多肽缀合物和使用方法

摘要

本申请提供了一种包含GLP‑1受体激动剂和肽接头的多肽缀合物，以及包含其的药物组合物。还提供了使用此类物质治疗疾病的方法。

权利要求

1.一种多肽缀合物，其包含多肽以及连接到所述多肽的赖氨酸残基上的清除率降低部分CRM，其中所述多肽的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:118、121、122、123、129、和133，并且其中所述CRM的结构如下所示：

2.根据权利要求1所述的多肽缀合物，其包含下式结构，其中氨基酸残基表示为圆圈中的一个字母缩写：

3.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1或2所述的多肽缀合物的多肽部分。

4.一种载体，其包含根据权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其包含根据权利要求4所述的载体。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

7.一种产生根据权利要求1或2所述的多肽缀合物的方法，其包括在允许根据权利要求

3所述的多核苷酸表达的条件下，培养根据权利要求5所述的宿主细胞，以获得所述多肽缀合物的所述多肽部分。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述多肽部分表达为可溶性蛋白质。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述CRM与所述多肽部分缀合。

11.一种药物组合物，其包含根据权利要求1或2所述的多肽缀合物和药学上可接受的载剂。

12.根据权利要求1或2所述的多肽缀合物在制造用于预防或治疗有需要的受试者的代谢病症的药物中的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述代谢病症为糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、动脉粥样硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、糖尿病肾病、终末期肝病或肝脂肪变性。

14.根据权利要求12所述的用途，其中所述代谢病症为代谢综合征。

15.根据权利要求13所述的用途，其中所述代谢病症为脂肪肝或肝硬化。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述肝硬化为原发性胆汁性肝硬化(PBC)。

17.根据权利要求13所述的用途，其中糖尿病包括一种或多种选自下组的病况：高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、青年的成年发病型糖尿病(MODY)和妊娠期糖尿病。

18.根据权利要求1或2所述的多肽缀合物在制造用于管理有需要的受试者的体重的药物中的用途。

19.根据权利要求1或2所述的多肽缀合物在制造用于减少有需要的受试者的食物摄入量的药物中的用途。

20.根据权利要求1或2所述的多肽缀合物在制造用于减轻有需要的受试者的体重的药物中的用途。

21.根据权利要求12至20中任一项所述的用途，其中所述受试者为人。

22.根据权利要求21所述的用途，其中所述受试者的空腹血糖水平为125mg/dL或更高。

23.根据权利要求21所述的用途，其中所述受试者的身体质量指数(BMI)为至少25。

24.根据权利要求21所述的用途，其中所述药物以不超过每天一次、每3天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次的给药方案施用。

25.根据权利要求21所述的用途，其中所述药物每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两月一次施用。

26.根据权利要求24所述的用途，其中所述给药方案的给药间隔在每3天一次到每月一次的范围内。

27.根据权利要求24所述的用途，其中所述给药方案的给药间隔在每周一次到每月一次的范围内。

28.根据权利要求21所述的用途，其中所述药物经皮下、静脉内或口服施用。

29.根据权利要求12所述的用途，其中所述代谢病症为非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。

说明书

多肽缀合物和使用方法

发明领域

[0001] 本发明涉及多肽缀合物、其药物组合物和使用此类物质预防和/或治疗疾病的方法。

背景技术

[0002] 胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)的主要生物活性片段是衍生自胰高血糖素原肽的翻译后加工的30或31个氨基酸的肽片段(GLP‑1的氨基酸7‑36或7‑37)。最初的GLP‑1产品GLP‑1
刺激胰岛素合成和分泌，并且已显示预防糖尿病，尤其2型糖尿病中的高血糖症。然而，内源
性GLP‑1仅具有大致2分钟的半衰期，这导致GLP‑1的空腹血浆水平仅为0‑15pmol/L。

[0003] 代谢病症通常与胰岛素抵抗、内脏肥胖、致动脉粥样硬化血脂异常等相关，其在世界范围内构成重大且不断升级的公共卫生和临床挑战。然而，代谢疾病的现有治疗面临如
半衰期短和/或功效低的问题。

[0004] 此外，现有的GLP‑1化合物主要通过注射给药，如果给药频率太频繁，患者可能会对自行注射给药产生恐惧。

[0005] 因此，需要用于治疗代谢疾病并减少给药频率的改进的治疗方案。

发明内容

[0006] 本文提供多肽缀合物和包含其的药物组合物，以及用于治疗/预防代谢病症的使用方法。

[0007] 在第一方面，本申请提供一种多肽缀合物，其包含：与肽接头的N端连接的单个生物活性肽，和与肽接头中第一清除率降低部分(CRM)残基缀合的第一CRM，其中生物活性肽
包含GLP‑1受体激动剂，并且第一CRM残基与GLP‑1受体激动剂的C端氨基酸残基相距至少5
个氨基酸残基(不包括CRM残基)。

[0008] 在一些实施方式中，第一CRM残基与生物活性肽的C端氨基酸相距至少10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、35、38、40、45、46、50、55、58、60、65、70、75、78个氨基酸残基(不包括CRM残基)。

[0009] 在某些实施方式中，多肽缀合物中GLP‑1受体激动剂的长度不超过70、60或50个氨基酸残基。在某些实施方式中，多肽缀合物中GLP‑1受体激动剂的长度不超过49、48、47、46、
45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31或30个氨基酸残基。

[0010] 在一些实施方式中，GLP‑1受体激动剂包含GLP‑1。

[0011] 在一些实施方式中，生物活性肽不具有缀合的CRM。

[0012] 在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物是单缀合的，并且具有与肽接头缀合而非与生物活性肽(例如GLP‑1)缀合的CRM。在这些实施方式中的部分实施方式中，与不
具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物相比，本文所提供的此类单缀合
的多肽缀合物具有更高的在人血清白蛋白(HSA)存在下的GLP‑1受体激动活性。在某些实施
方式中，如在相同或相当的分析中所确定，本文所提供的单缀合的多肽缀合物在HSA存在下
激活GLP‑1受体，其EC50不超过索玛鲁肽(semaglutide)在HSA存在下的EC50的50％(或不超
过40％、30％、20％、10％、5％或3％)。在某些实施方式中，如在相同或相当的分析中所确
定，本文所提供的单缀合的多肽缀合物在不存在HSA的情况下激活GLP‑1受体，其EC50与索
玛鲁肽在不存在HSA的情况下的EC50相当(例如为其约20％到约300％)。存在

[0013] 在某些实施方式中，在GLP‑1受体激活的体外实验中，HSA存在的量适合于评定HSA结合对GLP‑1受体激活的影响。

[0014] 在某些实施方式中，如在相同或相当的分析中所确定，本文所提供的单缀合的多肽缀合物结合HSA，其结合亲和力(KD)与索玛鲁肽相当(例如为其约70％到约500％)。

[0015] 在某些实施方式中，与不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本文所提供的单缀合的多肽缀合物具有至少相当的终末半衰期，如
在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中所确定。

[0016] 在一些实施方式中，多肽缀合物是双缀合的多肽缀合物并且进一步包含与第二CRM残基缀合的第二CRM。

[0017] 在一些实施方式中，第二CRM残基在生物活性肽中或在肽接头中。在某些实施方式中，第二CRM残基在GLP‑1肽的K26处。

[0018] 在这些实施方式中的一些中，与不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物相比，本文所提供的双缀合的多肽缀合物在HSA存在下具有相当或可接受的
GLP‑1受体激动剂活性。在某些实施方式中，本文所提供的双缀合的多肽缀合物在HSA存在
下激活GLP‑1受体，EC50不超过不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合
物(如索玛鲁肽)在HSA存在下的EC50的2000％(或不超过1500％、1000％、900％、800％、
700％、600％或500％)，如在相同或相当的分析中所确定。在某些实施方式中，本文所提供
的双缀合的多肽缀合物在不存在HSA的情况下激活GLP‑1受体，EC50与不具有肽接头且具有
在GLP‑1上缀合CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)在HSA存在下的EC50相当(例如不超过
其500％、400％、300％或200％，或甚至更低)，如在相同或相当的分析中所确定。在某些实
施方式中，本文所提供的双缀合的多肽缀合物在HSA存在下以第一EC50，且在不存在HSA的
情况下以第二EC50激活GLP‑1受体，并且第一EC50高于第二EC50但不超过第二EC50的1000
倍，例如第一EC50(在HSA存在下)不超过第二EC50(在不存在HSA的情况下)的900倍、800倍、
700倍、600倍或500倍。在某些实施方式中，在GLP‑1受体激活的体外实验中，HSA存在的量适
合于评定HSA结合对GLP‑1受体激活的影响。

[0019] 在某些实施方式中，本文所提供的双缀合的多肽缀合物以较高结合亲和力结合HSA，表现为KD值与不具有肽接头且在GLP‑1上具有缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁
肽)相比显著更低(例如不超过其50％、40％、30％或20％)，如在相同或相当的分析中所确
定。

[0020] 在某些实施方式中，与不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本文所提供的双缀合的多肽缀合物的终末半衰期延长至少50％、
60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、300％、400％，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中所确定。

[0021] 在某些实施方式中，本文所提供的双缀合的多肽缀合物的血液或血浆或血清浓度保持在多肽缀合物的治疗窗内的时间段，比不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参
比多肽缀合物(如索玛鲁肽)长至少约50％(长60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、
180％、200％、300％或400％)，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中所
确定。

[0022] 在某些实施方式中，与不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本文所提供的双缀合的多肽缀合物提供延长的疗效持续时间，如在
相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中所确定。在某些实施方式中，延长的疗
效持续时间可通过时间效应曲线的曲线下面积(AUC)和/或通过治疗效应的持续时间来表
征。

[0023] 在某些实施方式中，治疗效应包含体重减轻、食物摄入量减少或血糖水平降低(空腹血糖水平或非空腹血糖水平)。在某些实施方式中，与不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀
合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本文所提供的双缀合的多肽缀合物的时间
效应曲线的AUC增加至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中所确定。在某些实施方式中，与不
具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本文所提供
的双缀合的多肽缀合物的治疗效应的持续时间延长至少50％、60％、70％、80％、90％、
100％、120％、150％、180％、200％、300％、400％，如在相当的体内研究条件下且在相同类
型的实验动物中所确定。

[0024] 在一些实施方式中，GLP‑1包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，同时保留SEQ ID NO:1的基本生物活性。

[0025] 在一些实施方式中，GLP‑1相对于SEQ ID NO:1包含不超过9、8、7、6、5或4个取代，同时保留SEQ ID NO:1的基本生物活性。

[0026] 在一些实施方式中，GLP‑1相对于SEQ ID NO:1包含选自下组的位置处的一个或多个突变或由其组成：A8、G22、Q23、E27、K26、A30、K34、R36和H7或其任何组合。

[0027] 在一些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的一个或多个取代或由其组成：A8Aib、G22E、K26R、K34R和R36G或其任何组合。

[0028] 在一些实施方式中，第一CRM残基为赖氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含一个赖氨酸残基。

[0029] 在一些实施方式中，第一和第二CRM残基均为赖氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含两个赖氨酸残基。

[0030] 在一些实施方式中，第二赖氨酸残基在GLP‑1中，并且任选地选自下组：K23、K26、K27、K30和K34。

[0031] 在一些实施方式中，GLP‑1中除CRM残基外的所有赖氨酸残基被取代为非赖氨酸残基，任选地选自下组：精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、丝氨酸
(S)和苏氨酸(T)。

[0032] 在一些实施方式中，第一CRM残基为半胱氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含一个半胱氨酸残基。

[0033] 在一些实施方式中，第一和第二CRM残基均为半胱氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含两个半胱氨酸残基。

[0034] 在一些实施方式中，第二半胱氨酸残基在GLP‑1中，并且任选地选自下组：C23、C26、C27、C30和C34。

[0035] 在一些实施方式中，第一CRM残基为非天然氨基酸残基，并且多肽缀合物仅包含一个非天然氨基酸残基作为CRM残基。

[0036] 在一些实施方式中，第一和第二氨基酸残基为非天然氨基酸残基，并且多肽缀合物仅包含两个非天然氨基酸残基作为CRM残基。

[0037] 在一些实施方式中，GLP‑1包含氨基酸序列X7X8EGTFTSDVSSYLEX22X23AAX26X27FI X30WLVX34GX36G(SEQ ID NO:2)，其中：X7为H、咪唑‑4‑乙酸(IA)或咪唑丙酸(IPA)；X8为A、G、S、V、Aib、T、I或L；X22为G或E；X23为Q、C或K，X26为K、R或C；X27为E、K或C；X30为A、C或K，X34为R、K或C，并且X36为R或G。

[0038] 在一些实施方式中，X7为H，X8为G或Aib，X22为G或E；X23为Q、C或K，X26为K、R或C；X27为E、K或C；X30为A、C或K，X34为K、R或C，并且X36为R或G。

[0039] 在一些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、12、13、15、17、18、20、22、23、25、27、28、30、32、33、35、36、38和40‑44。

[0040] 在一些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3‑6、8‑11、13‑16、18‑21、23‑26、28‑31、33、34、36‑39和184。

[0041] 在一些实施方式中，多肽接头的长度为至少10个氨基酸残基(例如至少12、24、32、40、48、60或80个氨基酸残基)。

[0042] 在一些实施方式中，多肽接头的长度为12‑80个氨基酸残基。

[0043] 在一些实施方式中，除CRM残基以外，肽接头由选自下组的氨基酸残基组成：G、Q、A、E、P、S和T。

[0044] 在一些实施方式中，除CRM残基以外，多肽接头包含重复序列的一个或多个重复或由其组成。

[0045] 在一些实施方式中，重复序列由选自下组的序列组成：SEQ ID NO:45(GQEPGAQP)、SEQ ID NO:46(GAQPGAQP)、SEQ ID NO:47(GQEP)、SEQ ID NO:48(GAQP)、SEQ ID NO:49
(GAQPGQEPGAQP)、SEQ ID NO:50(GAQPGQEP)、SEQ ID NO:51(GEQP)、SEQ ID NO:52(GPQE)、
SEQ ID NO:53(GPEQ)、SEQ ID NO:54(GSEP)、SEQ ID NO:55(GESP)、SEQ ID NO:56(GPSE)、
SEQ ID NO:57(GPES)、SEQ ID NO:58(GQAP)、SEQ ID NO:59(GPAQ)、SEQ ID NO:60(GPQA)、
SEQ ID NO:61(GSQP)、SEQ ID NO:62(GASP)、SEQ ID NO:63(GPAS)、SEQ ID NO:64(GPSA)、
SEQ ID NO:65(GGGS)、SEQ ID NO:66(GSGS)、SEQ ID NO:67(GGGGS)、SEQ ID NO:68
(GQEPGQAP)、SEQ ID NO:69:(GQAPGQEP)、SEQ ID NO:70(SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE
PSEG)、SEQ ID NO:71(SEPATS)、SEQ ID NO:72(GSETPG)、SEQ ID NO:73(TSESAT)、SEQ ID 
NO:74(PESGPG)、SEQ ID NO:75(TSTEPS)和GS。

[0046] 在一些实施方式中，多肽接头包含(重复1)r(重复2)s(重复3)x(重复4)y，其中：重复1、重复2、重复3和重复4通过肽键或通过一个或多个氨基酸残基连接，重复1、重复2、重复
3和重复4独立地，包含选自下组的序列或由其组成：SEQ ID NO:45(GQEPGAQP)、SEQ ID NO:
46(GAQPGAQP)、SEQ  ID  NO:47(GQEP)、SEQ ID NO:48(GAQP)、SEQ  ID NO:49
(GAQPGQEPGAQP)、SEQ ID NO:50(GAQPGQEP)、SEQ ID NO:51(GEQP)、SEQ ID NO:52(GPQE)、
SEQ ID NO:53(GPEQ)、SEQ ID NO:54(GSEP)、SEQ ID NO:55(GESP)、SEQ ID NO:56(GPSE)、
SEQ ID NO:57(GPES)、SEQ ID NO:58(GQAP)、SEQ ID NO:59(GPAQ)、SEQ ID NO:60(GPQA)、
SEQ ID NO:61(GSQP)、SEQ ID NO:62(GASP)、SEQ ID NO:63(GPAS)、SEQ ID NO:64(GPSA)、
SEQ ID NO:65(GGGS)、SEQ ID NO:66(GSGS)、SEQ ID NO:67(GGGGS)、SEQ ID NO:68
(GQEPGQAP)、SEQ ID NO:69(GQAPGQEP)、SEQ ID NO:70(SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP
SEG)、SEQ ID NO:71(SEPATS)、SEQ ID NO:72(GSETPG)、SEQ ID NO:73(TSESAT)、SEQ ID 
NO:74(PESGPG)、SEQ ID NO:75(TSTEPS)和GS，并且在r、s、x和y不同时为0的条件下，r、s、x
和y独立地为选自0到30或0到20的整数。

[0047] 在一些实施方式中，x和y为0，r和s独立地为选自1到30的整数，并且重复1和重复2为选自下组的组合：

[0048] a)重复1包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0049] b)重复1包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0050] c)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成；

[0051] d)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成；

[0052] e)重复1包含SEQ ID NO:49的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0053] f)重复1包含SEQ ID NO:70序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0054] g)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:68的序列或由其组成，以及

[0055] h)重复1包含SEQ ID NO:70的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成。

[0056] 在一些实施方式中，r、x和y为0，s为选自1到30或0到20的整数，并且重复1包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成。

[0057] 在一些实施方式中，y为0，r、s和x独立地为选自1到30的整数，并且重复1、重复2和重复3为选自下组的组合：

[0058] a)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:49的序列或由其组成；并且重复3包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0059] b)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成；并且重复3包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0060] c)重复1包含SEQ ID NO:70的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0061] d)重复1包含SEQ ID NO:70的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成，

[0062] e)重复1包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:58的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，

[0063] f)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:68的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成，

[0064] g)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，以及

[0065] h)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:68的序列或由其组成。

[0066] 在一些实施方式中，r、s、x和y独立地为选自1到30或0到20的整数，并且重复1、重复2、重复3和重复4为选自下组的组合：

[0067] a)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:50的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成，并且重复4包含SEQ ID NO:48的序
列或由其组成，

[0068] b)重复1包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:68的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成，并且重复4包含SEQ ID NO:48的序
列或由其组成，

[0069] c)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:68的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成，并且重复4包含SEQ ID NO:48的序
列或由其组成，

[0070] d)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:58的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，并且重复4包含SEQ ID NO:45的序
列或由其组成，以及

[0071] e)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:69的序列或由其组成，并且重复4包含SEQ ID NO:68的序
列或由其组成。

[0072] 在一些实施方式中，肽接头包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:76‑89，不同之处在于一个残基被CRM残基取代。

[0073] 在一些实施方式中，肽接头包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:90‑117、175和176。

[0074] 在一些实施方式中，多肽缀合物包含选自下组的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:118‑174和177‑183。

[0075] 在一些实施方式中，CRM包含血浆蛋白结合部分、聚合物、Fc、HSA(白蛋白)、Xten序列或PAS序列。

[0076] 在一些实施方式中，CRM包含白蛋白结合部分。

[0077] 在一些实施方式中，白蛋白结合部分包含以下结构：*‑A‑B‑C‑D‑E，其中A、B、C、D和E通过酰胺键互连，并且A的*端连接到多肽复合物中CRM残基的反应性基团，并且其中：

[0078] A选自键、 a、b、c和d独立地为0到1
4的整数，R为氢或‑COOH；

[0079] B选自键、 其中位置α连接位置α’，e为1到4的整数，
2

[0080] C为键或 R 为‑CH2SO3H或‑COOH，f为1到4的整数，n为1到25的整数其中当B不为键时，则位置β’连接位置β，或者当B为键时，则位置β’连接位置α’；

[0081] D选自键、 g和h独立地为0或1，并且R3为H或‑CH2COOH，其中：

[0082] 当B不为键且C为键时，则位置γ’连接位置β；

[0083] 当C不为键时，则位置γ’连接位置γ；并且

[0084] 当B为键且C为键时，则位置γ’连接位置α；

[0085] E为具有下式的酸性基团：

[0086]

[0087] 其中W表示‑(CR4R5)l‑，

[0088] R4和R5独立地选自下组：氢、卤素、氰基、羟基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟烷基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基和羧酰胺，

[0089] R6选自羟基或NR7R8；7 8

[0090] R 和R 独立地选自下组：氢、烷基、羟基和 并且l为10到20、10到18、10到16的整数，例如12、14、16或18且其中：

[0091] 当D不为键，则位置δ连接位置δ’；

[0092] 当C不为键且D为键时，则位置δ连接位置γ；

[0093] 当B为键，C为键且D为键时，则位置δ连接位置β；

[0094] 当A不为键且B、C、D都为键时，则位置δ连接位置α’，

[0095] 或其药学上可接受的盐。

[0096] 在一些实施方式中，其中CRM与赖氨酸残基缀合。

[0097] 在一些实施方式中，A为键。

[0098] 在一些实施方式中，A为键，并且B为键或 其中e为1、2或3。

[0099] 在一些实施方式 中，A为键 ，B为 并且 C为其中位置β’连接位置β，其中e为1、2或3，f为1、2或3，并且n为1或2。在某
些实施方式中，D为键，并且E为具有下式的酸性基团： 在某些实施方式中，
2 6 4 5 4 5
R为‑COOH，并且R为羟基。在某些实施方式中，W表示‑(CRR)l‑，R和R 独立地为氢，l为10
到20、10到18、10到16的整数，例如12、14、16或18。

[0100] 在一些实施方式中，A为键，B为键，并且C为键。

[0101] 在一些实施方式中，A为键，B为键，并且C为 其中f为1、2或3，并且n为1或2。

[0102] 在一些实施方式中，A为 其中a为1、2或3，b为1、2或3，并且c为1或2。

[0103] 在 一 些 实 施 方 式 中 ，A 为 并 且 B 为其中位置α连接位置α’，其中a为1、2或3，b为1、2或3，c为1或2，
并且e为1、2或3。

[0104] 在一些实施方式中，A为 B为并且C为 其中位置α连接位置α’且位置β’连
接位置β，其中a为1、2或3，b为1、2或3，c为1或2，e为1、2或3，f为1、2或3，并且n为1或2。

[0105] 在一些实施方式中，A为 B为并且C为键，其中位置α连接位置α’其中a为1、2或3，b为1、2或3，
c为1或2，并且e为1、2或3。

[0106] 在一些实施方式中，A为 并且B为键，其中a为1、2或3，b为1、2或3，并且c为1或2。

[0107] 在一些实施方式中 ，A为 B为键 ，并且C为其中位置β’连接位置α’，其中a为1、2或3，b为1、2或3，c为1或2，f为1、2或
3，并且n为1或2。

[0108] 在一些实施方式中，A为 B为键，并且C为键，其中a为1、2或3，b为1、2或3，并且c为1或2。

[0109] 在一些实施方式中，D为键。

[0110] 在一些实施方式中，A为 B为C为 并且D为键，其中位置α连接位置α’且位置β’
连接位置β，其中a为1、2或3，b为1、2或3，c为1或2，e为1、2或3，f为1、2或3，并且n为1或2。

[0111] 在一些实施方式中，D为 其中g为0或1，并且h为0或1。

[0112] 在一些实施方式中，A为 B为或键，C为键，并且D为 其中a为1、2或3，b为1、2
或3，c为1或2，e为1、2或3，g为0或1，并且h为0或1，其中当B不为键时，则位置α连接位置α’且位置γ’连接位置β，其中当B为键时，则位置γ’连接位置α’。

[0113] 在一些实施方式中，D为

[0114] 在一些实施方式中，A为 B为C为键或 并且D为 其中当C为
键时，则位置α连接位置α’且位置γ’连接位置β，其中当C不为键时，则位置α连接位置α’，位置β’连接位置β且位置γ’连接位置γ，其中a为1、2或3，b为1、2或3，c为1或2，e为1、2或3，f为1、2或3，并且n为1或2。

[0115] 在一些实施方式中，CRM包含下式结构：

[0116]

[0117] 在一些实施方式中，CRM与半胱氨酸残基缀合。

[0118] 在一些实施方式中，A为 并且B为其中位置α连接位置α’。

[0119] 在一些实施方式中，A为 B为并且C为 其中位置α连接位置α’且位置β’连接
位置β，其中a为1、2或3，b为1、2或3，c为1或2，d为1、2或3，f为1、2或3，并且n为1或2。在某些
2
实施方式中，D为键，并且E为具有下式的酸性基团： 在某些实施方式中，R
6 4 5 4 5
为‑COOH，并且R 为羟基。在某些实施方式中，W表示‑(CRR)l‑，R 和R独立地为氢，l为10到
20、10到18、10到16的整数，例如12、14、16或18。

[0120] 在一些实施方式中，A为 B为 C为并且D为键，其中位置α连接位置α’且位置β’连接位置β，其中a为1、2或3，
b为1、2或3，c为1或2，d为1、2或3，f为1、2或3，并且n为1或2。

[0121] 在一些实施方式中，A为 并且B为 其中位置α连接位置α’，其中d为1、2或3，并且e为1、2或3。

[0122] 在一些实施方式中，A为 B为 并且C为键，其中位置α连接位置α’，其中d为1、2或3，并且e为1、2或3。

[0123] 在一些实施方式中，A为 B为 C为键，并且D为 其中位置α连接位置α’且位置γ’连接位置β，其中d为1、2或3，e
为1、2或3，g为0或1，并且h为0或1。

[0124] 在一些实施方式中，CRM包含下式结构：

[0125]

[0126] 在第二方面，本申请提供一种多核苷酸，其编码第一方面的多肽缀合物的多肽部分(或其片段)。

[0127] 在第三方面，本申请提供一种载体，其包含第二方面的多核苷酸。

[0128] 在第四方面，本申请提供一种宿主细胞，其包含第三方面的载体。

[0129] 在一些实施方式中，宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

[0130] 在第五方面，本申请提供一种产生第一方面的多肽缀合物的方法，其包括在允许第二方面的多核苷酸表达的条件下培养第四方面的宿主细胞以获得多肽缀合物的多肽部
分。

[0131] 在一些实施方式中，宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

[0132] 在一些实施方式中，多肽部分表达为可溶性蛋白质。

[0133] 在一些实施方式中，所述方法进一步包括将CRM与多肽部分缀合。

[0134] 在第六方面，本申请提供一种药物组合物，其包含根据第一方面的多肽缀合物和药学上可接受的盐。

[0135] 在第七方面，本申请提供一种预防或治疗有需要的受试者的代谢病症的方法，其包括施用治疗有效量的第一方面的多肽缀合物。

[0136] 在第八方面，本申请提供一种管理有需要的受试者的体重的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物，从而管理受试者的体重。

[0137] 在第九方面，本申请提供一种减少有需要的受试者的食物摄入量的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物，从而减少受试者的食物摄入量。

[0138] 在第十方面，本申请提供一种减轻有需要的受试者的体重的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物，从而减轻受试者的体重。

[0139] 在某些实施方式中，代谢病症为糖尿病、肥胖症、超重、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、心血管如血脂异常、动脉粥样硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、糖尿病肾病、妊娠期
糖尿病、代谢综合征如代谢综合征X、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、终末期肝病、肝脂肪变性
(脂肪肝)、肝硬化或原发性胆汁性肝硬化(PBC)。

[0140] 在某些实施方式中，糖尿病为任何形式的糖尿病，包括但不限于高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低、1型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、青年的成年发病型糖尿病(MODY)、
妊娠期糖尿病和HbA1C水平升高。

[0141] 在某些实施方式中，受试者为人。

[0142] 在某些实施方式中，受试者的空腹血糖水平为125mg/dL或更高。

[0143] 在某些实施方式中，受试者的身体质量指数(BMI)为至少或高于25。

[0144] 在某些实施方式中，多肽缀合物以不超过每天一次、每3天一次或每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次的给药方案施用。

[0145] 在某些实施方式中，多肽缀合物每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两月一次施用。

[0146] 在某些实施方式中，给药方案的给药间隔在约每3天一次到约每月一次，或约每周一次到约每月一次的范围内。

[0147] 在某些实施方式中，多肽缀合物皮下或静脉内或口服施用。

[0148] 在整个本申请中，冠词“一(a/an)”和“所述”在本文中用于指所述冠词的一个(种)或超过一个(种)(即，至少一个(种))语法对象。举例来说，“融合多肽”意指一个融合多肽或
多于一个融合多肽。

[0149] 在本申请中出现一系列叙述的数值的所有情况下，应理解，任何叙述的数值可以是数值范围的上限或下限。应进一步理解，本发明涵盖所有此类数值范围，即，具有数值上
限和数值下限的组合的范围，其中上限和下限中的每一者的数值可以是本文中叙述的任何
数值。本文所提供的范围理解为包括范围内的所有值。举例来说，1‑10理解为包括所有值1、
2、3、4、5、6、7、8、9和10，以及适当时分数值。类似地，由“至少”限定的范围理解为包括提供的下限值和所有更高的数字。

[0150] 如本文所用，“约”理解为包括在平均值的三个标准差内或在特定技术中的标准公差范围内。在某些实施方式中，约理解为不超过0.5的变化。

[0151] 冠词“一”在本文中用于指所述冠词的一个或多于一个(即，指至少一个)语法对象。举例来说，“一元件”意指一个元件或多于一个元件。

[0152] 术语“包括”在本文中用以意指短语“包括但不限于”且可与所述短语互换使用。类似地，“如”在本文中用以意指短语“如但不限于”且可与所述短语互换使用。

[0153] 除非上下文另外明确指示，否则术语“或”在本文中包含地使用以意指术语“和/或”且可与所述术语互换使用。

附图说明

[0154] 图1A到1C显示分子001、002和012在C57BL/6小鼠中的体内活性。为了评估体重变化，对10周龄雄性C57BL/6小鼠用待测药物进行皮下注射给药一次。图1A显示分子001给药
后第1天到第8天的体重减轻。图1B显示分子002给药后第1天到第8天的体重减轻。图1C显示
分子012或分子001给药后第1天到第8天的体重减轻。图1D显示分子007、008、012和016给药
后第1天到第8天的体重减轻。数据指示为平均值和标准误差(SEM)。索玛鲁肽作为比较对照
平行测试。

[0155] 图2A、2B和2C显示分子001、002和012在db/db小鼠中的体内活性。图2A显示分子001单次剂量给药后的空腹血糖。图2B显示分子002单次剂量给药后的空腹血糖。数据指示
为平均值和标准误差(SEM)。图2C显示分子012单次剂量给药后的空腹血糖。为了评估血糖，
10周龄雄性db/db小鼠用所示GLP‑1多肽缀合物以所示剂量皮下施用。在不同时间测量空腹
血糖(图2A和2B)或非空腹血糖(图2C)，并且每个组使用五只动物。Δ血糖是血糖减去基线
水平。数据指示为平均值和标准误差(SEM)。

[0156] 图3A和3B显示在饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中的体内功效。为了评估各个GLP‑1多肽缀合物对体重、食物摄入量和血糖水平的影响，22周龄DIO小鼠(摄入高脂肪饮食13周的
C57BL/6小鼠)每隔一天用不同浓度的所示GLP‑1多肽缀合物皮下施用，持续25天。图3A显示
在10、30和100nmol/kg的分子012的剂量滴定的情况下的体重变化。图3B显示给药后的空腹
血糖变化。数据表示为平均值和标准误差(SEM)。

[0157] 图4A到图4L显示本申请中公开的所有序列。

具体实施方式

[0158] 以下对本发明的描述仅旨在说明本发明的各种实施方式。如此，所讨论的具体修改不应被解释为对本发明范围的限制。对本领域的技术人员将显而易见的是，可以在不脱
离本发明的范围的情况下作出各种等效物、变化和修改，并且应理解，此类等效实施方式将
包括在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用的
方式并入本文中。

[0159] 定义

[0160] 如本文所用，术语“氨基酸”是指含有胺(‑NH2)和羧基(‑COOH)官能团以及每种氨基酸特有的侧链的有机化合物。

[0161] 如本文所用，术语“天然存在的”氨基酸残基是指在天然蛋白质或肽中发现的氨基酸残基，如果其结构允许D和L立体异构体形式，则均呈此类立体异构形式。天然存在的氨基
酸残基的实施例包括但不限于20种标准氨基酸，包括甘氨酸(Gly或G)、丙氨酸(Ala或A)、缬
氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、丝氨酸(Ser或S)、半胱氨酸(Cys或C)、
苏氨酸(Thr或T)、蛋氨酸(Met或M)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)、酪氨酸(Tyr或Y)、
色氨酸(Trp或W)、组氨酸(His或H)、赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)、天冬氨酸(Asp或D)、
谷氨酸(Glu或E)、天冬酰胺(Asn或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)，以及其天然类似物，如刀豆氨
酸、吡咯赖氨酸(PYL)、硒代半胱氨酸、吡咯啉‑羧基‑赖氨酸(PCL)、肌氨酸、β‑丙氨酸、磷酸丝氨酸、γ‑羧基谷氨酸和鸟氨酸。呈D立体异构体的天然存在的氨基酸残基的实施例包括
例如D‑天冬氨酸、D‑丝氨酸、D‑半胱氨酸、D‑丙氨酸、D‑谷氨酸等。

[0162] “氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基以及R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲
基锍。此类类似物具有修饰的R基(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但将保留与天然存在的
氨基酸相同的基本化学结构。

[0163] 如本文所用，“非天然”氨基酸残基是指未在自然界中发现的任何氨基酸残基，包括但不限于修饰的氨基酸残基和/或氨基酸模拟物，氨基酸模拟物不是已知天然存在的氨
基酸中的一者，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。修饰的氨基酸残基或模拟物
可通过添加化学实体(如碳水化合物基团、磷酸基、法呢基、异法呢基、脂肪酸基和用于缀合
的接头)、官能化或其它修饰等来产生。非天然氨基酸还可指通过化学合成制造的氨基酸。
示范性非天然氨基酸包括但不限于2‑氨基异丁酸(Aib)、咪唑‑4‑乙酸(IA)、咪唑丙酸
(IPA)、α‑氨基丁酸(Abu)、叔丁基甘氨酸(Tle)、β‑丙氨酸、3‑氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、去氨基组氨酸(缩写为DesaminoHis，别名咪唑丙酸，缩写为lmpr)、如β‑丙氨酸的氨基酸
β类似物、2‑氨基‑组氨酸、β‑羟基‑组氨酸、高组氨酸、Nα‑乙酰‑组氨酸、α‑氟‑甲基‑组氨酸、α‑甲基‑组氨酸、α,α‑二甲基‑谷氨酸、间CF3‑苯丙氨酸、α,β‑二氨基丙酸(缩写为Dap)、3‑吡啶基丙氨酸、2‑吡啶基丙氨酸或4‑吡啶基丙氨酸、(1‑氨基环丙基)羧酸、(1‑氨基环丁基)‑
羧酸、(1‑氨基环戊基)羧酸、(1‑氨基环己基)羧酸、(1‑氨基环庚基)羧酸以及(1‑氨基环辛
基)羧酸。

[0164] 将非天然氨基酸引入到多肽中可通过以下中所描述的技术实现：Wang等人《,科学(Science)》292:498‑500,2001；Deiters等人《, 美国化学会志(J Am Chem Soc)》125:
11782‑1 1783,2003；Wang和Schultz《, 科学》301:964‑967,2003；Zhang等人《, 科学》303:
371‑373,2004或美国专利第7,083,970号。简单来说，这些表达系统中的一些涉及定点诱变
以将终止密码子(如琥珀(UAG)、赭石(UAA)和蛋白石(UGA)密码子)引入到编码本申请的融
合多肽的开放阅读框中。也可将其它密码子，如四碱基密码子(例如AGGA、AGGU、CGGU、CGCU、
CGAU、CCCU、CUCU、CUAU和GGGU)、五碱基密码子、六碱基密码子等引入到非天然氨基酸的表
达系统中。然后将此类表达载体引入到可利用对引入的终止密码子或其它密码子具特异性
且携带所选非天然氨基酸的tRNA的宿主中。再例如，非天然氨基酸可化学合成并且通过如
酰化的化学反应插入到多肽中或连接到多肽。

[0165] “序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大数目的相同氨基酸(或核酸)之后，候选序列中的氨基酸(或核酸)残基与参考序列中的氨基酸
(或核酸)残基相同的百分比。换句话说，氨基酸序列(或核酸序列)的序列同一性百分比
(％)可以通过将相对于其比较的参考序列相同的氨基酸残基(或碱基)的数目除以候选序
列或参考序列中氨基酸残基(或碱基)的总数(以较短者为准)来计算。氨基酸残基的保守取
代不视为相同残基。出于确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的目的进行的比对可例如
使用可公开获得的工具，如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心
(U.S.National Center for Biotechnology Information，NCBI)的网站上获得，另参见
Altschul S.F.等人《, 分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,215:403‑410(1990)；Stephen F.
等人《,核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,25:3389‑3402(1997))、ClustalW2(可在欧洲生
物信息研究所(European Bioinformatics Institute)网站上获得，另参见Higgins D.G.
等人《,酶学方法(Methods in Enzymology)》,266:383‑402(1996)；Larkin M.A.等人《, 生
物信息学(Bioinformatics)》(英格兰牛津(Oxford,England)),23(21):2947‑8(2007)))和
ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现。本领域的技术人员可使用所述工具提供的默认参
数，或可自定义适于比对的参数，例如通过选择合适算法进行。

[0166] 关于氨基酸序列的“保守取代”是指用具有相似生理化学特性的侧链的不同氨基酸残基置换氨基酸残基。举例来说，可在具有疏水性侧链的氨基酸残基(例如Met、Ala、Val、
Leu和Ile)间、具有中性亲水性侧链的残基(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)间、具有酸性侧链
的残基(例如Asp、Glu)间、具有碱性侧链的氨基酸(例如His、Lys和Arg)间或具有芳香族侧
链的残基(例如Trp、Tyr和Phe)间进行保守取代。如本领域中已知，保守取代通常不会引起
蛋白质构象结构的显著变化，并且因此可保留蛋白质的生物活性。

[0167] 如本文所用，术语“功能形式”是指亲本分子的不同形式(如变体、片段、融合体、衍生物和模拟物)，其尽管在氨基酸序列或化学结构中具有差异，但仍保留亲本分子的基本生
物活性。如本文所用，表述“保留基本生物活性”意指展现亲本分子的生物活性的至少一部
分(例如不小于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或全部。亲本多肽的功能
形式可包括天然存在的变体形式和非天然存在的形式，如通过重组方法或化学合成获得的
那些。功能形式可含有非天然氨基酸残基。

[0168] 如本文所用，术语“变体”是指与亲本多肽具有至少70％序列同一性的多肽。变体与亲本肽的不同之处可在于一个或多个氨基酸残基。举例来说，变体可具有亲本多肽的一
个更多氨基酸残基的取代、添加、缺失、插入或截短。

[0169] 如本文所用，术语“片段”是指任何长度的亲本多肽的部分序列。片段仍可保留亲本多肽的至少部分功能。

[0170] 如本文所用，术语“衍生物”是指化学修饰的多肽或融合多肽，其中一个或多个明确限定数目的取代基已共价连接到多肽或融合多肽的一个或多个特定氨基酸残基。示范性
化学修饰可以是例如一个或多个氨基酸的烷基化、酰化、酯化、酰胺化、磷酸化、糖基化、标
记、甲基化或与一个或多个部分缀合。

[0171] 如本文所用，术语“模拟物”是指充当氨基酸、肽、多肽或融合多肽的替代物的分子结构。举例来说，如本文所用，氨基酸模拟物可以是合成结构(已知或未知)，其可为或可不
为氨基酸，但保留亲本氨基酸的功能特征，同时氨基酸模拟物的结构不同于亲本氨基酸的
结构。实施例包括酰胺的甲基丙烯酰基或丙烯酰基衍生物、β‑、γ‑、δ‑亚氨基酸(如哌啶‑4‑甲酸)等。

[0172] 如本文所用，病况的“治疗(treating/treatment)”包括预防或减轻病况，减缓病况的发作或发展速率，降低罹患病况的风险，预防或延迟与病况相关的症状的发展，减少或
结束与病况相关的症状，产生病况的完全或部分消退，治愈病况或其某一组合。

[0173] 如本文所用，术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以引起所述蛋白质表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其携带的基因
元件在宿主细胞内表达。载体的实施例包括质粒；噬菌粒；粘粒；人工染色体，如酵母人工染
色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)；噬菌体，如λ噬菌体或M13
噬菌体；和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、
腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒
(例如SV40)。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增
强子序列、可选元件和报告基因。另外，载体可以含有复制起点。载体还可以包括有助于其
进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。载体可以是表达载体或克
隆载体。本申请提供载体(例如表达载体)，其含有本文所提供的编码融合多肽的核酸序列、
可操作地连接到所述核酸序列的至少一个启动子(例如SV40、CMV、EF‑1α)和至少一个选择
标记。载体的实施例包含但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病
毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体
和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18‑T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD‑Hyg‑GSeu、
pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV‑L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV‑SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、
pEF‑1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF‑Bos等。

[0174] 如本文所用，短语“宿主细胞”是指已将外源多核苷酸和/或载体引入其中的细胞。

[0175] 术语“药学上可接受的”指示，指定载剂、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐一般在化学上和/或物理上与构成配制物的其它成分相容，并且在生理上与其接受者相容。

[0176] 如本文所用，术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”是指需要诊断、预后、改善、预防和/或治疗疾病或病症的人或非人动物，包括哺乳动物或灵长类动物。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜，以及动物园、体育或玩赏动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等。

[0177] 多肽缀合物

[0178] 在一个方面，本申请提供一种多肽缀合物，其包含：与肽接头的N端连接的单个生物活性肽，和与肽接头中第一清除率降低部分(CRM)残基缀合的第一CRM，其中：生物活性肽
包含GLP‑1受体激动剂，并且第一CRM残基与GLP‑1受体激动剂的C端氨基酸残基相距至少5
个氨基酸残基(不包括CRM残基)。

[0179] 术语“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指通过如肽键的共价键连接的氨基酸残基的聚合物。如本文所提供的肽或多肽可包含天然存在的氨基酸残基或非天然氨基
酸残基，或两者。本文所提供的多肽和肽可包含任何合适长度的氨基酸残基，例如长度为至
少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸残基。

[0180] 多肽缀合物包含单个，即仅一个生物活性肽。关于生物活性肽的“单个”意指多肽缀合物不含分别连接到肽接头的两个或更多个不同的生物活性肽。然而，单个生物活性肽
可包括来自不同生物活性肽、融合在一起(例如作为杂合体或嵌合体)的片段或部分，只要
这些部分整合为一个肽且不分别连接到接头即可。然而，如果两个不同生物活性肽分别连
接到接头的N端和C端，则不是如本申请中所使用的单个生物活性肽。

[0181] 如本文所用，术语“生物活性肽”意指具有生物功能或活性，例如生理功能或治疗功能的肽。在某些实施方式中，生物活性肽具有治疗活性。单独时不具有生物功能的肽不是
生物活性肽。举例来说，肽接头不是生物活性肽，除非其具有其自身的生物功能或活性，例
如单独使用时。

[0182] 生物活性肽包含胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)受体激动剂。

[0183] 术语“胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)”(也称为GLP1R)是在胰腺β细胞和脑神经元上发现的受体蛋白，包含一个细胞外结构域和一个跨膜结构域。细胞外结构域可结合GLP‑1的C
端螺旋，并且跨膜结构域可结合GLP‑1的N端区。GLP‑1受体通过增强胰岛素分泌参与血糖水
平控制。当在脑中表达时，GLP‑1受体还可参与食欲控制。

[0184] 如本文所用，术语“胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)受体激动剂”或“GLP‑1受体激动剂”是指能够结合并且激活GLP‑1受体的分子。GLP‑1受体激动剂可引发与天然配体类似或为其
部分的GLP‑1受体反应的量值。

[0185] 如本文所用，术语“清除率修饰部分”或“CRM”是指可改变一种或多种药代动力学(PK)特性(例如延长体内半衰期)的部分。CRM的实施例可包括但不限于脂肪酸、聚乙二醇
(PEG)、葡萄糖醛酸或其它基于糖的接头，极性、带正电或负电的基团，其可提高丁二酰亚胺
基环的水解率并且降低或最小化反向迈克尔(Michael)反应的速率，因此降低或最小化药
物和接头基团从生物活性肽损失到其它含硫醇蛋白质和小分子的比率。

[0186] 如本文所用，“CRM残基”是指与CRM缀合的氨基酸残基。

[0187] 如本文所用，术语“缀合物”是指由两个或更多个分子连接在一起形成一个物理实体而得到的化合物。举例来说，本申请的缀合物意指作为多肽与一个或多个清除率修饰部
分接合在一起的得到的化合物。分子可通过共价键、非共价键、接头、化学修饰或蛋白质融
合或通过本领域的技术人员已知的任何手段连接在一起。优选地，分子可通过共价键连接
在一起。接合可以是永久性的或可逆的。在一些实施方式中，可包括某些可裂解或不可裂解
连接。

[0188] 尽管CRM与GLP‑1受体激动剂的缀合可延长GLP‑1受体激动剂的半衰期，但也可能不利地影响GLP‑1受体激动剂的生物活性，使其活性低于未缀合的参照物。举例来说，索玛
鲁肽，一种缀合的GLP‑1衍生物，具有显著延长的半衰期，但相对于其未缀合参照物，其在人
血清白蛋白(HSA)存在下，GLP‑1受体结合受到939倍的损失(《药物化学杂志
(J.Med.Chem.)》2015,58,7370‑7380)。

[0189] 然而，发明人出乎意料地发现，包含GLP‑1受体激动剂的某些CRM缀合的多肽可以既具有延长的半衰期也具有保留的生物活性，如果CRM缀合到在GLP‑1受体激动剂之外的连
接到其C末端的肽接头上的话。有意思的是，发明人发现，GLP‑1受体激动剂的C端与缀合位
点之间的距离尤其重要。如果肽接头上的CRM缀合到靠近GLP‑1受体激动剂的C端的位置处，
则其将显著降低生物活性，甚至可能比在GLP‑1受体激动剂自身上缀合还要低得多。然而，
如果缀合到足够远离GLP‑1受体激动剂的C端的位置处，则CRM缀合的GLP‑1受体激动剂可以
既具有延长的半衰期又具有保留的生物活性。上述预料不到的效果在某些GLP‑1受体激动
剂和某些CRM中被发现。

[0190] 在某些实施方式中，第一CRM残基与GLP‑1受体激动剂的C端氨基酸残基相距至少10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、35、38、40、45、46、50、55、58、60、65、
70、75或78个氨基酸残基(不包括CRM残基)。在某些实施方式中，第一CRM残基与GLP‑1受体
激动剂的C端氨基酸之间的距离在10到120、15到120、20到120、25到120、30到120、31到120、
32到120、33到120、34到120、35到120、36到120、37到120、38到120、39到120、40到120、30到
80、31到80、32到80、33到80、34到80、35到80、36到80、37到80、38到80、39到80或40到80之
间。

[0191] 在某些实施方式中，多肽缀合物中GLP‑1受体激动剂的长度不超过70、60或50个氨基酸残基。在某些实施方式中，多肽缀合物中GLP‑1受体激动剂的长度不超过49、48、47、46、
45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31或30个氨基酸残基。

[0192] 在某些实施方式中，多肽缀合物中的GLP‑1受体激动剂包含或为本申请中提供的GLP‑1。在一些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物中的GLP‑1包含选自下组的氨基酸序
列：SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、12、13、15、17、18、20、22、23、25、27、28、30、32、33、35、36、38、
40‑44和184。在某些实施方式中，多肽缀合物中的GLP‑1包含SEQ ID NO:3(8Aib、34R、36G)
或SEQ ID NO:SEQ ID NO:8(8Aib、22E、34R、36G)的氨基酸序列或由其组成。

[0193] 不希望受任何理论束缚，据信CRM(或脂肪酸)与GLP‑1的缀合会降低其在HSA存在下的活性。举例来说，GLP‑1活性降低在索玛鲁肽中被报道过，索玛鲁肽具有与GLP‑1(8Aib、
36R)的K26缀合的脂肪酸，并且与其未缀合的参照物相比，显示在HSA存在下活性显著降低。
由于HSA存在于人血液中并且在生理条件下不可避免，因此认为，在HSA存在下，GLP‑1受体
激动剂活性的降低会削弱蛋白质缀合物的治疗活性。然而，尽管存在CRM缀合，但本文所提
供的一些多肽缀合物却可在HSA存在下保留大部分GLP‑1活性。在此类实施方式中，本文所
提供的多肽缀合物是单缀合的，并且具有与肽接头缀合而非与生物活性肽(例如GLP‑1)缀
合的CRM。

[0194] 在这些实施方式中的部分实施方式中，与不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物相比，本文所提供的此类单缀合的多肽缀合物具有更高的在HSA存在
下的GLP‑1受体激动剂活性。在某些实施方式中，如本领域中已知，在HSA存在下的GLP‑1受
体激动剂活性可通过GLP‑1受体激活的体外分析，无细胞分析(如cAMP分析)或基于细胞的
分析(如报告细胞分析)来确定。在某些实施方式中，参比多肽缀合物为索玛鲁肽。在某些实
施方式中，如在相同或相当的分析中所确定，本文所提供的单缀合的多肽缀合物在人血清
白蛋白(HSA)存在下激活GLP‑1受体，其EC50不超过索玛鲁肽在HSA存在下的EC50的50％(或
不超过40％、30％、20％、10％、5％或3％)。在某些实施方式中，如在相同或相当的分析中确
定，本文所提供的单缀合的多肽缀合物在不存在HSA的情况下激活GLP‑1受体，其EC50与索
玛鲁肽在不存在HSA的情况下相当(例如为其20％到300％)。在某些实施方式中，人血清白
蛋白(HSA)的量允许评定HSA结合对GLP‑1受体激活的影响。在某些实施方式中，GLP‑1受体
激活的体外分析在至少0.5％、1％、1.2％、1.5％、1.8％或2％HSA存在下进行。

[0195] 在某些实施方式中，本文所提供的单缀合的多肽缀合物结合HSA，结合亲和力(KD)与索玛鲁肽相当(例如为其约70％到约500％)，如在相同或相当的分析中确定。

[0196] 在某些实施方式中，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中确定，与不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本
文所提供的单缀合的多肽缀合物具有至少相当的终末半衰期。适用于确定终末半衰期的动
物包括例如小鼠、大鼠、小型猪或猴。在某些实施方式中，在合适的动物中，在以适合于提供
疗效的剂量单剂量静脉内施用或皮下施用或口服施用后，确定终末半衰期。

[0197] 在某些实施方式中，多肽缀合物进一步包含与第二CRM残基缀合的第二CRM。换句话说，本申请还提供双缀合的多肽缀合物。发明人出乎意料地发现，第二CRM缀合可进一步
延长多肽缀合物的半衰期。在某些实施方式中，具有第一和第二CRM缀合两者的双缀合的多
肽缀合物可具有延长的半衰期，其比仅具有一个CRM缀合的对应多肽缀合物(例如索玛鲁
肽)长至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍或甚至更长。

[0198] 第二CRM残基可处于任何合适的位置。在某些实施方式中，第二CRM残基在GLP‑1受体激动剂中或在肽接头中。

[0199] 在某些实施方式中，第二CRM残基在GLP‑1肽的K26处。据报道，在GLP‑1肽上与两个脂肪酸部分缀合可显著降低活性，或者甚至使缀合的GLP‑1肽失去活性。因此，发明人出乎
意料地发现，在GLP‑1(例如K26)上以及在足够远离GLP‑1肽C端的肽接头上都进行缀合时，
可以使脂肪酸缀合对GLP‑1多肽在HSA存在下的生物活性的负面影响最小化。

[0200] 在这些实施方式中的部分实施方式中，与不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物相比，本文所提供的此类双缀合的多肽缀合物具有相当的或者可接
受的在HSA存在下的GLP‑1受体激动剂活性。在某些实施方式中，如在相同或相当的分析中
所确定，本文所提供的双缀合的多肽缀合物在HSA存在下可激活GLP‑1受体，其EC50不超过
不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)在HSA存在下的
EC50的2000％(或不超过1500％、1000％、900％、800％、700％、600％或500％)。在某些实施
方式中，如在相同或相当的分析中所确定，本文所提供的双缀合的多肽缀合物在不存在HSA
的情况下可激活GLP‑1受体，其EC50与不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多
肽缀合物(如索玛鲁肽)的EC50相当(例如不超过其500％、400％、300％或200％，或甚至更
低)。在某些实施方式中，本文所提供的双缀合的多肽缀合物在HSA存在下以第一EC50，且在
不存在HSA的情况下以第二EC50激活GLP‑1受体，并且第一EC50高于第二EC50但不超过第二
EC50的1000倍，例如第一EC50(在HSA存在下)不超过第二EC50(在不存在HSA的情况下)的
900倍、800倍、700倍、600倍或500倍。在某些实施方式中，在GLP‑1受体激活的体外实验中，
HSA存在的量适合于评定HSA结合对GLP‑1受体激活的影响。在某些实施方式中，GLP‑1受体
激活的体外分析在允许评定HSA结合对GLP‑1受体激活的影响的合适量的人血清白蛋白
(HSA)存在下进行。在某些实施方式中，GLP‑1受体激活的体外分析在至少0.5％、1％、
1.2％、1.5％、1.8％或2％HSA存在下进行。

[0201] 在某些实施方式中，如在相同或相当的分析中确定，本文所提供的双缀合的多肽缀合物以较高结合亲和力结合HSA，其KD值显著低于(例如不超过其50％、40％、30％或
20％)不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)。

[0202] 在某些实施方式中，与不具有肽接头且具有在生物活性肽(例如GLP‑1)上缀合的CRM的参比多肽缀合物相比，本文所提供的双缀合的多肽缀合物具有增强的药代动力学特
性，其中药代动力学特性由在向受试者施用治疗有效剂量之后测量多肽缀合物的血液浓度
来确定。

[0203] 在某些实施方式中，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中确定，与不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本
文所提供的双缀合的多肽缀合物的终末半衰期延长至少50％、60％、70％、80％、90％、
100％、120％、150％、180％、200％、300％或400％。适用于终末半衰期确定的动物包括例如
小鼠、大鼠、小型猪或猴。在某些实施方式中，在合适的动物中在以适合于提供疗效的剂量
单剂量静脉内施用或皮下施用后确定终末半衰期。

[0204] 在某些实施方式中，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中确定，本申请所提供的双缀合的多肽缀合物的血液或血浆或血清浓度保持在多肽缀合物的治
疗窗内的时间段，比不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛
鲁肽)长至少约50％(长60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、300％或
400％)。如本文所用，“治疗窗”意指多肽缀合物在血液或血浆或血清中的对待治疗的病况
提供治疗益处或功效而无不可接受的毒性的浓度水平范围。浓度水平的范围可以从产生治
疗效应的最小浓度到提供治疗效应但不导致不可接受的毒性的最大浓度。

[0205] 在某些实施方式中，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中确定，与不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本
文所提供的双缀合的多肽缀合物提供延长的疗效持续时间。此类延长的疗效可由时间效应
曲线的曲线下面积(AUC)表征，其可在单剂量或重复剂量后绘制，所述剂量适合于在患有代
谢病况的受试者(例如疾病模型动物)中提供预期治疗效果。延长的疗效持续时间还可由治
疗效应的持续时间表征。

[0206] 在某些实施方式中，治疗效应包含体重减轻、食物摄入量减少或血糖水平降低(空腹血糖水平或非空腹血糖水平)。在某些实施方式中，如在相当的体内研究条件下且在相同
类型的实验动物中确定，与不具有肽接头且具有在GLP‑1上缀合的CRM的参比多肽缀合物
(如索玛鲁肽)相比，本文所提供的双缀合的多肽缀合物的时间效应曲线的AUC增加至少
50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％。在某些实施方式中，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中确定，与不具有肽接头且具有在GLP‑1
上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本文所提供的双缀合的多肽缀合物的
治疗效应的持续时间延长至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、
200％、300％、400％。在某些实施方式中，用于治疗效应的实验动物是疾病模型动物，如db/
db小鼠或饮食诱导肥胖(DIO)动物。

[0207] GLP‑1受体激动剂

[0208] GLP‑1受体激动剂可包括受体的天然配体以及展现与天然配体的激动剂活性相当或不低于其30％、40％或50％的激动剂活性的人工设计或修饰的分子。在某些实施方式中，
GLP‑1受体激动剂包含天然GLP‑1、胃泌酸调节素、肠促胰岛素类似物(exendin)‑4、艾塞那
肽(exenatide)、贝那格鲁肽(beinaglutide)、艾非培伦肽(efpeglenatide)、兰格伦肽
(langlenatide)、索玛鲁肽、他司鲁肽(taspoglutide)、培阿帕度肽(pegapamodutide)、利
拉鲁肽(liraglutide)、阿必鲁肽(albiglutide)、杜拉鲁肽(dulaglutide)或利塞那肽
(lixisenatide)的氨基酸序列。

[0209] 在某些实施方式中，GLP‑1受体激动剂包含GLP‑1。

[0210] 如本文所用，术语“胰高血糖素样肽‑1”或“GLP‑1”旨在广泛涵盖天然GLP‑1肽和其所有功能形式，如其功能变体、片段、融合体、衍生物和模拟物。

[0211] 如本文所用，术语“天然GLP‑1肽”是指天然人胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1(7‑37))，其序列在SEQ ID NO:1中列出。如本文所用，当提及SEQ ID NO:1(即GLP‑1(7‑37))中的特定
氨基酸残基时，遵循GLP‑1(1‑37)的编号。换句话说，SEQ ID NO:1对应于GLP‑1(7‑37)，并且因此SEQ ID NO:1中的第1残基(其为组氨酸(H))称为7H，意指其对应于GLP(1‑37)中的第7
残基；并且SEQ ID NO:1中的第31残基(其为甘氨酸(G))称为37G，意指其对应于GLP(1‑37)
中的第37残基。

[0212] 天然GLP‑1肽的功能形式能够以与天然GLP‑1肽的水平相当，或不低于其约20％(或不低于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)的水平激活GLP‑1受体。GLP‑1受体的激活典型地启动信号转导通路，产生促胰岛素作用或如本领域中已知的其它生理效应。天然
GLP‑1肽的功能形式可相对于SEQ ID NO:1含有一个或多个取代、添加或缺失。天然GLP‑1肽
的许多功能形式是本领域中已知的，例如但不限于利拉鲁肽、索玛鲁肽、杜拉鲁肽、阿必鲁
肽以及WO2000055203A1、WO 98/08871、WO 2006/097537中所公开的那些，所述专利的公开
内容全文并入本文中。

[0213] 在某些实施方式中，本文所提供的GLP‑1包含与SEQ ID NO:1具有至少70％(例如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、
100％)序列同一性的氨基酸序列，同时保留SEQ ID NO:1的基本生物活性。

[0214] 在某些实施方式中，GLP‑1相对于SEQ ID NO:1包含不超过9、8、7、6、5、4、3或2个突变(例如添加、缺失、取代)，同时保留SEQ ID NO:1的基本生物活性。在某些实施方式中，
GLP‑1相对于SEQ ID NO:1包含至少2、3、4、5、6、7、8或9个突变(例如添加、缺失、取代)，同时保留SEQ ID NO:1的基本生物活性。

[0215] 本领域的普通技术人员应了解，可在本文所描述的任何多肽片段的序列中进行各种氨基酸取代，例如保守氨基酸取代，而不必定降低其活性。氨基酸取代的实施例包括将L‑
氨基酸取代为其对应的D‑氨基酸，将半胱氨酸取代为高半胱氨酸或具有含硫醇侧链的其它
非天然氨基酸，将赖氨酸取代为高赖氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、鸟氨酸或具有含氨基
侧链的其它非天然氨基酸，或将丙氨酸取代为正缬氨酸等。

[0216] 已将各种取代引入到天然GLP‑1肽中，并且已显示所述取代能够保留或甚至改善其生物活性。在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的位置处的一个或多个突变或由其组
成：A8、G22、Q23、E27、K26、A30、K34、R36和H7和或其任何组合。举例来说，据信A8处的取代适用于防止残基处的DPP4酶促裂解，G22处的取代合乎改善活性和溶解度的需要，并且R36处
的取代适用于降低免疫原性。这些位置处的取代的实施例包括但不限于H7IA、H7IPA、A8G、
A8S、A8V、A8Aib、A8T、A8I、A8L、G22E、K34R、R36G，以及美国专利第8,273,854号中所描述的取代，所述专利全文并入本文中。在某些实施方式中，一个或多个取代包含保守取代。如本
文所用，GLP‑1中残基的编号参考SEQ ID NO:1中列出的31个氨基酸的序列(也称为GLP‑1
(7‑37))提及，其中残基7为组氨酸(H7，即SEQ ID NO:1中的第一残基)并且残基37为甘氨酸
(G37，即SEQ ID NO:1中的最后一个残基)。

[0217] 在某些实施方式中，GLP‑1包含A8的取代，其选自下组：A8G、A8S、A8V、A8Aib、A8T、A8I和A8L。在某些实施方式中，GLP‑1包含G22E的取代。在某些实施方式中，GLP‑1包含R36G
的取代。在某些实施方式中，GLP‑1包含H7的取代，其为H7IA或H7IPA。在某些实施方式中，
GLP‑1包含K34的取代，其为K34R。

[0218] 在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的位置处的一个或多个取代或由其组成：H7、A8、G22、K34和R36或其任何组合。在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的位置处的一
个或多个取代或由其组成：H7IA、H7IPA、A8G、A8Aib、K34R、G22E和R36G或其任何组合。

[0219] 在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的一个或多个取代或由其组成：A8Aib、K26R、G22E、K34R和R36G或其任何组合。

[0220] 在某些实施方式中，GLP‑1包含氨基酸序列X7X8EGTFTSDVSSYLEX22X23AAX26X27FI X30WLVX34GX36G(SEQ ID NO:2)，其中：X7为H、咪唑‑4‑乙酸(IA)或咪唑丙酸(IPA)；X8为A、G、S、V、Aib、T、I或L；X22为G或E；X23为Q、C或K；X26为K、R或C；X27为E、K或C；X30为A、C或K；X34为R、K或C，并且X36为R或G。

[0221] 在某些实施方式中，X7为H，X8为G或Aib，X22为G或E；X23为Q、C或K；X26为K、R或C；X27为E、K或C；X30为A、C或K；X34为K、R或C，并且X36为R或G。

[0222] 在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、3‑44和184。

[0223] 在某些实施方式中，GLP‑1包含不超过一个赖氨酸残基。在某些实施方式中，GLP‑1包含不超过一个半胱氨酸残基。

[0224] 在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的氨基酸序列：

[0225] SEQ ID NO:1(WT GLP‑1)

[0226] SEQ ID NO:3(8Aib、34R、36G)，

[0227] SEQ ID NO:5(8Aib、26R、27K、34R、36G)，

[0228] SEQ ID NO:7(8Aib、26R 34R、36G)，

[0229] SEQ ID NO:8(8Aib、22E、34R、36G)，

[0230] SEQ ID NO:10(8Aib、22E、26R、27K、34R、36G)，

[0231] SEQ ID NO:12(8Aib、22E、26R、34R、36G)，

[0232] SEQ ID NO:13(8Aib、34R)，

[0233] SEQ ID NO:15(8Aib、26R、27K、34R)，

[0234] SEQ ID NO:17(8Aib、26R、34R)，

[0235] SEQ ID NO:18(8Aib、22E、34R)，

[0236] SEQ ID NO:20(8Aib、22E、26R、27K、34R)，

[0237] SEQ ID NO:22(8Aib、22E、26R、34R)，

[0238] SEQ ID NO:23(8G、34R、36G)，

[0239] SEQ ID NO:25(8G、26R、27K、34R、36G)，

[0240] SEQ ID NO:27(8G、26R、34R、36G)，

[0241] SEQ ID NO:28(8G、22E、34R、36G)，

[0242] SEQ ID NO:30(8G、22E、26R、27K、34R、36G)，

[0243] SEQ ID NO:32(8G、22E、26R、34R、36G)，

[0244] SEQ ID NO:33(8G、34R)，

[0245] SEQ ID NO:35(8G、26R、34R)，

[0246] SEQ ID NO:36(8G、22E、34R)，

[0247] SEQ ID NO:38(8G、22E、26R、27K、34R)，

[0248] SEQ ID NO:40(8G、22E、26R、34R)，

[0249] SEQ ID NO:41(8G、22E、36G)，

[0250] SEQ ID NO:42(8G、36G)

[0251] SEQ ID NO:43(8G、22E)，以及

[0252] SEQ ID NO:44(8G)。

[0253] 在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的氨基酸序列：

[0254] SEQ ID NO:3(8Aib、34R、36G)，

[0255] SEQ ID NO:4(8Aib、26C、34R、36G)，

[0256] SEQ ID NO:5(8Aib、26R、27K、34R、36G)，

[0257] SEQ ID NO:6(8Aib、27C、34R、36G)，

[0258] SEQ ID NO:8(8Aib、22E、34R、36G)

[0259] SEQ ID NO:9(8Aib、22E、26C、34R、36G)，

[0260] SEQ ID NO:10(8Aib、22E、26R、27K、34R、36G)，

[0261] SEQ ID NO:11(8Aib、22E、27C、34R、36G)，

[0262] SEQ ID NO:13(8Aib、34R)，

[0263] SEQ ID NO:14(8Aib、26C、34R)，

[0264] SEQ ID NO:15(8Aib、26R、27K、34R)，

[0265] SEQ ID NO:16(8Aib、27C、34R)，

[0266] SEQ ID NO:18(8Aib、22E、34R)，

[0267] SEQ ID NO:19(8Aib、22E、26C、34R)，

[0268] SEQ ID NO:20(8Aib、22E、26R、27K、34R)，

[0269] SEQ ID NO:21(8Aib、22E、27C、34R)，

[0270] SEQ ID NO:23(8G、34R、36G)，

[0271] SEQ ID NO:24(8G、26C、34R、36G)，

[0272] SEQ ID NO:25(8G、26R、27K、34R、36G)，

[0273] SEQ ID NO:26(8G、27C、34R、36G)，

[0274] SEQ ID NO:28(8G、22E、34R、36G)，

[0275] SEQ ID NO:29(8G、22E、26C、34R、36G)，

[0276] SEQ ID NO:30(8G、22E、26R、27K、34R、36G)，

[0277] SEQ ID NO:31(8G、22E、27C、34R、36G)，

[0278] SEQ ID NO:33(8G、34R)

[0279] SEQ ID NO:34(8G、26C、34R)，

[0280] SEQ ID NO:36(8G、22E、34R)，

[0281] SEQ ID NO:37(8G、22E、26C、34R)，

[0282] SEQ ID NO:38(8G、22E、26R、27K、34R)，

[0283] SEQ ID NO:39(8G、22E、27C、34R)，以及

[0284] SEQ ID NO:184(8Aib、22E、26C、34R、36G)。

[0285] 在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、8、12、32和184。

[0286] 在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、4、8、28、29和184。

[0287] 在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、8和28。

[0288] 在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、12和32。

[0289] 在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、29和184。

[0290] 在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和32。

[0291] 肽接头

[0292] 在多肽缀合物中，GLP‑1受体激动剂连接到肽接头的N端。GLP‑1受体激动剂可通过直接连接，例如共价键(如肽键)连接到肽接头。

[0293] 肽接头可由通过肽键连接在一起的氨基酸残基构成。肽接头可进一步包含一个或多个非天然氨基酸。

[0294] 在某些实施方式中，肽接头的长度为至少10个氨基酸残基(例如至少15、20、24、40、50、60、70或80个氨基酸残基)。在某些实施方式中，多肽接头的长度为10到120、15到
120、20到120、25到120、30到120、31到120、32到120、33到120、34到120、35到120、36到120、
37到120、38到120、39到120、40到120、20到80、30到80、31到80、32到80、33到80、34到80、35到80、36到80、37到80、38到80、39到80或40到80个氨基酸残基。在某些实施方式中，多肽接
头的长度为12到80、20到60、30到60、30到50、30到40、40到50、30到45或35到45个氨基酸残
基。

[0295] 在某些实施方式中，肽接头的长度为12‑80个氨基酸残基。

[0296] 可使用任何合适的多肽接头。举例来说，多肽接头可包含选自以下的氨基酸残基或由其组成：氨基酸甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺
(Q)、半胱氨酸(C)和赖氨酸(K)。在一些实施方式中，多肽接头可由大部分非空间位阻的氨
基酸，如甘氨酸和丙氨酸构成。在一些实施方式中，接头为聚甘氨酸、聚丙氨酸、甘氨酸和丙
氨酸的组合(如聚(Gly‑Ala))或甘氨酸和丝氨酸的组合(如聚(Gly‑Ser))。

[0297] 在某些实施方式中，除CRM残基以外，肽接头由选自下组的氨基酸残基组成：G、Q、A、E、P、S和T。

[0298] 在某些实施方式中，除CRM残基以外，肽接头包含重复序列的一个或多个重复或由其组成。在某些实施方式中，肽接头包含以下或由以下组成：重复序列的1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个重复，或在由以上所列的任何两个数字限定的任何数值范围内。

[0299] 在某些实施方式中，重复序列包含不超过4、5或6种类型的选自下组的氨基酸残基或由其组成：G、Q、A、E、P、T和S。在某些实施方式中，重复序列包含不超过4、5或6种类型的选自下组的氨基酸残基或由其组成：G、Q、A、E、P和S。在某些实施方式中，重复序列包含Q。在某些实施方式中，重复序列由Q和不超过3、4或5种类型的选自下组的氨基酸残基组成：G、A、E、
P和S。

[0300] 在某些实施方式中，重复序列由G、Q、A、E和P组成。在某些实施方式中，重复序列由G、Q、A和P组成。

[0301] 在某些实施方式中，重复序列包含选自下组的序列或由其组成：SEQ ID NOs:45‑75和GS。

[0302] 在某些实施方式中，多肽接头包含多于一个重复序列或由其组成。举例来说，多肽接头包含2、3或4个不同重复序列或由其组成。在某些实施方式中，多肽接头包含不同重复
序列的顺序或串联重复或由其组成。

[0303] 在某些实施方式中，多肽接头包含(重复1)r(重复2)s(重复3)x(重复4)y或由其组成，其中：

[0304] 重复1、重复2、重复3和重复4通过肽键或通过一个或多个氨基酸残基连接；

[0305] 重复1、重复2、重复3和重复4独立地，包含选自下组的序列或由其组成：SEQ ID NOs:45‑75和GS，并且

[0306] 在r、s、x和y不同时为0的条件下，r、s、x和y独立地为选自0到30的整数(例如0‑29、0‑28、0‑27、0‑26、0‑25、0‑24、0‑23、0‑22、0‑21、0‑20、0‑19、0‑18、0‑17、0‑16、0‑15、0‑14、0‑
13、0‑12、0‑11、0‑10、0‑9、0‑8、0‑7、0‑6、0‑5、0‑4、0‑3、0‑2或0‑1)。

[0307] 在某些实施方式中，x和y为0，r和s独立地为选自1到30的整数(例如选自1‑29、1‑28、1‑27、1‑26、1‑25、1‑24、1‑23、1‑22、1‑21、1‑20、1‑19、1‑18、1‑17、1‑16、1‑15、1‑14、1‑
13、1‑12、1‑11、1‑10、1‑9、1‑8、1‑7、1‑6、1‑5、1‑4、1‑3或1‑2)，并且重复1和重复2是选自下组的组合：

[0308] a)重复1包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0309] b)重复1包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0310] c)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成；

[0311] d)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成；

[0312] e)重复1包含SEQ ID NO:49的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0313] f)重复1包含SEQ ID NO:70序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0314] g)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:68的序列或由其组成，以及

[0315] h)重复1包含SEQ ID NO:70的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成。

[0316] 在某些实施方式中，r、x和y为0，s为选自1到30的整数(例如选自1‑29、1‑28、1‑27、1‑26、1‑25、1‑24、1‑23、1‑22、1‑21、1‑20、1‑19、1‑18、1‑17、1‑16、1‑15、1‑14、1‑13、1‑12、1‑
11、1‑10、1‑9、1‑8、1‑7、1‑6、1‑5、1‑4、1‑3或1‑2)，并且重复1包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成。

[0317] 在某些实施方式中，y为0，r、s和x独立地为选自1到30的整数(例如选自1‑29、1‑28、1‑27、1‑26、1‑25、1‑24、1‑23、1‑22、1‑21、1‑20、1‑19、1‑18、1‑17、1‑16、1‑15、1‑14、1‑
13、1‑12、1‑11、1‑10、1‑9、1‑8、1‑7、1‑6、1‑5、1‑4、1‑3或1‑2)，并且重复1、重复2和重复3是选自下组的组合：

[0318] a)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:49的序列或由其组成；并且重复3包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0319] b)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成；并且重复3包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0320] c)重复1包含SEQ ID NO:70的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；

[0321] d)重复1包含SEQ ID NO:70的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成，

[0322] e)重复1包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:58的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，

[0323] f)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:68的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成，

[0324] g)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，以及

[0325] h)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:68的序列或由其组成。

[0326] 在某些实施方式中，r、s、x和y独立地为选自1到30的整数(例如选自1‑29、1‑28、1‑27、1‑26、1‑25、1‑24、1‑23、1‑22、1‑21、1‑20、1‑19、1‑18、1‑17、1‑16、1‑15、1‑14、1‑13、1‑
12、1‑11、1‑10、1‑9、1‑8、1‑7、1‑6、1‑5、1‑4、1‑3或1‑2)，并且重复1、重复2、重复3和重复4是选自下组的组合：

[0327] a)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:50的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:47的序列或由其组成，并且重复4包含SEQ ID NO:48的序
列或由其组成，

[0328] b)重复1包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:68的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成，并且重复4包含SEQ ID NO:48的序
列或由其组成，

[0329] c)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:68的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成，并且重复4包含SEQ ID NO:48的序
列或由其组成，

[0330] d)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:58的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，并且重复4包含SEQ ID NO:45的序
列或由其组成，以及

[0331] e)重复1包含SEQ ID NO:48的序列或由其组成，重复2包含SEQ ID NO:45的序列或由其组成；重复3包含SEQ ID NO:69的序列或由其组成，并且重复4包含SEQ ID NO:68的序
列或由其组成。

[0332] 在某些实施方式中，肽接头包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs:76‑89，不同之处在于一个残基被CRM残基取代。

[0333] 在某些实施方式中，肽接头包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:90‑117、175和176。

[0334] CRM残基

[0335] 在某些实施方式中，多肽缀合物可与CRM单缀合。在某些实施方式中，第一CRM残基为赖氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含一个赖氨酸残基。在此类实施方式中，肽接头仅包含
一个赖氨酸残基，并且GLP‑1受体激动剂不包含赖氨酸残基。

[0336] 在某些实施方式中，多肽缀合物中的单个生物活性肽包含GLP‑1，并且在天然GLP‑1序列中发现的天然存在的残基，即K26和K34可取代为非赖氨酸残基。在某些实施方式中，
GLP‑1包含K26的取代，其选自下组：K26R、K26Q、K26A、K26G、K26H、K26S和K26T。在某些实施方式中，GLP‑1包含或进一步包含K34的取代，其选自下组：K34R、K34Q、K34A、K34G、K34H、
K34S和K34T。在某些实施方式中，K26的取代选自K26R和K26Q，和/或K34处的取代选自K34R
和K34Q。在整个说明书中，当K残基存在于GLP‑1中时，K的位置参考GLP‑1(1‑37)的氨基酸序
列来鉴别。举例来说，K26指示参考GLP‑1(1‑37)的氨基酸序列的第26位(其对应于参考GLP‑
1(7‑37)，即SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第20位)为K。类似地，K34指示参考GLP‑1(1‑37)的
氨基酸序列的第34位(其对应于参考GLP‑1(7‑37)，即SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第28位)
为K。

[0337] 在某些实施方式中，GLP‑1可进一步包含选自下组的位置处的一个或多个额外突变：A8、G22、E27、R36和H7和或其任何组合。在某一实施方式中，GLP‑1包含K26R和K34R。在某些实施方式中，GLP‑1包含选自下组的氨基酸序列：

[0338] SEQ ID NO:7(8Aib、26R、34R、36G)，

[0339] SEQ ID NO:12(8Aib、22E、26R、34R、36G)，

[0340] SEQ ID NO:17(8Aib、26R、34R)，

[0341] SEQ ID NO:22(8Aib、22E、26R、34R)，

[0342] SEQ ID NO:27(8G、26R、34R、36G)，

[0343] SEQ ID NO:32(8G、22E、26R、34R、36G)，

[0344] SEQ ID NO:35(8G、26R、34R)，以及

[0345] SEQ ID NO:40(8G、22E、26R、34R)。

[0346] 在某些实施方式中，第一CRM残基为半胱氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含一个半胱氨酸残基。在此类实施方式中，肽接头仅包含一个半胱氨酸残基，并且GLP‑1受体激动剂
不包含半胱氨酸残基。在某些实施方式中，多肽缀合物中的单个生物活性肽多肽包含GLP‑
1。天然GLP‑1不含任何半胱氨酸残基，并且因此可使用任何GLP‑1衍生物(包括本文所提供
的那些)，只要其不含半胱氨酸残基即可。

[0347] 在某些实施方式中，第一CRM残基为非天然氨基酸残基，并且多肽缀合物仅包含一个非天然氨基酸残基作为CRM残基。非天然氨基酸可含有多种官能团或反应性基团，其可提
供额外功能和/或反应性。有益于将部分缀合到本申请的融合多肽的目的的特定非天然氨
基酸包括带具有叠氮、炔烃、烯烃、环炔烃或卤基的侧链的非天然氨基酸。

[0348] 在第一CRM残基为半胱氨酸或非天然氨基酸残基时，GLP‑1可包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、12、13、15、17、18、20、22、23、25、27、28、30、32、33、35、
36、38和40‑44。

[0349] 在某些实施方式中，多肽缀合物进一步包含第二CRM残基。在某些实施方式中，第二CRM残基在肽接头中。在此类实施方式中，第二CRM残基可与第一CRM残基相距任何合适的
距离，只要两个CRM残基可适当地缀合即可。在某些实施方式中，第二CRM残基在GLP‑1受体
激动剂，例如GLP‑1中。在某些实施方式中，第二CRM残基是在天然GLP‑1序列中发现的天然
存在的残基，或引入的残基，例如通过取代天然存在的残基或通过插入新的残基。

[0350] 在某些实施方式中，第一和第二CRM残基均为赖氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含两个赖氨酸残基。在某些实施方式中，第二赖氨酸残基在GLP‑1中，并且选自下组：K23、K26、
K27、K30和K34。在某些实施方式中，第二CRM残基是天然GLP‑1序列中发现的天然存在的残
基，例如K26或K34。在某些实施方式中，第二CRM残基是引入的残基。CRM残基可例如通过取
代在任何合适的位置处引入GLP‑1序列，只要此类取代基本上不降低GLP‑1的GLP‑1R激动剂
活性即可。第二CRM残基可例如通过Q23K、E27K或A30K的取代引入。在某些实施方式中，GLP‑
1中除CRM残基外的赖氨酸残基取代为非赖氨酸残基，使得多肽缀合物不包含除CRM残基以
外的额外赖氨酸残基。举例来说，如果K26为第二CRM残基，则K34取代为非赖氨酸残基，或反
之亦然。非赖氨酸残基可由本领域的技术人员选择，并且实施例包括精氨酸(R)、谷氨酰胺
(Q)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。

[0351] 在第一和第二CRM残基都是赖氨酸残基时，GLP‑1可包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、5、8、10、13、15、18、20、23、25、28、30、33、36和38。

[0352] 在某些实施方式中，第一和第二CRM残基均为半胱氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含两个半胱氨酸残基。在某些实施方式中，第二半胱氨酸残基在GLP‑1中。在某些实施方式
中，第二半胱氨酸残基在肽接头中。

[0353] 在某些实施方式中，第一和第二CRM残基都是非天然氨基酸残基，并且多肽缀合物仅包含两个非天然氨基酸残基作为CRM残基。

[0354] 在某些实施方式中，GLP‑1中的半胱氨酸残基或非天然氨基酸残基通过选自下组的位置处的取代引入：相对于SEQ ID NO:1的Q23、K26、E27、A30和K34。在某些实施方式中，
GLP‑1中的半胱氨酸残基或NNAA通过相对于SEQ ID NO:1的K26或E27的位置处的取代引入。
在某些实施方式中，GLP‑1中的第二CRM残基为半胱氨酸，并且通过选自下组的位置处的取
代引入：Q23C、K26C、E27C、A30C和K34C。

[0355] 在第一和第二CRM残基都是半胱氨酸残基时，GLP‑1可包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、6、9、11、14、16、19、21、24、26、29、31、34、37、39和184。

[0356] CRM

[0357] 在某些实施方式中，CRM包含血浆蛋白结合部分、聚合物、Fc、人血清白蛋白(HSA)和其功能片段、Xten序列或PAS序列。在某些实施方式中，Xten序列为具有以下中所描述的
氨基酸序列的延伸重组多肽序列：WO2007103515、WO2009023270、WO2010091122、
WO2011123813、WO2013130683、WO2017146979、WO2011084808、WO2013040093、
WO2013122617、WO2014011819、WO2013184216、WO2014164568、WO2015023891、WO2016077505
和WO2017040344，其公开内容已全文并入。在某些实施方式中，术语“PAS”(也可与术语
“APS”互换使用)是指由Ala、Ser和Pro残基组成的氨基酸重复，如US8563521B2中所描述，其
公开内容已全文并入。

[0358] 在某些实施方式中，CRM包含白蛋白结合部分。术语“白蛋白结合部分”是指能够以足够的特异性，优选非共价地结合白蛋白(例如人血清白蛋白)或其任何功能片段的任何功
能部分。连接到治疗性融合多肽、多肽或多肽复合物的白蛋白结合部分对人血清白蛋白的
亲和力典型地低于10μM，并且优选低于1pM。白蛋白结合部分可包括但不限于白蛋白结合结
构域、来自合成肽的白蛋白结合序列以及白蛋白结合化学部分。举例来说，白蛋白结合部分
选自来自链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域、来自大消化链球菌(Peptostreptococcus 
magnus)蛋白质PAB的白蛋白结合结构域、具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:173)的白
蛋白结合肽。《生物化学杂志》277,38(2002)35035‑35043中已描述许多作为白蛋白结合部
分的小肽。再例如，白蛋白结合部分选自含有4‑40个碳原子的直链和支链亲脂部分，具有环
戊并菲骨架的化合物等。举例来说，白蛋白结合部分为式CH3(CH2)vCO‑NHCH(COOH)(CH2)2CO‑
的基团，其中v为10到24的整数。

[0359] 在某些实施方式中，白蛋白结合部分包含以下结构：*‑A‑B‑C‑D‑E，其中A、B、C、D和E通过酰胺键互连，并且A的*端连接到多肽复合物上可缀合残基的反应性基团，并且其中：

[0360] A选自键、 a、b、c和d独立地为0到41
的整数，R为氢或‑COOH；

[0361] B选自键、 e为1到4的整数，其中位置α连接位置α’，
2

[0362] C为键或 R 为‑CH2SO3H或‑COOH，f为1到4的整数，n为1到25的整数，其中当B不为键时，则位置β’连接位置β，其中当B为键时，则位置β’连接位置α’；
3

[0363] D选自键、 g和h独立地为0或1，并且R为H或‑CH2COOH，其中：

[0364] 当B不为键且C为键时，则位置γ’连接位置β；

[0365] 当C不为键时，则位置γ’连接位置γ；并且

[0366] 当B为键且C为键时，则位置γ’连接位置α’；

[0367] E为具有下式的酸性基团：

[0368]

[0369] 其中W表示‑(CR4R5)l‑，

[0370] R4和R5独立地选自下组：氢、卤素、氰基、羟基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟烷基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基和羧酰胺，

[0371] R6选自羟基或NR7R8；7 8

[0372] R和R独立地选自下组：氢、烷基、羟基和 并且l为10到20的整数，且其中：

[0373] 当D不为键时，则位置δ连接位置δ’；

[0374] 当C不为键且D为键时，则位置δ连接位置γ；

[0375] 当B不为键、C为键且D为键时，则位置δ连接位置β；

[0376] 当A不为键且B、C、D都为键时，则位置δ连接位置α’，

[0377] 或其药学上可接受的盐。

[0378] 在某些实施方式中，CRM与赖氨酸残基缀合，任选地赖氨酸残基在肽接头中或在GLP‑1中。

[0379] 在某些实施方式中，A为键。

[0380] 在某些实施方式中，A为键，并且B为键或 其中e为1、2或3。

[0381] 在某 些实施 方式中 ，A为 键 ，B为 并 且C 为其中位置β’连接位置β其中e为1、2或3，f为1、2或3，并且n为1或2。在某
2
些实施方式中，D为键，并且E为具有下式的酸性基团： 在某些实施方式中，R
6 4 5 4 5
为‑COOH，并且R 为羟基。在某些实施方式中，W表示‑(CRR)l‑，R 和R独立地为氢，l为10到
20的整数。

[0382] 在某些实施方式中，A为键，B为键，并且C为键。

[0383] 在某些实施方式中，A为键，B为键，并且C为 其中f为1、2或3，并且n为1或2。

[0384] 在某些实施方式中，A为 其中a为1、2或3，b为1、2或3，并且c为1或2。

[0385] 在某些实施方式中，A为 并且B为其中a为1、2或3，b为1、2或3，c为1或2，并且e为1、2或3，其中位置
α连接位置α’。

[0386] 在某些实施方式中，A为 B为并且C为 其中位置α连接位置α’且位置β’连接位置β，其中a为1、2或3，
b为1、2或3，c为1或2，e为1、2或3，f为1、2或3，并且n为1或2。

[0387] 在某些实施方式中，A为 B为并且C为键，其中位置α连接位置α’，其中a为1、2或3，b为1、2或3，c为1或2，并且e为1、2或3。

[0388] 在某些实施方式中，A为 并且B为键，其中a为1、2或3，b为1、2或3，并且c为1或2。

[0389] 在某些 实施方式 中 ，A 为 B为键 ，并且C 为其中位置β’连接位置α’，其中a为1、2或3，b为1、2或3，c为1或2，f为1、2或3，
并且n为1或2。

[0390] 在某些实施方式中，A为 B为键，并且C为键，其中a为1、2或3，b为1、2或3，并且c为1或2。

[0391] 在某些实施方式中，D为键。

[0392] 在某些实施方式中，A为 B为C为 并且D为键，其中位置α连接位置α’且位置β’连接位置β，其中a为1、2或
3，b为1、2或3，c为1或2，e为1、2或3，f为1、2或3，并且n为1或2。

[0393] 在某些实施方式中，D为 其中g为0或1，并且h为0或1。

[0394] 在某些实施方式中，A为 B为或键，C为键，并且D为 其中当B不为键时，则位
置α连接位置α’且位置γ’连接位置β，或者当B为键时，则位置γ’连接位置α’，其中a为1、2或3，b为1、2或3，c为1或2，e为1、2或3，g为0或1，并且h为0或1。

[0395] 在某些实施方式中，D为

[0396] 在某些实施方式中，A为 B为C为键或 并且D为 其中位
置α连接位置α’，当C为键时，则位置γ’连接位置β，或者当C不为键时，则位置β’连接位置β且位置γ’连接位置γ，其中a为1、2或3，b为1、2或3，c为1或2，e为1、2或3，f为1、2或3，并且n为1或2。

[0397] 在此类实施方式中，CRM包含下式结构(也称为‑HOOC‑(CH2)16‑CO‑gGlu‑2XADO，其中2XADO意指两个连续ADO部分，并且ADO为8‑氨基‑3,6‑二氧杂辛酸的缩写)：

[0398]

[0399] 在某些实施方式中，CRM与半胱氨酸残基缀合，任选地半胱氨酸残基在肽接头中或在GLP‑1中。

[0400] 在某些实施方式中，A为 并且B为其中位置α连接位置α’。

[0401] 在某些实施方式中，A为 B为并且C为 其中位置α连接位置α’且位置β’连
接位置β，其中a为1、2或3，b为1、2或3，c为1或2，d为1、2或3，f为1、2或3，并且n为1或2。在某些实施方式中，D为键，并且E为具有下式的酸性基团： 其中位置δ连接位置
γ。在某些实施方式中，R2为‑COOH，并且R6为羟基。在某些实施方式中，W表示‑(CR4R5)l‑，R4和R5独立地为氢，l为10到20的整数。

[0402] 在某些实施方式中，A为 B为 C为并且D为键，其中位置α连接位置α’且位置β’连接位置β，其中a为1、2或3，b
为1、2或3，c为1或2，d为1、2或3，f为1、2或3，并且n为1或2。

[0403] 在某些实施方式中，A为 并且B为 其中位置α连接位置α’，其中d为1、2或3，并且e为1、2或3。

[0404] 在某些实施方式中，A为 B为 并且C为键，其中位置α连接位置α’，其中d为1、2或3，并且e为1、2或3。

[0405] 在某些实施方式中，A为 B为 C为键，并且D为 其中位置α连接位置α’且位置γ’连接位置β，其中d为1、2或3，e
为1、2或3，g为0或1，并且h为0或1。

[0406] 在此类实施方式中，CRM包含下式结构(也称为HOOC‑(CH2)16‑CO‑gGlu‑2XADO‑EDA‑CO‑CH2)或HOOC‑(CH2)20‑CO‑gGlu‑2XADO‑EDA‑CO‑CH2)：

[0407]

[0408] 缀合物

[0409] 在某些实施方式中，多肽缀合物包含选自下组的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:118‑174和177‑183。

[0410] 在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:119、126‑128、136‑139、147‑150、158‑161、169‑174和177‑183，以及连接到赖氨酸或半胱氨酸残基的CRM。在某些实施方式中，CRM包含‑HOOC‑(CH2)16‑CO‑gGlu‑2XADO(用于赖
氨酸缀合)或HOOC‑(CH2)16‑CO‑gGlu‑2XADO‑EDA‑CO‑CH2(用于半胱氨酸缀合)的结构。

[0411] 在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:118、120‑125、129‑135、140‑146、151‑157、162‑168、173、174和177‑183，以及分别连接到两个赖氨酸残基或两个半胱氨酸残基的两个CRM。在某些实施方式中，CRM包含‑HOOC‑
(CH2)16‑CO‑gGlu‑2XADO(用于赖氨酸缀合)或HOOC‑(CH2)16‑CO‑gGlu‑2XADO‑EDA‑CO‑CH2(用于半胱氨酸缀合)的结构。

[0412] 在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物包含选自下组的氨基酸序列：118、120、121、122、123、124、125、129、130、131、132、133、134、135、140、141、142、143、144、145、
146、173、174及177‑183，以及分别连接到两个赖氨酸残基的两个CRM。在某些实施方式中，
CRM包含‑HOOC‑(CH2)16‑CO‑gGlu‑2XADO的结构。

[0413] 在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物包含选自下组的氨基酸序列：119、126、127、128、136、137、138、139、147、148、149和150，以及连接到赖氨酸残基的CRM。在某些实施方式中，CRM包含‑HOOC‑(CH2)16‑CO‑gGlu‑2XADO的结构。

[0414] 在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物包含选自下组的氨基酸序列：151、152、153、154、155、156、157、162、163、164、165、166、167、168和177‑183，以及分别连接到两个半胱氨酸残基的两个CRM。在某些实施方式中，CRM包含HOOC‑(CH2)16‑CO‑gGlu‑2XADO‑
EDA‑CO‑CH2的结构。

[0415] 在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物包含选自下组的氨基酸序列：158、159、160、161、169、170、171和172，以及连接到半胱氨酸残基的CRM。在某些实施方式中，CRM包含HOOC‑(CH2)16‑CO‑gGlu‑2XADO‑EDA‑CO‑CH2的结构。

[0416] 在某些实施方式中，CRM与融合多肽中的非天然氨基酸残基缀合。在某些实施方式中，CRM与多肽中的非天然氨基酸残基缀合。

[0417] 下表1显示示范性多肽缀合物中的每一者的详细信息，包括多肽部分、GLP‑1和肽接头的SEQ ID NO以及CRM残基。还显示GLP‑1中的突变以及肽接头序列中的重复序列和重
复数。

[0418] 表1.示范性多肽缀合物序列

[0419]

[0420]

[0421]

[0422]

[0423]

[0424] **：GLP‑1中的突变意指相对于SEQ ID NO:1的突变，其中第一残基为7H，并且最后一个残基为37G；

[0425] #：CRM残基意指CRM残基在含有C端连接到肽接头的GLP‑1(其中第一残基为7H)的多肽序列中从N到C计数的位置。

[0426] &：A基团是指HOOC‑(CH2)16‑CO‑gGlu‑2XADO或

[0427]

[0428] &&：B基团是指HOOC‑(CH2)16‑CO‑gGlu‑2XADO‑EDA‑CO‑CH2，或以下结构：

[0429]

[0430] 在某些实施方式中，多肽缀合物包含以下所示的结构，其中氨基酸残基表示为灰色圆圈中的一个字母缩写：

[0431] 分子001：

[0432]

[0433] 分子002：

[0434]或

[0435] 分子012：

[0436]

[0437] 制备方法

[0438] 本申请提供编码本文所提供的多肽缀合物的多肽部分(或其片段)的分离的核酸或多核苷酸。

[0439] 如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非明确限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的
已知类似物的多核苷酸，所述类似物具有与参照核酸类似的结合特性并且以与天然存在的
核苷酸类似的方式代谢。除非另外指示，否则特定多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰
变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列，以及明确指示的序
列。具体来说，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三
位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(参见Batzer等人《, 核酸研究》19:
5081(1991)；Ohtsuka等人《, 生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》260:2605‑2608(1985)；和
Rossolini等人《, 分子细胞探针(Mol.Cell.Probes)》8:91‑98(1994))。

[0440] 编码本文所提供的多肽(或其片段)的核酸或多核苷酸可使用重组技术构建。为此目的，可获得编码GLP‑1受体激动剂(如GLP‑1)的DNA和编码肽接头的DNA并且可操作地连
接，以允许在宿主细胞中转录和表达以产生融合多肽。如果需要，还可操作地连接编码一个
或多个接头的多核苷酸序列以允许表达所需产物。

[0441] 编码多核苷酸序列可进一步可操作地连接到一个或多个调控序列，任选地在表达载体中，使得融合多肽或多肽复合物的表达或产生可行并且在适当控制下。

[0442] 可使用本领域中已知的重组技术将编码多核苷酸序列插入到载体中以用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。许多载体是可供使用的。载体组件一般包括但不限于以下中的一
者或多者：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子(例如原核启动
子，如T7、T7lac、Sp6、araBAD、trp、lac、tac、pLm、A3、lac、lpp、npr、pac、syn、trc和T3，或真核启动子，如SV40、CMV和EF‑1α)以及转录终止序列。

[0443] 载体和宿主细胞

[0444] 在另一方面，本申请提供一种载体，其包含本文所提供的多核苷酸。

[0445] 可将包含本文所提供的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中进行克隆或基因表达。如本文所用，短语“宿主细胞”是指已将外源多核苷酸和/或载体引入其中的细胞。在
其它实施方式中，载体是染色体外的。必要时，可分离宿主细胞。在某些实施方式中，宿主细
胞为原核细胞或真核细胞。

[0446] 适用于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞主要是原核生物。用于此目的的合适原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性(Gram‑negative)或革兰氏阳性(Gram‑positive)
生物体，例如肠内菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆
菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆
菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella 
typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)；和志
贺杆菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽
孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如绿脓杆菌(P.aeruginosa)；和链
霉菌属(Streptomyces)。在一些实施方式中，宿主细胞为真核生物，如酵母和哺乳动物细胞
(例如永生化哺乳动物细胞)。

[0447] 可使用本领域的技术人员已知的任何合适方法，例如转化、转染或转导，将包含本文所提供的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中。在一个实施例中，可将编码GLP‑1多肽
的多核苷酸序列亚克隆到表达载体中，其在宿主细胞中表达为包涵体。载体可为病毒载体，
并且在这一能力中可使用任何合适病毒载体。

[0448] 在另一方面，本申请提供一种宿主细胞，其包含本文所提供的载体。宿主细胞为原核细胞或真核细胞。用上述表达或克隆载体转化的宿主细胞可在常规营养培养基中培养，
所述培养基视需要经修饰以诱导启动子、选择转化体或扩增克隆载体。

[0449] 在另一方面，本申请提供一种产生本文所提供的多肽缀合物的方法，其包括在允许本文所提供的多核苷酸表达的条件下培养本文所提供的宿主细胞以获得多肽缀合物的
多肽部分。

[0450] 为了产生本文所提供的多肽部分，可在多种培养基中培养用表达载体转化的宿主细胞。市售细菌生长培养基，如Terrific肉汤、LB肉汤、LB琼脂、M9基本培养基、MagiaMedia
培养基以及ImMedia培养基(赛默飞世尔(ThermoFisher))适用于培养细菌宿主细胞。市售
培养基，如Ham's F10(西格玛(Sigma))、最小必需培养基(MEM)(西格玛)、RPMI‑1640(西格
玛)以及杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，
DMEM)，西格玛)适用于培养真核宿主细胞。这些培养基中的任一种都可以视需要补充激素
和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷
TM
酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN 药物)、微量元素
(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。还可
以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必要的补充剂。培养条件(如温度、pH等)
是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，并且对普通技术人员来说将是显而易
见的。

[0451] 在一个方面，本申请提供一种表达本文所提供的多肽缀合物的多肽部分的方法，其包括在表达多肽部分的条件下培养本文所提供的宿主细胞。在某些实施方式中，多肽部
分表达为可溶性多肽。

[0452] 当使用重组技术时，本文所提供的多肽可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果产物在细胞内产生，那么作为第一步，例如通过离心或超滤去除宿主细
胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等人《, 生物技术(Bio/Technology)》10:163‑167(1992)
描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间的蛋白质的程序。简单来说，将细胞糊状
物在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻约30min。细胞碎片可通过
离心去除。在产物被分泌到培养基中的情况下，一般首先使用市售的蛋白质浓缩过滤器，例
如艾米康(Amicon)或密理博(Millipore)Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清
液。可在前述任一步骤中包含蛋白酶抑制剂，如PMSF，以抑制蛋白水解，且可以包括抗生素
以防止外来污染物的生长。

[0453] 在某些实施方式中，所述方法进一步包括分离多肽。

[0454] 由细胞制备的本文所提供的多肽可使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE‑纤维素离子交换色谱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱纯化。

[0455] 用于蛋白质纯化的其它技术，如离子交换柱分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶TM
色谱、肝素SEPHAROSE 色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)色谱、色谱焦聚、
SDS‑PAGE以及硫酸铵沉淀也是可用的，取决于待回收的蛋白质。

[0456] 在某些实施方式中，所述方法进一步包括将CRM与多肽缀合。多肽可通过合适的缀合反应在例如赖氨酸残基、半胱氨酸残基或非天然氨基酸处缀合。

[0457] 举例来说，具有一个或多个CRM残基(如赖氨酸)的多肽可与氨基反应性试剂反应。在某些实施方式中，CRM在酰化反应中通过酰基与赖氨酸残基缀合。酰化反应的示范性方法
描述于例如WO2009083549和WO2010029159中，其内容全文并入本文中。待在酰化反应中缀
合的CRM可含有羧酸基、α,ω‑脂肪二酸残基、活化酯或活化N‑羟基酰亚胺酯等。活化酯的实
施例包括O‑丁二酰亚胺试剂，如N‑羟基丁二酰亚胺基(NHS)或磺基‑NHS酯和酰亚胺酯化合
物，如特劳特氏试剂(Traut's reagent)，其可与可缀合赖氨酸残基的ε‑氨基反应以形成酰
胺或脒键。合适的氨基反应性试剂的额外实施例包括O‑酰基异脲、N‑羟基三唑酯、酸酐、苯
基活性酯、P‑异羟肟活性酯、酰基咪唑、酰基苯并三唑、酰基叠氮化物、酰卤、鏻盐、铵/脲阳
离子盐。

[0458] 再例如，具有一个或多个CRM残基(如半胱氨酸)的多肽可连接到硫醇反应性试剂。在某些实施方式中，CRM在烷基化反应中与半胱氨酸残基缀合。在某些实施方式中，CRM通过
顺丁烯二酰亚胺或碘乙酰胺与可缀合半胱氨酸残基缀合以形成碳‑硫键。在某些实施方式
中，CRM通过二硫化物与可缀合半胱氨酸残基缀合以形成二硫键。合适的硫醇反应性基团的
额外实施例包括二烯基砜、α‑卤酰基或其它硫醇反应性缀合搭配物。关于细节，参见
Haugland,2003《,分子探针公司荧光探针与研究化合物手册(Molecular Probes Handbook 
of Fluorescent Probes and Research Chemicals)》,分子探针公司(Molecular Probes,
Inc.)；Brinkley,1992《, 生物缀合化学(Bioconjugate Chem.)》3:2；Garman,1997《,非放射
性标记：实践方法(Non‑Radioactive Labelling:A Practical Approach)》,学术出版社
(Academic Press),伦敦(London)；Means(1990)《生物缀合化学》1:2；Hermanson,G.在《生
物缀合技术(Bioconjugate Techniques)》(1996)学术出版社,圣迭戈(San Diego),第40‑
55,643‑671页中。

[0459] 举例来说，具有一个或多个CRM残基(非天然氨基酸残基(NNAA))的多肽可与CRM缀合，使得可在融合多肽的NNAA与CRM之间形成稳定连接。举例来说，含酮基或醛或β‑二酮部
分的NNAA可与含酰肼或O‑烷基羟胺、羟胺的试剂反应以形成腙或O‑烷基化肟键。再例如，含
有叠氮基的NNAA可与炔衍生物反应，通过铜(I)催化的[3+2]环加成形成稳定三唑接头(且
反之亦然)。再例如，含有叠氮基的NNAA可与适当的水溶性含膦试剂连接，通过施陶丁格连
接(Staudinger ligation)形成酰胺键。此外，NNAA中的硫酯部分可与含胺试剂反应以形成
酰胺键。并入NNAA的本文所提供的融合多肽可通过环加成反应与试剂缀合，如二烯与亲二
烯物之间的(4+2)环加成(狄尔斯‑阿尔德反应(Diels‑Alder reaction))、通过1,3‑偶极胡
伊斯根环加成(Huisgen cycloaddition)的(3+2)环加成以及通过硝酮‑烯烃环加成的(3+
2)环加成。适用于抗体缀合的环加成方法已描述于例如WO05003294、US20120004183、
WO06009901、WO07130453和美国专利6,737,236中。

[0460] 再例如，多肽可与生物素缀合，接着与CRM间接缀合，所述CRM与抗生物素蛋白缀合。再例如，融合多肽或多肽复合物可连接到偶联剂，所述偶联剂进一步连接到CRM。偶联剂
的实施例包括双官能部分，如N‑丁二酰亚胺基‑3‑(2‑吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、丁二酰亚
胺基‑4‑(N‑顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷‑1‑甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚
氨基酯的双官能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二丁二酰亚
胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物
(如双‑(对重氮苯甲酰基)‑乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6‑二异氰酸甲苯酯)以及双活性氟化
合物(如1,5‑二氟‑2,4‑二硝基苯)。尤其优选的偶联剂包括N‑丁二酰亚胺基‑3‑(2‑吡啶二
硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人《, 生物化学杂志(Biochem.J.)》173:723‑737(1978))和
N‑丁二酰亚胺基‑4‑(2‑吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)以提供二硫键。

[0461] 用于将CRM与多肽缀合的额外方法发现于例如美国专利第5,208,020号；美国专利第6,4411,163号；WO2005037992；WO2005081711；和WO2006/034488中，其以全文引用的方式
并入本文中。制备本申请的缀合物的方法的具体实施例也包括于本申请的实验部分中。

[0462] 药物组合物

[0463] 在另一方面，本申请还提供一种药物组合物，其包含本文所提供的多肽缀合物和药学上可接受的载剂。

[0464] 术语“药学上可接受的”是指，给定的载剂、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐一般在化学上和/或物理上与构成配制物的其它成分相容，并且在生理上与其接受者相容。

[0465] “药学上可接受的载剂”是指药物调配物中除了活性成分以外的生物活性可接受且对受试者无毒的成分。用于本文所公开的药物组合物的药学上可接受的载剂可包括例如
药学上可接受的液体、凝胶或固体载剂、水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲
剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮/分散剂、螯合(sequestering/chelating)剂、稀释剂、佐剂、赋
形剂或无毒辅助物质、本领域中已知的其它组分或其各种组合。

[0466] 合适的组分可包括例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂，如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如
蛋氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、硫代乙醇酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公
开，在本文所提供的药物组合物中包括一种或多种抗氧化剂(如蛋氨酸)减少多肽复合物或
双特异性多肽复合物的氧化。这种氧化的减少防止或减少了结合亲和力的损失，从而提高
了蛋白质的稳定性并最大限度地延长了保存期。因此，在某些实施方式中，提供了包含本文
所公开的融合多肽、多肽复合物或缀合物以及一种或多种抗氧化剂(如蛋氨酸)的组合物。

[0467] 为了进一步说明，药学上可接受的载剂可包括例如水性媒剂，如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、或右旋糖和乳酸林
格氏注射液；非水性媒剂，如植物来源的非挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油；抑
制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂；等渗剂，如氯化钠或右旋糖；缓冲剂，如磷酸盐或柠
檬酸盐缓冲剂；抗氧化剂，如硫酸氢钠；局部麻醉剂，如盐酸普鲁卡因(procaine 
hydrochloride)；悬浮剂和分散剂，如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷
酮；乳化剂，如聚山梨醇酯80(TWEEN‑80)；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸
(EGTA)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。用作载剂的抗微生物剂可
添加到多剂量容器中的药物组合物中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯
丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵(benzalkonium 
chloride)和苄索氯铵(benzethonium chloride)。合适的赋形剂可包括例如水、生理盐水、
右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、
溶解性增强剂或如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精等试剂。

[0468] 药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、丸剂、胶囊、片剂、持续释放配制物或散剂。口服配制物可包括标准载剂，如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯
烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

[0469] 在实施方式中，药物组合物被配制成可注射组合物。可注射的药物组合物可以任何常规形式制备，例如液体溶液、悬浮液、乳液或适合于产生液体溶液、悬浮液或乳液的固
体形式。注射用制剂可包括准备用于注射的无菌和/或无热原质溶液；准备在临使用前与溶
剂组合的无菌干燥可溶性产品，如冻干粉，包括皮下片剂；准备用于注射的无菌悬浮液；准
备在临使用前与媒剂组合的无菌干燥不溶性产品；以及无菌和/或无热原质乳液。溶液可以
是水性或非水性的。

[0470] 在某些实施方式中，单位剂量的肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带针头的注射器中。用于肠胃外施用的所有制剂都应是无菌且无热原质的，正如本领域中已知和实践的
那样。

[0471] 在某些实施方式中，无菌冻干粉是通过将如本文所公开的多肽缀合物溶解于合适的溶剂中来制备。溶剂可含有改善粉末或由粉末制备的重构溶液的稳定性或其它药理学组
分的赋形剂。可使用的赋形剂包括但不限于水、右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、
甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适的试剂。溶剂可以含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸
钾、或本领域的技术人员已知的其它此类缓冲剂，在一个实施方式中，缓冲剂大致呈中性pH
值。随后无菌过滤溶液，接着在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，得到所需配制物。
在一个实施方式中，将所得溶液分配到小瓶中进行冻干。每个小瓶可含有单剂量或多剂量
的本文所提供的融合多肽、多肽复合物或缀合物或其组合物。小瓶过填充超出一次剂量或
一组剂量所需的较少量(例如约10％)是可接受的，以便于精确地抽取样品并精确地给药。
冻干粉可以在适当的条件下储存，如在约4℃到室温下储存。

[0472] 用注射用水重构冻干粉提供了用于肠胃外施用的配制物。在一个实施方式中，为了重构，将无菌和/或无热原质水或其它合适的液体载剂添加到冻干粉中。精确量取决于给
定的所选疗法，并且可以凭经验确定。

[0473] 如本文所描述的药物组合物的施用可以通过普通技术医师已知有效的任何途径。一个实施例为通过无菌注射器或某一其它机械装置(如输液泵)进行外周肠胃外施用。在某
些实施方式中，外周肠胃外途径为静脉内、肌肉内、皮下或腹膜内施用途径。

[0474] 在某些实施方式中，本文所描述的多肽缀合物以适用于非肠胃外途径施用，如口服、直肠、鼻或下呼吸道途径施用的形式配制。

[0475] 在某些实施方式中，本文所描述的多肽缀合物配制于固体配制物中，如冻干或喷雾干燥，然后将其在施用之前在合适的稀释剂溶液中重构。可采用标准药物配制技术，如
《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》
(D.B.Troy编,第21版,Lippincott,Williams&Wilkins,2006)中所描述的那些。可替代地，
本文所描述的多肽缀合物可被配制成用于通过以下施用：舌、舌下、颊内、口中、口腔、胃和
肠中、鼻、肺(例如通过细支气管和肺泡或其组合)、表皮、真皮、经皮、阴道、直肠、眼(例如通过结膜)、输尿管、经皮或肺途径。作为又另一选项，本文所描述的多肽缀合物可被配制成用
于通过经皮施用来施用，例如通过无针注射或通过贴剂(任选地为离子电渗贴剂)，或经粘
膜，例如含服。

[0476] 治疗方法

[0477] 在另一方面，本申请提供一种预防或治疗有需要的受试者的代谢病症的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物。

[0478] 还提供治疗方法，其包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物，从而治疗或预防病况或病症。在某些实施方式中，受试者已被鉴别为患有可能对
本文所提供的多肽缀合物响应的病症或病况。

[0479] 在某些实施方式中，代谢病症为糖尿病、肥胖症、超重、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、心血管如血脂异常、动脉粥样硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、糖尿病肾病、妊娠期
糖尿病、代谢综合征如代谢综合征X、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、终末期肝病、肝脂肪变性
(脂肪肝)、肝硬化或原发性胆汁性肝硬化(PBC)。

[0480] 在某些实施方式中，病况糖尿病包括所有任何形式的糖尿病，如高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低、I型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、青年的成年发病型糖尿病(MODY)、
妊娠期糖尿病和/或HbA1 C水平升高。

[0481] 在某些实施方式中，病况糖尿病包括糖尿病并发症，如血管病。

[0482] 在另一方面，本申请提供一种管理有需要的受试者的体重的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物。

[0483] 在另一方面，本申请提供一种减少有需要的受试者的食物摄入量的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物。

[0484] 在另一方面，本申请提供一种减轻有需要的受试者的体重的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物。

[0485] 在某些实施方式中，可使用本文所提供的多肽缀合物治疗或改善的病况或代谢病症包括人受试者的空腹血糖水平为125mg/dL或更大，例如130、135、140、145、150、155、160、
165、170、175、180、185、190、195、200或大于200mg/dL的病况。可在进食或禁食状态下或随
机确定血糖水平。代谢病况或病症还可包含受试者罹患代谢病况的风险增加的病况。对于
人受试者，此类病况包括100mg/dL的空腹血糖水平。

[0486] 在某些实施方式中，可使用本文所提供的多肽缀合物治疗或改善的病况或代谢病症包括人受试者的身体质量指数(BMI)为至少或高于25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39或40的病况。在某些实施方式中，人受试者的BMI在25到30、26到30、27到
30、28到30、25到29或25到28的范围内。

[0487] 本文所提供的多肽缀合物的治疗有效量将取决于本领域中已知的各种因素，例如受试者的体重、年龄、既往病史、目前的药物治疗、健康状况和交叉反应的可能性、过敏、敏
感性和不良副作用，以及施用途径和疾病发展的程度。本领域普通技术人员(例如医生或兽
医)可如这些和其它情况或要求所指示按比例减少或增加剂量。治疗有效量可为本文所提
供的融合多肽、多肽复合物和缀合物引发研究人员、医生或其它临床医师寻求的组织系统、
动物或人的生物或医学效应的量，所述效应包括减轻或改善所治疗的疾病或病症的症状，
即，支持可观察水平的一种或多种所需生物或医学效应，例如降低血糖、胰岛素、甘油三酯
或胆固醇水平；减轻体重；或改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰岛素敏感性的量。

[0488] 在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物可以0.01mg/kg到约100mg/kg(例如约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/
kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约
60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg
或约100mg/kg)的治疗有效剂量施用。在这些实施方式中的某些中，本文所提供的多肽缀合
物以约50mg/kg或更低的剂量施用，并且在这些实施方式中的某些中，剂量是10mg/kg或更
低、5mg/kg或更低、1mg/kg或更低、0.5mg/kg或更低或0.1mg/kg或更低。在某些实施方式中，
施用剂量可在治疗过程中改变。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可以高于后续施用
剂量。在某些实施方式中，取决于受试者的响应，施用剂量可在治疗过程中改变。

[0489] 在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物以不超过每天一次、每3天一次或每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次的给药方案向受试者(例如人)施用。在某些实
施方式中，本文所提供的多肽缀合物可以每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次的
给药间隔向受试者(例如人)施用。在低给药频率情况下的疗效具有提高患者的依从性和长
期治疗成功的潜能。当前可用的治疗索玛鲁肽每周给药一次。不希望受任何理论束缚，据信
本文所提供的某些多肽缀合物具有显著延长的半衰期并且适合于比索玛鲁肽更不频繁给
药来治疗病况，例如不超过每周给药一次(例如每8天一次、每9天一次、每10天一次、每11天
一次、每12天一次、每13天一次、每14天一次、每18天一次、每三周一次、每24天一次、每4周
一次或每月一次)。在某些实施方式中，给药方案为选自以下的连续给药方案：每周给药两
次、每周给药一次、每两周给药一次、每三周给药一次、每月给药一次或每两月给药一次。在
某些实施方式中，给药方案的给药间隔在约每3天一次到约每月一次，或约每周一次到约每
月一次的范围内。

[0490] 可以调整剂量方案以提供最优的期望效应(例如治疗效应)。举例来说，可施用单次剂量，或可随时间推移施用若干分次剂量。

[0491] 本文所提供的多肽缀合物可通过本领域中已知的任何途径施用，例如肠胃外(例如皮下、腹膜内、静脉内(包括静脉内输注)、肌肉内或皮内注射)或非肠胃外(例如口服、鼻
内、眼内、舌下、直肠或局部)途径。在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物皮下、静脉
内、肌肉内或皮内施用。

[0492] 多肽缀合物可单独施用或与一种或多种额外治疗手段或药剂组合施用。

[0493] 在某些实施方式中，当用于治疗代谢疾病时，本文所提供的多肽缀合物可与用于治疗代谢疾病或相关的任何医学病症的任何其它治疗剂组合施用。如本文所用，“组合施
用”包括作为相同药物组合物的部分同时施用、作为独立组合物同时施用或作为独立组合
物在不同时间施用。在本文使用短语“组合”时，在另一药剂之前或之后施用的组合物视为
与所述药剂“组合”施用，即使组合物和第二药剂通过不同途径使用。在可能的情况下，与本
文所提供的融合多肽、多肽复合物或缀合物组合施用的额外治疗剂是根据额外治疗剂的产
品信息表单中所列的时程，或根据《医师案头参考(Physicians'Desk Reference)》(《医师
案头参考》,第70版(2016))或本领域中众所周知的方案施用。可与包含本文所提供的多肽
缀合物药物组合物组合施用的化合物的实施例的非限制性列表包括罗格列酮
(rosiglitizone)、吡格列酮(pioglitizone)、瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈
(nateglitinide)、二甲双胍(metformin)、艾塞那肽(exenatide)、司格列汀
(stiagliptin)、普兰林肽(pramlintide)、格列吡嗪(glipizide)、格列美脲阿卡波糖
(glimeprirideacarbose)和米格列醇(miglitol)。

[0494] 试剂盒

[0495] 还提供用于实践所公开方法的试剂盒。此类试剂盒可包含如本文所描述的药物组合物，其包括编码本文所提供的多肽缀合物的核酸，包含此类核酸的载体和细胞，以及包含
此类含核酸化合物的药物组合物，其可提供于无菌容器中。任选地，还可包括关于如何使用
所提供的药物组合物治疗代谢病症的说明书，或使患者或医疗服务提供者可获得所述说明
书。

[0496] 在一个方面，试剂盒包含(a)药物组合物，其包含治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物或其突变形式；和(b)用于药物组合物的一个或多个容器。此类试剂盒还可包含其用
途的说明书；所述说明书可根据所治疗的精确代谢病症进行定制。说明书可描述试剂盒中
所提供的材料的用途和性质。在某些实施方式中，试剂盒包括患者进行施用以治疗代谢病
症的说明书，所述代谢病症如血糖水平升高、胰岛素水平升高、糖尿病、肥胖症、非酒精性脂
肪性肝炎(NASH)、心血管如血脂异常、动脉粥样硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、糖尿病肾
病、妊娠期糖尿病、代谢综合征如代谢综合征X、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、终末期肝病、肝
脂肪变性(脂肪肝)、肝硬化或原发性胆汁性肝硬化(PBC)。

[0497] 说明书可以印刷在基材(如纸或塑料等)上，并且可以作为包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器或其组件的标签中(即与包装相关联)等。在其它实施方式中，说明
书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如CD‑ROM、软盘等)上的电子存储数据文件存
在。在又一种其它实施方式中，实际说明书不存在于试剂盒中，而是提供用于如通过互联网
从远程源获得说明书的手段。此实施方式的一个实施例是包括网址的试剂盒，在所述网址
上可以查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。通常希望将试剂盒的一些或所有组
件包装在合适的包装中以维持无菌。试剂盒的组件可以包装在试剂盒容纳元件中以制造单
个易于处置的单元，其中试剂盒容纳元件(例如盒子或类似结构)可为或可不为气密容器，
例如以进一步保持试剂盒的一些或全部组件的无菌性。

[0498] 实施例1：GLP‑1蛋白的重组表达和纯化

[0499] 表1中列出的GLP‑1蛋白使用BL21(DE3)衍生菌株，由细菌大肠杆菌表达系统产生。编码GLP‑1前体的DNA针对大肠杆菌表达进行密码子优化，从头合成并且亚克隆到PET衍生
表达载体(Novagen)中。氨基酸取代通过修饰相应遗传密码实现。当在Terrific肉汤(TB)培
养基中细胞密度达到2.0的OD600时，用0.5mM异丙基β‑d‑硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GLP‑1前
体的过表达。在37℃下进行蛋白质诱导20‑22小时之后收集细胞。收集细胞，并且在20mM 
Tris pH 8.0，0.15M NaCl缓冲液中通过细胞粉碎机(900巴，两次)溶解。通过离心(8,000×
g，30min)收集含有GLP‑1蛋白的可溶性级分。通过蛋白酶去除标签之后，通过反相色谱纯化
蛋白质。每个步骤中的样品通过LC/MS表征以确认正确分子量。

[0500] 实施例2：在重组蛋白中并入非蛋白氨基酸

[0501] 将N端His‑Aib‑Glu‑Gly四肽或His‑Aib二肽溶解在有机溶剂中，并加入到溶于有机溶剂的GLP‑1蛋白溶液中。在室温下搅拌反应3小时。然后将哌啶加入反应溶液中以去除
Fmoc保护基。

[0502] 实施例3：具有CRM的GLP‑1化合物的制备

[0503] 向GLP‑1蛋白的NaOH溶液中逐滴添加CRM试剂(即HOOC‑(CH2)16‑CO‑gGlu‑2XADO)的有机溶剂溶液。将反应物在室温下搅拌1h。随后，将产物施加到反相色谱。由此得到如上
文所示的表1中列出的化合物。

[0504] 遵循供应商手册，使用针对不同缀合物优化的条件，用沃特世(Waters)BioAccord LC‑MS系统通过LC‑MS方法，或用沃特世Acquity UPLC系统通过UPLC检测并表征缀合的GLP‑
1蛋白。

[0505] 实施例4：体外活性

[0506] 方法：在具有或不具有1％人血清白蛋白(HSA)的情况下，使用过表达人GLP‑1受体和CRE荧光素酶报告基因的BHK细胞系测定体外GLP‑1活性。当不存在或存在1％HSA时，以最
高浓度为1nM或100nM对待测融合蛋白进行测试，并进行3倍连续稀释。用分子处理细胞4小
时之后，通过Steadylite plus试剂盒(珀金埃尔默(Perkin Elmer)，6066751)测量荧光素
酶活性。

[0507] 每种蛋白质的活性表示为从非线性回归分析导出的EC50。

[0508] 结论：在不含HSA补充剂的分析中，几乎所有分子显示与索玛鲁肽相当或甚至更好的效力。然而，在1％HSA存在下，不同分子展现不同程度的GLP‑1活性减少(即增加的EC50)。
表2中的数据表明，接头长度、脂肪酸位置和缀合脂肪酸部分的数目可能与GLP‑1活性相关。
如表2所示，与具有较长接头长度的分子相比，具有短接头长度(即12个氨基酸残基)的分子
(无论单酰化还是双酰化)都具有显著降低的GLP1活性。随着GLP‑1的C端残基与CRM残基(即
接头中的赖氨酸)之间的距离增加，分子在HSA存在下的GLP‑1活性看起来稳步提高。

[0509] 如表2所示，在1％HSA存在下，单酰基化分子002、010和011显示出比索玛鲁肽高得多的活性。对于双酰基化的分子012、016、004、006、007、005、001和061，在1％HSA存在下，均显示与索玛鲁肽相比相对较低的GLP‑1活性，但仍在可接受范围内。

[0510] 表2.GLP‑1多肽缀合物的体外活性。为了测量体外GLP‑1活性，使用过表达人GLP‑1受体的BHK细胞系。

[0511]

[0512]

[0513] 实施例5：C57瘦型小鼠中的体内活性

[0514] 方法：在第1天，10周龄雄性C57BL/6小鼠用蛋白质皮下注射一次。每天测量体重，并且每个处理组使用五只动物。监测每只动物的体重。BW减轻％＝100*(第n天的BW‑第1天
的BW)/(第1天的BW)。数据指示为平均值和标准误差(SEM)。计算0到8天的体重减轻(％)的
曲线下面积(AUCΔBW 0‑8d)。

[0515] 结论：分子001、002和012显示对体重控制的剂量依赖性效果(图1A、1B、1C和表3)。如图1D和表3所示，分子007和008较于分子012和016具有更低的效果，这与体外活性数据一
致。具有双脂肪酸的分子001、016和012都展现比索玛鲁肽更持久的效果，表明分子001、016
和012可具有更长的半衰期(图1A、1C和1D)。

[0516] 表3：C57瘦型小鼠研究中0到8天的体重减轻(％)的曲线下面积(AUCΔBW 0‑8d)。

[0517]

[0518] 实施例6：db/db小鼠中的体内活性

[0519] 方法：10周龄雄性db/db小鼠用蛋白质皮下注射一次。在不同时间测量空腹血糖，并且每组使用三只动物。Δ血糖是血糖减去基线水平。数据指示为平均值和标准误差
(SEM)。

[0520] 结论：分子001和002都显示对血糖控制的剂量依赖性效果(图2A和2B)。具有双脂肪酸的分子001展现比索玛鲁肽更持久的效果，表明分子002可具有更长的半衰期。

[0521] 方法：10周龄雄性db/db小鼠用蛋白质皮下注射一次。在不同时间测量非空腹血糖，并且每组使用五只动物。Δ血糖是血糖减去基线水平。数据指示为平均值和标准误差
(SEM)。计算0到192小时的Δ血糖的曲线下面积(AUCΔBG 0‑192h)。

[0522] 结论：分子012显示对血糖控制的剂量依赖性功效(图2C，表4)。具有双脂肪酸的分子012展现比索玛鲁肽更持久的效果。

[0523] 表4：图2C的db/db小鼠中0到192小时的非空腹Δ血糖(％)的曲线下面积(AUCΔBG 0‑192h)。

[0524]组 AUCΔBG 0‑192h(hr*mmol/L)
索玛鲁肽3nmol/kg ‑317.0
索玛鲁肽10nmol/kg ‑583.4
索玛鲁肽30nmol/kg ‑527.1
分子012 3nmol/kg ‑424.5
分子012 10nmol/kg ‑1004.5
分子012 30nmol/kg ‑1447.0

[0525] 实施例7：药代动力学测量

[0526] 方法：6‑8周龄雄性C57BL/6小鼠以30nmol/kg蛋白质的单次皮下剂量施用(n＝3/组)。在注射前(‑5分钟)、注射后0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时和192小时收集血浆样品。通过
ELISA分析测量血浆中的蛋白质浓度。基于显示每种蛋白质的血浆浓度与皮下注射后时间
的图，通过WinNonlin计算药代动力学参数。

[0527] 结论：分子001和012在小鼠中显示比索玛鲁肽和分子002更长的半衰期(表5)，与体内功效一致。

[0528] 表5：GLP‑1多肽缀合物在小鼠中的药代动力学参数。通过WinNonlin软件分析药代动力学数据。计算每种分子的Tmax、Cmax、T1/2、AUC。

[0529] PK参数 单位 索玛鲁肽 分子001 分子002 分子012Tmax hr 6.7 32 4 24
Cmax nmol/L 43.1 172.0 86.5 134
终末t1/2 hr 7.4 30.1 7.2 28.2
AUCtau hr*nmol/L 614.7(Tau＝24h) 12256(Tau＝168h) 1507(Tau＝48h) 7752(tau＝192h)

[0530] 方法：6‑8周雄性SD大鼠分别以15nmol/kg蛋白质的单次皮下剂量(n＝3/组)和15nmol/kg蛋白质的单次静脉内剂量(n＝3/组)施用。在施用前(‑5分钟)、皮下施用后0.5小
时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、32小时、48小时、72小时、96小时、120小时、
144小时、168小时、192小时、216小时和240小时收集血浆样品。在施用前(‑5分钟)、静脉内
施用后0.083小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、32小时、
48小时、72小时、96小时和120小时收集血浆样品。通过LC‑MS/MS方法测量血浆中多肽缀合
物的浓度。基于显示每种多肽缀合物的血浆浓度与皮下注射后时间的图，通过WinNonlin计
算药代动力学参数。

[0531] 结论：如表6中所示，分子001和012在大鼠中显示比索玛鲁肽更长的半衰期，据报道索玛鲁肽T1/2为12小时(皮下施用，数据来自FDA的非临床综述资料)。

[0532] 表6：GLP‑1多肽缀合物在大鼠中的药代动力学参数。通过WinNonlin软件分析药代动力学数据。计算每种分子的Tmax、Cmax、T1/2、AUC。

[0533]

[0534] NA：不可用。

[0535] 方法：10月龄雄性巴马小型猪(Bama minipig)分别用5nmol/kg GLP‑1多肽缀合物的单次皮下剂量(n＝2/组)和5nmol/kg蛋白质的单次静脉内剂量(n＝2/组)施用。在施用前
(‑5分钟)、皮下施用后0.5小时、1小时、3小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、168小时、336小时、504小时和672小时收集分子012和索玛鲁肽组的血浆样品。在施用前(‑5分
钟)、静脉内施用后0.083小时、0.5小时、1小时、3小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、168小时、336小时和504小时收集分子012和索玛鲁肽组的血浆样品。对于索玛鲁肽组，
通过ELISA分析测量血浆中的蛋白质浓度。对于分子012组，通过LC‑MS/MS方法测量血浆中
的蛋白质浓度。基于显示每种GLP‑1多肽缀合物的血浆浓度与施用后时间的图，通过
WinNonlin计算药代动力学参数。

[0536] 结论：分子012在小型猪中显示比索玛鲁肽更长的半衰期(表7)。

[0537] 表7：GLP‑1多肽缀合物在小型猪中的药代动力学参数。通过WinNonlin软件分析药代动力学数据。计算每种分子的Tmax、Cmax、T1/2、AUC。

[0538]

[0539] 实施例8：疾病模型中的功效研究

[0540] 在疾病动物模型(如db/db小鼠)中评定所选分子以确定体重、食物摄入量、血糖功效以及长期研究中的剂量效应。还测量一些生物标记，包括空腹胰岛素、血浆甘油三酯、胆
固醇、肝甘油三酯和炎症生物标记(ALT、AST和CRP)。

[0541] 方法：

[0542] 22周龄DIO雄性C57BL/6小鼠(约50g)每隔一天(Q2D)用指定GLP‑1多肽缀合物(即，分子012)皮下注射一次，持续25天。一周两次测量食物摄入量和体重，并且一周一次测量空
腹血糖。每个治疗组使用五只动物。对每只动物分别监测体重和空腹血糖，但在一起测量每
组动物的食物摄入量。第1天和第25天是分子给药的第一天和最后一天。数据指示为平均值
和标准误差(SEM)或合并值。通过单因素方差分析(One‑way ANOVA)进行统计分析。第25天
的体重减轻通过‑1*(BW减轻％‑媒剂组的BW减轻％)计算；累积食物摄入量减少通过‑100*
(累积食物摄入量‑媒剂的累积食物摄入量)/媒剂的累积食物摄入量计算。

[0543] 结论：在DIO研究中，如图3A、3B和表8所示，分子012显示对体重减轻、食物摄入量减少和血糖控制的剂量依赖性功效。

[0544] 表8第25天DIO小鼠的食物摄入量减少和体重减轻

[0545]

[0546] 实施例9：非人灵长类动物中的PK研究。

[0547] 在猴中评定所选分子的药代动力学。进行皮下和静脉注射两种给药方式。

[0548] 方法：3‑5岁雄性食蟹猴以5nmol/kg蛋白质的单次皮下剂量(n＝2/组)施用。在注射前(‑5分钟)、注射后2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、216小时、288小时、360小时、432小时和504小时收集索玛鲁肽组的血浆样品。
在注射前(‑5分钟)、注射后0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、48小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时、216小时、288小时、432小时和504小时收集012
组的血浆样品。对于索玛鲁肽组，通过ELISA分析测量血浆中的蛋白质浓度。对于012组，通
过LC‑MS/MS方法测量血浆中的蛋白质浓度。基于显示每种蛋白质的血浆浓度与皮下注射后
时间的图，通过WinNonlin计算药代动力学参数。

[0549] 结论：分子012在猴中显示比索玛鲁肽和分子002更长的半衰期(表9)。

[0550] 表9：GLP‑1多肽缀合物在食蟹猴中的药代动力学参数。通过WinNonlin软件分析药代动力学数据。计算每种分子的Tmax、Cmax、T1/2、AUC。

[0551]PK参数 单位 索玛鲁肽 分子012
Tmax hr 7 24
Cmax nmol/L 48.1 58.0
终末t1/2 hr 65 122
AUCtau hr*nmol/L 2876(Tau＝96h) 10989(Tau＝504h)

[0552] 实施例10：免疫原性评定。

[0553] 还通过计算机模拟(iTope和TCED方法)和离体(EpiScreen)方法评定所选GLP‑1多肽缀合物的免疫原性。

[0554] 实施例11：人血清白蛋白结合

[0555] 方法：在Biacore 8K仪器中通过表面等离子体共振表征分子与血清白蛋白的结合。使来自不同物种的血清白蛋白共价结合到CM5传感器芯片表面，直到达到4000RU。用1M
乙醇胺以10μL/min的流动速率封闭芯片420s。将每种分子样品稀释并且以30μL/min的流动
速率注射，以允许与芯片结合的白蛋白结合120s并且解离300s。将不含分子的结合缓冲液
以20秒的流动速率在芯片上传送，以允许结合的分子自发解离30秒。

[0556] 结论：分子004、001、006和012显示出比索玛鲁肽和分子002更高的人血清白蛋白结合亲和力(参见表10)，这与PK数据一致。

[0557] 表10：人血清白蛋白结合亲和力

[0558]  KD(μM) Rmax(RU)
索玛鲁肽 2.82 55.2
分子004 0.716 546.0
分子001 0.697 498.3
分子006 0.746 398.6
分子012 0.376 207.3
分子002 9.11 307.8