一种抗体及其促进皮肤成纤维细胞增殖的用途

摘要

本发明涉及一种抗体及其促进皮肤成纤维细胞增殖的用途。本发明的效果是通过抑制P53活性进而提高成纤维细胞活性防止衰老进而高产外囊泡而获得的。所述抑制P53活性的是单克隆抗体，将所述单克隆抗体加入到成纤维细胞的培养基中后能够抑制成纤维细胞的衰老提高成纤维细胞分泌外囊泡的含量，而且所述外囊泡的抗衰老活性较好，适宜于制备抗衰老美容或者药物产品，具有较好的市场应用价值。

权利要求

1.一种特异性结合P53活性的单克隆抗体2F6，其特征在于单克隆抗体的轻链可变区序列为SEQ ID NO：2，重链可变区序列为SEQ ID NO：3所示。

说明书

一种抗体及其促进皮肤成纤维细胞增殖的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及制药领域，具体的，涉及一种抗体及其促进皮肤成纤维细胞增殖的用途。

背景技术

[0002] 外囊泡也叫外泌体是细胞所分泌的直径为30～150nm的双层磷脂囊泡，其中含有多种miRNA、蛋白质和细胞调控因子；经研究发现，外泌体可以在细胞间进行通讯，传递生物信息和蛋白质，起到调节受体胞的作用。

[0003] 细胞外囊泡在人体中广泛存在,在生理和病生理过程中起重要作用。细胞外囊泡又在多种体液中被鉴定,这是它们可以作为疾病标志物的基础,因此科学家和临床医生积极研究它们在诊断方面的作用。第一个证明细胞外囊泡与受体细胞相互作用的证据是前列腺小体(prostasomes)能够促进精子细胞的活度。在过去的几年中,细胞外囊泡被证明具有非常广泛的生物学功能。EV可以作为重要的细胞间近距离或远距离沟通的媒介。肿瘤细胞或肿瘤微环境的其他细胞分泌外泌体,通过促进血管新生、肿瘤细胞迁移或肿瘤转移来促进肿瘤的发展。肿瘤细胞产生的囊泡也含有免疫抑制分子,可以抑制T淋巴细胞或者NK细胞,或者促进调节性T细胞的分化来抑制免疫反应。上皮细胞或神经系统也具有产生细胞外囊泡的功能。小肠上皮细胞释放的细胞外囊泡与验证条件下的抗原呈递有关,这些细胞外囊泡可以使上皮细胞的作用范围扩大。在呼吸道和支气管肺泡灌洗液中的细胞外囊泡可以提高哮喘病人气管上皮细胞促炎性细胞因子的释放。

[0004] 目前的研究证明了膜结合形态发生素与细胞外的关系,包括Wnt、Notch受体DII4。通过Wnt信号,成纤维细胞产生的外泌体可以促进乳腺癌细胞动态发展。同样地,在果蝇中,Wnt相关的EV可能与Wnt的在组织中的梯度形成有关。在神经系统中,神经元、少突神经胶质细胞、小神经胶质细胞分泌细胞外囊泡,并且可以互相作为受体细胞。细胞外囊泡被证明参与神经突触生长和神经元存活。这些分泌型囊泡被认为通过与受体细胞作用而传播致病源。最近,将鉴定细胞外囊泡作为肿瘤标志物与其分子细胞生物学机制结合的研究逐渐增多。外泌体可以由于其表面蛋白所具有的优势,通过生物工程方法被改造成为疾病治疗工具。另外,外泌体表面不同的整合素组合形式决定了外泌体受体细胞的特异性,从而决定癌症组织转移的特异性。脂肪组织产生的外泌体中富含多种miRNA,可以调节远端组织的基因表达水平,从而调节远端组织或细胞的代谢。

[0005] 现有的研究表明，理论上任何种类的细胞都可以分泌外泌体；不过，目前在护肤领域展开研究的外泌体主要是来自人类多能诱导干细胞(IPSC)、骨髓间充质干细胞(MSC)和人成纤维细胞。多项最新研究中证实外泌体具有显著的皮肤抗老效果。外泌体具有促进成纤维细胞新生和胶原合成的效果。通过细胞划痕试验，观察外泌体对成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。实验结果显示来自骨髓间充质干细胞和成纤维细胞的外泌体都能显著促进成纤维细胞的增殖并增加胶原的合成。

[0006] 皮肤的衰老主要有两大诱因：一是随着年龄增长所导致的内源性自然衰老；二是以紫外线伤害带来的光老化为主的各种外源性衰老。采用外囊泡或者外泌体来治疗皮肤衰老是目前研究的重点方向。但是现有技术中目前存在的难题是成纤维细胞在培养的过程中容易衰老，导致制备得到的外泌体活性低、产量低，因此，提高成纤维细胞的活性是研究的重点方向。

发明内容

[0007] 本发明克服现有技术的缺陷，提供一种促进成纤维细胞增殖以及高产外囊泡的方法。

[0008] 申请人基于现有技术的研究成果：通过下调P53的表达能够抑制人成纤维细胞的衰老进而提高细胞密度。

[0009] 进一步的，本发明还提供一种特异性抑制P53活性的单克隆抗体2F6。

[0010]

[0011]

[0012] 轻链可变区(SEQ ID NO：2)

[0013] DIVITQRPALMAASPGEKVTITCPYKEVIHNYYMGWYQQKSGISPKPWIYALECQHEGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCPKHIMLTVVFGAGTKLELK

[0014] 重链可变区(SEQ ID NO：3)

[0015] EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSPDKTAWIKQRPGQGLEWIGNQGYMNLWVYAKFMLIGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGCRKQFKYWGLGTTLAVSS。

[0016] 进一步的，所述单克隆抗体在某些实施方案中如本领域众所周知的，鼠单克隆抗体的抗原结合特异性主要由高变互补决定区(CDR)序列决定。鼠源抗体通常包含6个CDR序列，3个在抗体轻链上，3个在重链上。如上所述，鼠源抗体的嵌合，人源化或人源化形式可以通过诸如CDR移植的技术构建，其中鼠源CDR序列被插入到例如人抗体框架和恒定区序列中，或者通过将整个鼠源可变区序列连接到人抗体恒定区序列上。在可供选择的实施方案中，抗体的可变区序列可以通过例如化学合成和编码抗体的整个轻链和重链可变区的寡核苷酸的组装来构建。

[0017] 本发明还提供了编码所述单克隆抗体的重链可变区的基因；含有上述基因的重组载体；和导入上述基因或重组载体的宿主细胞。

[0018] 上述基因不仅包括编码重链可变区的序列，还包括具有与基因及其片段基本相同的相同核苷酸序列的多核苷酸。具有与该基因基本相同的相同核苷酸序列的多核苷酸可以与本发明的多肽具有至少80％，优选90％，更优选至少95％的同源性。如上所述，本发明的多核苷酸可包括其中一个或多个核苷酸序列被取代，缺失或插入的变体，只要该变体编码具有同等活性的蛋白质即可。

[0019] 各种宿主细胞可用于表达根据本发明的单克隆抗体的重链可变区。例如，宿主细胞可以是原核细胞，例如埃希氏菌，芽孢杆菌，链霉菌，假单胞菌，变形杆菌或葡萄球菌真菌，如曲霉酵母菌，如毕赤酵母，酵母菌，裂殖酵母或神经孢子虫，其它低级真核细胞，或真核细胞如动物细胞和植物细胞。

[0020] 作为将本发明的重组载体导入宿主细胞并转化其的方法，可以使用常规的基因操作方法。例如，作为物理方法，显微注射，脂质体依赖法，直接DNA摄取法，受体介导的DNA转移法，细胞纯化法，细胞纯化法，细胞纯化法，细胞纯化法，细胞纯化法，细胞纯化法，细胞纯化法等。可以使用定向DNA转移或病毒介导的基因转移。

[0021] 进一步的，本发明提供一种通过抑制P53活性进而提高成纤维细胞活性防止衰老进而高产外囊泡的方法。

[0022] 进一步的，本发明还提供的外囊泡的制备方法，具体步骤包括：

[0023] 将成纤维细胞HSF培养于DMEM(含有10％胎牛血清、1％双抗混合液)培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱培养，细胞生长至80％以上，用PBS冲洗2～3次，加入1mL0.25％胰蛋白酶常温消化30～60s，轻拍瓶壁使细胞脱落，加入2倍体积的含胎牛血清培养基终止消化，用枪管吹打均匀，以1000r/min离心8min，去上清，沉淀加入含有10％胎牛血清、1％双抗混合液以及终浓度为100μg/mL的2F6单克隆抗体的高糖DMEM培养基置于标准培养箱内继续培养96h。

[0024] 收集上清液，300×g离心10min，去除死细胞和大的细胞碎片，2000×g离心15min，去除死细胞和细胞碎片，10000×g/min离心30min去除细胞碎片较大的囊泡，将上清液转移至超速离心管中，106×g离心70min，去除上清液，收集沉淀即得到外囊泡，以上操作均在4℃，无菌条件下进行。

[0025] 进一步的，本发明还提供一种采用上述方法制备的外囊泡在制备抗衰老的药物组合物中的用途。

[0026] 发明的组合物可通过与通常使用的稀释剂或赋形剂例如填充剂，增量剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂和表面活性剂混合而制备用于口服或胃肠外给药。口服固体制剂是片剂，丸剂，散剂，颗粒剂，胶囊和片剂。这些固体制剂是通过将本发明的组合物与一种或多种合适的赋形剂如淀粉，碳酸钙，蔗糖或乳糖，明胶等混合而制备的。其中还可包括润滑剂如硬脂酸镁和滑石。用于口服给药的液体制剂是混悬液，溶液，乳剂和糖浆，并且上述制剂可以含有各种赋形剂，例如润湿剂，甜味剂，芳香剂和防腐剂。

[0027] 本发明的药物组合物可以是胃肠外给药的制剂是灭菌的水溶液，水不溶性赋形剂，悬浮液和乳剂。

[0028] 水不溶性赋形剂和悬浮液可含有丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射酯如乙醇等。

[0029] 本发明的用于预防或治疗MERS的组合物可以口服或胃肠外给药，胃肠外给药包括腹膜内注射，直肠内注射，皮下注射，静脉内注射，肌肉内注射和胸内注射。

[0030] 进一步的，本发明还提供一种采用上述方法制备的外囊泡在制备抗皮肤衰老的美容产品中的用途。

[0031] 本发明的皮肤美容用产品的有效成分是在基质中混合的外囊泡，这些有效成分的含量通常为约0.0001‑10重量％，优选约0.001‑5重量％。从上述活性成分的含量范围可以得到令人满意的抗衰老效果。

[0032] 在本发明中，迄今为止使用的所有种类的化妆品基础材料，例如，各种醇，动物或植物脂肪，表面活性剂，果胶，羧甲基纤维素，藻酸盐等，以及其它添加剂，例如稳定剂，颜料，芳香剂等。可以适当地混合，并且如果需要，可以通过加热熔化共混物，或者可以熔化和搅拌共混物。本发明的组合物可用于这些和所有其它相当大的形式。

[0033] 有益效果

[0034] 本发明提供一种通过抑制P53活性进而提高成纤维细胞活性防止衰老进而高产外囊泡的方法。所述抑制P53活性的是单克隆抗体，将所述单克隆抗体加入到成纤维细胞的培养基中后能够抑制成纤维细胞的衰老提高成纤维细胞分泌外囊泡的含量，而且所述外囊泡的抗衰老活性较好，适宜于制备抗衰老美容或者药物产品，具有较好的市场应用价值。

附图说明

[0035] 图1 Western blot检测结果图

[0036] 图2成纤维细胞增殖效果图

具体实施方式

[0037] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0038] 实施例1P53单克隆抗体的制备

[0039] 以重组人p53蛋白(abcam，货号ab84768，序列如SEQ ID NO：1所示)作为免疫原。将重组蛋白与等体积的Freund完全佐剂充分混合，BALB/c小鼠皮下多点注射重组蛋白50μg/只。初次免疫4周后背部皮下多点注射加强免疫，4周后再次加强免疫，每次所用免疫原50μg/只。第3次免疫后7～10d尾静脉采血ELISA测血清抗体效价。于融合前4d选择抗体滴度最高的1只小鼠腹腔注射无佐剂抗原150μg加强免疫。

[0040] 无菌取加强免疫BALB/c小鼠脾细胞，以50％聚乙二醇作为融合剂，按1∶7将Sp2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞进行融合，加入HAT选择性培养液，接种96孔板，置37℃、5％CO2培养箱中培养，第8天后吸取生长克隆孔中的培养上清，分别用重组蛋白作为包被抗原用ELISA进行初筛，筛选出只与重组蛋白反应的阳性杂交瘤细胞，用有限稀释法进行3～4轮亚克隆，直至所有单克隆均为阳性时，扩大培养和建株。得到了较为稳定单克隆抗体杂交瘤细胞3E4和2F6。

[0041] BALB/c小鼠腹腔注射3E4和2F6杂交瘤细胞大约2×106个/只，约8d后待小鼠腹部显著膨隆，吸取腹水，2000r/min，离心20min，取上清。经平衡缓冲液稀释后，0.45μm滤器过滤。将过滤后腹水以1ml/min流速通过Purify蛋白纯化仪，平衡缓冲液洗去杂蛋白，洗脱液(甘氨酸‑盐酸pH2.8100mmol/L)洗脱抗体，收取OD280＞0.5的抗体，经PBS 4℃透析后进行SDS‑PAGE电泳鉴定，经鉴定得到了较为纯净的单克隆抗体。

[0042] 实施例2 2F6单克隆抗体亲和力、亚型鉴定、序列分析以及特异性鉴定[0043] 利用AMC传感器，纯化出来的2F6抗体用PBST稀释到10ug/ml，重组蛋白用PBST进行梯度稀释：444.4nmol/ml、222.2nmol/ml、111.1nmol/ml、55.6nmol/ml、27.8nmol/ml、0nmol/ml；运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据，结果如表1所示。(KD表示平衡解离常数即亲和力)[0044] 表1 2F6单克隆抗体亲和力结果

[0045]抗体名称 KD(M)
2F6单克隆抗体 9.86E‑09

[0046] 从表1的结果可以看出，2F6单克隆抗体亲和力较强，可以达到9.86E‑09M。同时将纯化出的针对P53蛋白的2F6单克隆抗体抗体经抗体亚型鉴定试剂盒验证，分析抗体亚型，结果显示结果为IgG2a亚型，Kappa链。

[0047] 从2F6杂交瘤细胞株中提取中RNA，反转录合成cDNA，Light Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIg‑kR引物进行扩增，Heavy Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、NestedUniversal Primer A(NUP)和mIg‑HR引物进行扩增。扩增产物进行测序，将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，获得抗体的轻重链序列分别如下所示。

[0048] 表2 2F6单克隆抗体亲CDR序列

[0049] CDR名称 CDR序列LCDR1 PYKEVIHNYYMG
LCDR2 ALECQHE
LCDR3 PKHIMLTVV
HCDR1 PDKTA
HCDR2 NQGYMNLWVYAKFMLI
HCDR3 CRKQFKY

[0050] 轻链可变区(SEQ ID NO：2)

[0051] DIVITQRPALMAASPGEKVTITCPYKEVIHNYYMGWYQQKSGISPKPWIYALECQHEGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCPKHIMLTVVFGAGTKLELK

[0052] 重链可变区(SEQ ID NO：3)

[0053] EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSPDKTAWIKQRPGQGLEWIGNQGYMNLWVYAKFMLIGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGCRKQFKYWGLGTTLAVSS。

[0054] 采用Westernblot法鉴定2F6 mAb的特异性，将p53重组蛋白、血纤维蛋白以及BSA进行SDS‑PAGE电泳，转膜后，将2F6 mAb以1∶500稀释后进行孵育，HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶7500稀释)作为二抗，按Westernblot步骤操作。结果显示该mAb可与P53重组蛋白特异性反应(有特异性反应条带)，BSA和血纤维蛋白均处无任何反应(图1)，这说明本发明的抗体具有较好的特异性。

[0055] 实施例3成纤维细胞的培养

[0056] 将成纤维细胞HSF培养于DMEM(含有10％胎牛血清、1％双抗混合液)培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱培养，细胞生长至80％以上，用PBS冲洗2～3次，加入1mL0.25％胰蛋白酶常温消化30～60s，轻拍瓶壁使细胞脱落，加入2倍体积的含胎牛血清培养基终止消化，用枪管吹打均匀，以1000r/min离心8min，去上清，沉淀加入适量完全培养基制成单细胞悬液，调整浓度，将所得状况良好的对数生长期的HSF用于实验。取对数生长期的HSF以1×105个/mL接种于96孔培养板培养，每孔接种90μL，置于细胞培养箱内于37℃、5％CO2培养，24h后取出设立不同浓度2F6单抗实验组、阴性对照组(含等量细胞重悬液)和空白对照组(含等量的DMEM培养液)。实验组分别加入2F6单抗10μL/孔，使其终浓度分别为100、50、10和1μg/mL，阴性对照组和空白对照组每孔加入等量的DMEM培养液。每种浓度设至少3个复孔，振荡均匀后将其置于标准培养箱内继续培养，于给药96h后取出加MTT20μL/孔，继续培养4h后加入DMSO150μL/孔，振荡均匀后于酶标仪波长为490nm处测各孔的吸光度值(OD)，结果如图2所示。

[0057] 从图2的结果可以看出，2F6单克隆抗体给药96h后成纤维细胞具有较好的降低细胞凋亡进而促进细胞增殖的效果，其中100μg/mL实验组后OD为4.1，具有较好的增殖效果，给药和不给药的差异显著(P<0.05)。

[0058] 采用Westernblot法鉴定96h后成纤维细胞内p53蛋白的表达量，结果如表3所示。

[0059] 表3成纤维细胞内p53蛋白的表达量

[0060]

[0061]

[0062] 从表3的结果可以看出，实验组相对于阴性对照组和空白组，培养96h后成纤维细胞内p53蛋白表达量均被得到显著的抑制(*P<0.05)。这也说明通过抑制P53蛋白的活性，能够有效抑制成纤维细胞的凋亡，进而促进成纤维细胞的增殖。

[0063] 实施例4在含2F6抗体培养基条件下成纤维细胞外囊泡的制备

[0064] 将成纤维细胞HSF培养于DMEM(含有10％胎牛血清、1％双抗混合液)培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱培养，细胞生长至80％以上，用PBS冲洗2～3次，加入1mL0.25％胰蛋白酶常温消化30～60s，轻拍瓶壁使细胞脱落，加入2倍体积的含胎牛血清培养基终止消化，用枪管吹打均匀，以1000r/min离心8min，去上清，沉淀加入含有10％胎牛血清、1％双抗混合液以及终浓度为100μg/mL的2F6单克隆抗体的高糖DMEM培养基置于标准培养箱内继续培养96h。

[0065] 规模化操作上述培养步骤，收集50mL上清液，300×g离心10min，去除死细胞和大的细胞碎片，2000×g离心15min，去除死细胞和细胞碎片，10000×g/min离心30min去除细胞碎片较大的囊泡，将上清液转移至超速离心管中，106×g离心70min，去除上清液，收集沉淀共计1.20g，用PBS溶解沉淀，得到外囊泡，以上操作均在4℃，无菌条件下进行。

[0066] 实施例5对照成纤维细胞外囊泡的制备

[0067] 将成纤维细胞HSF培养于DMEM(含有10％胎牛血清、1％双抗混合液)培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱培养，细胞生长至80％以上，用PBS冲洗2～3次，加入1mL0.25％胰蛋白酶常温消化30～60s，轻拍瓶壁使细胞脱落，加入2倍体积的含胎牛血清培养基终止消化，用枪管吹打均匀，以1000r/min离心8min，去上清，沉淀加入含有10％胎牛血清、1％双抗混合液的高糖DMEM培养基置于标准培养箱内继续培养96h。

[0068] 规模化操作上述培养步骤，收集50mL上清液，300×g离心10min，去除死细胞和大的细胞碎片，2000×g离心15min，去除死细胞和细胞碎片，10000×g/min离心30min去除细胞碎片较大的囊泡，将上清液转移至超速离心管中，106×g离心70min，去除上清液，收集沉淀共计0.95g，用PBS溶解沉淀，得到外囊泡，以上操作均在4℃，无菌条件下进行。

[0069] 从实施例5的结果可以看出，不采用单抗处理，细胞活性降低导致外囊泡的整体产量也相对降低。

[0070] 实施例6成纤维细胞外囊泡活性验证

[0071] 将实施例4和实施例5制备的外囊泡调整为相同浓度。

[0072] 实验动物分组：50只小鼠按体重随机分为5组，每组10只，分别为：正常对照组(NC)、模型对照组(MC)、阳性对照组(PC)、实施例4外囊泡干预组(WNP4)、实施例5外囊泡干预组(WNP5)。除NC组小鼠皮下注射等体积生理盐水外，其他各组皮下注射D‑半乳糖150mg/kg；造模同时给予灌胃干预，NC和MC组灌胃等体积蒸馏水，PC组灌胃100mg/kg/d等体积Vc，其余组别小鼠灌胃实施例4或5的外囊泡10mg/kg/d，持续处理56d。实验结束后所有小鼠禁食12h，摘眼球取血，断颈法快速处死。所得血样于3500r/min离心15min，分离血清样本；SOD是体内重要的抗氧化酶，其活力的提高可间接反映机体清除自由基能力的增强，削弱对脂质过氧化作用的损伤，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。MDA是氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而形成的脂质过氧化物，其浓度的变化可间接反映组织中氧自由基浓度的变化量，是常用的膜脂过氧化指标。因此，检测SOD和MDA的含量是检测外囊泡活性的重要指标。SOD和MDA水平含量按照试剂盒说明书方法测定。结果如表4所示。

[0073] 表4各组分对SOD和MDA含量的影响

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[0075]

[0076] 如表4所示，MC组小鼠的血清中的SOD水平显著低于NC组(P<0.05)，MDA浓度显著高于NC组(P<0.05)，由此可见，D‑半乳糖致小鼠衰老模型制备成功。WNP4组和WNP5组小鼠血清的SOD活性均高于MC组，特别是WNP4组的提高效果尤其显著达到了149.47±3.22，WNP4组和WNP5组小鼠血清的MDA活性均低于MC组，特别是WNP4组的提高效果尤其显著达到了11.24±0.46，这充分说明2F6单克隆抗体处理获得的外囊泡具有更高的活性。这也表明外囊泡通过提高小鼠的抗氧化酶活性进而达到清除体内自由基，缓解机体氧化应激水平的作用。

[0077] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。