病毒的检测剂在制备CAR修饰免疫治疗中CAR拷贝数检测产品中的应用;其中,HIV前病毒为转导CAR的慢病毒载体的HIV前病毒,且保守前病毒序列。
[0019] 在一些应用中,所述CAR修饰免疫治疗中CAR为以HIV改造的慢病毒载体转导的CAR。
[0020] 在一些应用中,HIV前病毒的检测剂为HIV 5’LTR序列检测剂。
[0021] 在一些应用中,HIV前病毒检测剂为前述任一所述CAR拷贝数检测剂。
[0022] 在一些应用中,CAR‑T细胞治疗物为瑞基奥仑赛。
[0023] 在一些应用中,所述应用为针对HIV前病毒保守序列的检测剂在制备CAR修饰免疫治疗中CAR转导效率、CAR浓度、CAR体内扩增和持续检测产品中的应用;所述效应细胞包括T细胞、NK细胞等。
[0024] CAR修饰免疫治疗CAR拷贝数检测方法,包括下述步骤
[0025] 配制PCR反应体系,其中包含
[0026] 待检样品,
[0027] 探针,其序列为5’‑FAM‑AACCCACTGCTTAAGC‑MGB‑3’,
[0028] 和/或引物,其序列为
[0029] FR:5’‑CCTGGGAGCTCTCTGGCTAA‑3’,
[0030] RP:5’‑CACTGACTAAAAGGGTCTGAGGG‑3’;
[0031] 后续检定步骤。
[0032] 本发明的有益效果是:
[0033] 可以检测CAR修饰细胞免疫治疗的体内CAR含量,对多种CAR产品的使用均能起到检测功能,尤其对HIV改造的慢病毒转染的CAR拷贝数,具有通用性和普适性;检测的灵敏度高;不需要标准品。
附图说明
[0034] 图1为针对FMC63的引物和探针检测标准品结果图;
[0035] 图2为针对4‑1BB‑CD3z的引物和探针检测标准品结果图;
[0036] 图3为针对LTR的引物和探针检测标准品结果图;
[0037] 图4为三组引物和探针检测CAR结果与标准浓度的拟合关系图;
[0038] 图5为三组引物和探针测定瑞基奥仑赛的总微滴生成数、结果图;
[0039] 图6为三组引物和探针检测不同CAR‑T产品的总微滴生成数、结果图;
[0040] 图7‑8为针对LTR的探针1和引物对1检测健康阴性样本的总微滴生成数、结果图。
具体实施方式
[0041] 本部分第一方面介绍CAR拷贝数检测剂:
[0042] CAR拷贝数检测剂,其至少包含下述中之一
[0043] i)检测探针,其具有如SED ID NO:1所示序列:
[0044] 5’‑AACCCACTGCTTAAGC‑3’;实际应用时,可以在此基础上装在其他必要的功能部;
[0045] ii)检测引物,引物序列为:
[0046] FR:5’‑CCTGGGAGCTCTCTGGCTAA‑3’(SED ID NO:3),
[0047] RP:5’‑CACTGACTAAAAGGGTCTGAGGG‑3’(SED ID NO:4)。
[0048] 可以任选其一,也可将两者混用,均具有相应的效果。
[0049] 当其用在检测试剂盒中时,也视为对相应检测剂的应用。CAR拷贝数检测剂为探针、引物对及其混合物或试剂盒药剂等中任一。
[0050] 其中,CAR修饰的细胞免疫治疗中CAR拷贝数检测包括测定含量、测定转导率的检测等需要参考拷贝数的检定,通过CAR浓度或CAR拷贝数来表征CAR修饰的细胞免疫治疗中CAR含量。
[0051] 在一些方式中,CAR修饰的细胞免疫治疗中细胞治疗物CAR为HIV改造的慢病毒载体转导的CAR。
[0052] 在一些情况中,本产品和应用针对的是CAR修饰的细胞免疫治疗(包括CAR‑T治疗)中细胞治疗物为HIV改造的慢病毒载体转导的CAR。在CAR‑T治疗中应用的产品由HIV前病毒改造形成载体,然后形成CAR修饰的细胞免疫治疗产品。
[0053] 其中之一,所述CAR‑T产品为瑞基奥仑赛;
[0054] 其中之二,检测探针中,所述荧光报告基团选自FAM、Hex、VIC、ROX、Cy5中任一,所述荧光淬灭基团选自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2、BHQ3、MGB中任一。如:所述检测探针一组合应用形态的序列的如SED ID NO:2所示:FAM‑AACCCACTGCTTAAGC‑MGB。该检测探针装载了荧光效应部。
[0055] 本部分第二方面介绍检测剂的部分应用场景:
[0056] ‘针对HIV前病毒保守序列的检测剂’在制备CAR拷贝数检测产品中的应用;其中,CAR基于HIV前病毒改造的慢病毒载体转染至效应细胞(包括T细胞、NK细胞等)。
[0057] 前段涉及CAR修饰的细胞免疫治疗中的CAR拷贝数。当转染至T细胞时则为CAR‑T治疗,采用其他效应细胞时则为相应治疗(如CAR‑NK等),也有相近的效果,不限定必须应用在CAR‑T治疗中。同时对其中部分名词做如下两段释义:
[0058] HIV前病毒保守序列。基于HIV病毒改造的慢病毒载体,保守的前病毒序列(HIV前病毒保守序列)会随着CAR一起转染到宿主细胞;
[0059] CAR基于HIV改造的慢病毒载体转染至T细胞,用于CAR‑T治疗。
[0060] 前述应用进一步的为,所应用为针对HIV前病毒保守序列的检测剂在制备CAR‑T治疗中CAR转导效率、CAR浓度检测产品中的应用。
[0061] 同样的,CAR‑T中CAR拷贝数检测包括测定含量、测定转导率的检测等需要参考拷贝数的检定,通过CAR浓度或CAR拷贝数来表征CAR‑T中CAR含量。
[0062] 在一些方式中,HIV前病毒保守序列检测剂为HIV 5’LTR序列检测剂。包括探针、引物对或其他可行产品。
[0063] 在一些方式中,HIV前病毒保守序列检测剂为前述第一方面任一所述检测剂。
[0064] 在一些方式中,CAR‑T治疗中细胞治疗物为瑞基奥仑赛。
[0065] 在一些应用中,所述应用为针对HIV前病毒保守序列的检测剂在制备CAR修饰免疫治疗中CAR转导效率、CAR浓度、CAR体内扩增和持续至少一个检测产品中的应用。
[0066] 本部分第三方面介绍CAR修饰免疫治疗中CAR拷贝数检测方法:
[0067] CAR修饰免疫治疗CAR拷贝数检测方法,包括下述步骤
[0068] 配制PCR反应体系,其中包含
[0069] 待检样品,
[0070] 探针,其序列为5’‑FAM‑AACCCACTGCTTAAGC‑MGB‑3’,
[0071] 和/或引物,其序列为
[0072] FR:5’‑CCTGGGAGCTCTCTGGCTAA‑3’,
[0073] RP:5’‑CACTGACTAAAAGGGTCTGAGGG‑3’;
[0074] 后续PCR定量检定步骤。
[0075] CAR拷贝数为CAR修饰免疫治疗中CAR。
[0076] 其中,后续检定步骤根据不同的检测方式进行,本方法中主要步骤为PCR反应体系的配制。
[0077] 其一具体的检测方法如下:
[0078] CAR‑T中CAR含量检测方法,包括下述步骤
[0079] 配制PCR反应体系,其中包含
[0080] 待检样品,
[0081] 探针,其序列为5’‑FAM‑AACCCACTGCTTAAGC‑MGB‑3’,
[0082] 引物,其序列为
[0083] FR:5’‑CCTGGGAGCTCTCTGGCTAA‑3’,
[0084] RP:5’‑CACTGACTAAAAGGGTCTGAGGG‑3’;
[0085] 生成微滴,转移微滴至多孔板,封膜;
[0086] 进行PCR扩增;
[0087] 通过微滴读取仪读取信息。
[0088] 其中,PCR的反应体系主体与其他的体系相近,区别在于其中的探针和/或引物对的类型不同,但也由此导致该检测方法与其他检测方法存在本质区别。
[0089] CAR‑T中CAR拷贝数检测包括测定含量、测定转导率的检测等需要参考拷贝数的检定,通过CAR浓度或CAR拷贝数来表征CAR‑T中CAR含量。
[0090] 本部分第四方面介绍CAR‑T中CAR拷贝数检测产品应用示例:
[0091] 实验说明
[0092] 针对慢病毒HIV保守的前病毒LTR序列设计了探针1和引物对1(FR1,RP1),用于检测系列已知CAR浓度的标准品,结果具有一致性。通过LTR区域序列设计探针和引物对检测效果优于其他区域,其他部分域序列甚至无法起到检测目的。当将检测区域做出微调时并具有合格的检测效果时,也应当在本发明专利权利要求的范围内。同时,我们用针对FMC63的探针2和引物对2(FR2,RP2),针对4‑1BB‑CD3z的探针3和引物对3(FR3,RP3)检测系列已知CAR浓度的标准品,具有一致性。探针、引物对单独使用时,其也具有相近的检测效果。
[0093] 利用针对慢病毒保守的前病毒序列HIV 5’LTR设计了探针1和引物对1(FR1,RP1)、针对FMC63的探针2和引物对2(FR2,RP2)、针对4‑1BB‑CD3z的探针3和引物对3(FR3,RP3)同时检测3例患者回输后不同时间点体内的瑞基奥仑赛CAR拷贝数,只有探针1和引物对1(FR1,RP1)能够检出阳性液滴,已知的引物和探针无法识别瑞基奥仑赛。
[0094] 利用探针1和引物对1(FR1,RP1)检测了人源化CD19、CD19和CD37双靶点,CS1和BCMA双靶点、CD7单靶点等多种CAR,均能检测到特异性的CAR扩增。
[0095] 针对其他CAR修饰的免疫治疗(如CAR‑NK等)也具有类似的结果,均不再赘述。
[0096] 利用探针1和引物对1(FR1,RP1)检测了健康供者的12例样本,具有高灵敏度,检测阈值为70copies/ug DNA。
[0097] 实验流程
[0098] 1.根据NCBI提供的HIV保守的前病毒序列设计了探针1和引物对1(FR1,RP1);针对FMC63的探针2和引物对2(FR2,RP2)、针对4‑1BB‑CD3z的探针3和引物对3(FR3,RP3),如下表:
[0099]
[0100]
[0101] 2.取回输不同CAR‑T细胞产品后患者不同时间点的外周血,裂解红细胞后根据试剂盒(Tiangen,DP304)分离提取DNA,使用NanoDrop微量分光光度计测定核酸浓度及纯度。本实验用到的样品:
[0102]
[0103] 3.配置数字化PCR反应体系,如下表:
[0104]
[0105]
[0106] 4.将20ul样品反应体系充分混匀,加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内,不足8个样本时用20ul 1x buffer control补足,注意不要产生气泡;在DG8 cartridge最底下一排8孔内加入70ul微滴生成油;
[0107] 5.将加好样本和微滴生成油的DG8 cartridge放入holder中,注意缺口方向,盖上胶垫(gasket),注意两侧小孔都要扣牢;
[0108] 6.将holder轻轻平稳放置于微滴生成仪中,开始生成微滴,注意仪器上指示灯状态,一般2分钟内完成;
[0109] 7.微滴生成于cartridge最上面一排孔内,约5秒吸取40ul生成的微滴,再以同样缓慢的速度打入到96孔板内相应位置;
[0110] 8.用预热好的PX1热封仪对其进行封膜(180摄氏度,5秒);
[0111] 9.封膜后在96孔PCR仪上进行PCR扩增,注意升降温速度<2.5摄氏度/秒,推荐反应条件:
[0112]
[0113] 10.将反应完成的96孔板放入plate holder中组装好,注意板斜角方位;
[0114] 11.组装好后轻轻平稳放入微滴读取仪中:打开Quantasoft软件,每次实验之前做一次flush system,之后对96孔板中的样品信息进行setup,包括实验名称、实验类型(ABS,绝对定量)、探针信息等,完成之后进行run,结束之后按照说明书进行分析。
[0115] 实验结果:
[0116] 结果I:三组引物和探针测定标准品的结果。
[0117] 如图1‑4所示,各组均能检出CAR拷贝数,且LTR的探针1和引物对1具具有最好的拟合关系,精度更好。
[0118] 如图1‑3和表1所示。三组引物和探针测定标准品的结果。
[0119] 表1.液滴生成量统计表(events)
[0120]标准品CAR拷贝数 LTR FMC63 4‑1BB‑CD3z
SD1 16380 16087 16611
SD2 18880 16117 17472
SD3 18100 17631 17323
SD4 15686 17299 17553
SD5 16901 18492 17624
SD1 16380 16087 16611
SD2 18880 16117 17472
SD3 18100 17631 17323
SD4 15686 17299 17553
SD5 16901 18492 17624
[0121] 注:将已知浓度的CAR标准品10倍稀释,得到系列标准品SD1、SD2、SD3、SD4、SD5。
[0122] 三组引物和探针所捕获的总微滴数均满足数字化PCR分析的要求(events>12000),且无统计学差异,结果具有可比较性。
[0123] 如图4中,三组引物和探针均能较好的检测出标准品中CAR拷贝数,针对LTR的探针2
1和引物对1具有最佳的拟合关系(k=1.0875,R=0.9991)。
1和引物对1具有最佳的拟合关系(k=1.0875,R=0.9991)。
[0124] 结果II:三组引物和探针测定瑞基奥仑赛的结果。
[0125] 三组均正常生成微滴,只有针对LTR的探针1和引物对1可以准确的检测出瑞基奥仑赛的CAR拷贝数。
[0126] 如图5所示和表2所示,三组微滴生成数相近,但是FMC63、4‑1BB‑CD3z无法准确反应基奥伦赛的CAR拷贝数,只有极个别微滴具有检测反应。
[0127] 表2.三组引物和探针测定瑞基奥仑赛的结果
[0128]
[0129] 结果III:三组引物和探针检测不同CAR‑T产品的结果。
[0130] 如图6和表4所示,三组探针检测表3中四种CAR‑T产品时均能正常生成微滴,只有LTR的引物和探针可以检出全部产品的拷贝数。
[0131] 表3.四种CAR质粒结构
[0132]
[0133] 表4.三组引物和探针测定不同CAR的结果
[0134]
[0135] 针对4种不同靶点的CAR,针对FMC63的探针2和引物对2均无法检测出CAR拷贝数;尽管这4种CAR都以4‑1BB为共刺激结构域,但是由于CAR设计的调整或引物特异性原因,针对4‑1BB‑CD3z的探针3和引物对3无法识别CD7 CAR;针对LTR的探针1和引物对1均可以准确检测出以HIV改造的慢病毒转导的不同靶点和结构的CAR拷贝数。
[0136] 结果IV:针对LTR的探针1和引物对1检测健康阴性样本的结果。
[0137] 针对LTR的探针1和引物对1检测健康样本时均能正常生成微滴,但是均无法检测CAR拷贝数。如图7‑8和表5中所示。
[0138] 表5.LTR的探针1和引物对1检测健康阴性样本的结果
[0139]
[0140] 针对LTR的探针1和引物对1具有较强的特异性,检测阈值为70copies/ug DNA。
[0141] 本领域的技术人员可以明确,在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下,可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。