一种能特异性结合艰难拟梭菌毒素TcdB的DNA适配体及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种能特异性结合艰难拟梭菌毒素TcdB的DNA适配体及其制备方法和应用，所述DNA适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述DNA适配体采用SELEX技术筛选得到，筛选过程简单，筛选成本低，筛选耗时短，而且筛选出的适配体已经克隆到pUC19载体上，且已经转化至大肠杆菌DH5α中，可以直接通过该菌种制备大量该适配体。该适配体可以特异性地与TcdB结合，降低其对肠上皮的毒性作用，且抑制肠组织局部的巨噬细胞分泌IL‑1β和IL‑6，缓解炎症反应对肠组织的损伤，从而有效地治疗艰难拟梭菌的感染。

权利要求

1.一种能特异性结合艰难拟梭菌毒素TcdB的FBD区的DNA适配体，其特征在于：所述DNA适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.根据权利要求1所述的能特异性结合艰难拟梭菌毒素TcdB的FBD区的DNA适配体，其特征在于：所述DNA适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，SEQ ID No.5所示的核苷酸序列是由SEQ ID No.4所示序列向3’和/或5’端延伸所得到的序列。

3.一种权利要求1 2任一项所述的能特异性结合艰难拟梭菌毒素TcdB的FBD区的DNA适~配体在制备治疗艰难拟梭菌感染的药物中的应用。

4.一种治疗艰难拟梭菌感染的药物，其含有权利要求1 2任一项所述DNA适配体。

~

说明书

一种能特异性结合艰难拟梭菌毒素TcdB的DNA适配体及制备

方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子微生物学和感染免疫学技术领域，具体涉及一种能特异性结合艰难拟梭菌毒素TcdB的DNA适配体及制备方法和应用，该适配体能特异性、高亲和力地结合艰难拟梭菌毒素B（TcdB），可用于治疗艰难拟梭菌感染。

背景技术

[0002] 艰难拟梭菌（Clostridioides diffcile，CD）是导致感染性腹泻入院的最主要病原菌，可引起不同程度的腹泻、发热、便血乃至肠穿孔及腹腔感染，甚至导致患者死亡。CD毒性高，对大多数抗生素具有高抗性且多重耐药株增多、感染愈后复发率高，是一种非常难治的感染病，其发病率、死亡率的持续上升给大众健康带来严重威胁，亟需探索新的治疗方法。

[0003] CD引起发病的主要效应物是其分泌的多种毒素，其中毒素B（TcdB）在致病过程中最为关键，单独的TcdB即可在动物模型中诱导死亡。TcdB通过受体介导进入宿主细胞内部，破坏细胞肌动蛋白骨架从而引发细胞凋亡、变性、固缩，纤维素、黏蛋白渗出形成假膜性炎症，引起渗出性腹泻；另一方面，TcdB也可刺激免疫细胞释放过量炎性因子，引发炎症级联反应进而加重对正常细胞的损伤，且能导致肠粘膜和血管通透性增强从而使机体保护屏障丧失，促进TcdB进入肠组织固有层，导致肠组织损伤进一步加重。

[0004] TcdB蛋白是含有2366个氨基酸序列的巨大蛋白，主要分为四个结构功能域，其中联合重复寡肽（CROPs，1834‑2366位氨基酸）结构域和近年新发现的卷曲蛋白受体结合区（FBD，1285‑1804位氨基酸）能与细胞表面受体结合，介导TcdB进入细胞，之后经历一系列复杂的生化反应，使代表TcdB生物活性的葡糖基转移酶结构域（GTD，1‑543位氨基酸，即氨基末端1‑1629 bp基因序列）释放进而发挥其毒性作用。若阻断TcdB与宿主细胞的结合，从而抑制TcdB进入细胞内，有望成为减轻细胞损伤的抗CD治疗新方法。然而针对CROPs制备的抗体对既感染者防治效果不稳定，且个体对其反应差异较大，推测CROPs可能并不是最佳的抗原表位。当TcdB去除CROPs后，仍然表现出较强的细胞毒性和与宿主细胞的高亲和力。TcdB的主要受体中，只有卷曲蛋白（Frizzled，FZD）是FBD区的受体且在结肠上皮中表达，且FBD区能单独结合细胞，可能是更理想的药物作用靶点。

[0005] FZDs是Wnt信号通路的关键受体蛋白，参与调控细胞的生长、分化和自我更新。结肠上皮细胞依赖Wnt信号发挥产生新细胞、调节增殖、修复和维持结肠组织的功能。TcdB与结肠干细胞Wnt信号竞争性结合FZDs受体后，通过抑制Wnt信号通路可导致结肠上皮的破坏，因此阻断或抑制TcdB与FZDs受体的结合，恢复Wnt信号活性以维持结肠细胞的健康可成为治疗CD感染的重点。

[0006] 巨噬细胞是肠组织中常见的免疫细胞，TcdB在破坏肠上皮细胞的同时，还可刺激巨噬细胞分泌大量促炎细胞因子（如IL‑1β、IL‑6等），而这些细胞因子能杀伤正常肠上皮细胞，从而进一步加剧肠组织损伤。巨噬细胞表面也表达FZDs受体，如果阻断或抑制TcdB与FZDs受体的结合，有望能减轻巨噬细胞介导的过度炎症反应，从而缓解巨噬细胞分泌的炎症因子对正常肠上皮细胞的损伤。

[0007] 指数富集的配基系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands  by Exponential Enrichment，SELEX），利用该技术可以从随机单链核苷酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核苷酸适配体，SELEX技术的基本构思是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，用它与靶物质混合，形成靶物质—核苷酸的复合物，洗掉未与靶物质结合的核苷酸，分离与靶物质结合的核苷酸，以此核苷酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下轮的循环筛选过程，通过重复的筛选与扩增，当筛选循环中已富集寡核苷酸库的亲和力不再增加时，一般在6‑20个筛选循环后，即可得到与靶物质具有高度亲和力与高特异性的适配体，对筛选出来的克隆进行测序和序列分析，详细分类。分离得到与靶物质相结合的寡核苷酸链的常用方法有微孔板法，即将靶分子固定在微孔板上，用小牛血清封闭其余的位点，然后加入随机寡核苷酸文库共育，之后通过简单洗涤即可除去未结合的寡核苷酸序列，再用高盐溶液洗脱回收结合的寡核苷酸序列。单链寡核苷酸库的两端是固定序列作为PCR扩增引物结合位点，中间为随机序列，随机序列长度在20‑80nt。随机单链核苷酸序列库与抗体相比，适配体分子量小、空间位阻小，能有效的接近抗体分子不能靠近的靶位并抑制其活性。

[0008] SELEX已成功运用于许多靶分子的筛选。然而到目前为止，利用SELEX筛选技术开发寡核苷酸适配体在抗艰难拟梭菌感染的应用中，只有将其作为诊断试剂的报道（苏恒等，国际检验医学杂志，2018年，第39卷第20期；Meng Liu et al, Angew Chem Int Ed Engl, 2020, 59(20):7706‑7710.），还没有成功利用SELEX筛选技术开发寡核苷酸适配体作为药物在抗艰难拟梭菌感染中的应用，也没有将TcdB的FBD区作为靶标筛选适配体的报道。

[0009] 由于TcdB的FBD区可竞争性结合TcdB的关键受体FZDs，进而抑制Wnt信号通路从而导致结肠上皮的破坏。TcdB的FBD区与CROPs区相比可能是更理想的药物作用靶点，为此我们拟针对TcdB的FBD区通过SELEX筛选出一种能特异性结合艰难拟梭菌毒素B的DNA适配体，作为减轻甚至恢复TcdB引起的Wnt信号传导抑制的潜在药物。

发明内容

[0010] 基于上述现有技术，本发明提供了一种能特异性结合艰难拟梭菌毒素TcdB的DNA适配体及制备方法和应用，该适配体采用SELEX技术筛选得到，筛选过程简单，筛选成本低。该适配体可以特异性地与TcdB结合，降低其对肠上皮的毒性作用，且抑制肠组织局部的巨噬细胞分泌IL‑1β和IL‑6，缓解炎症反应对肠组织的损伤，从而有效地治疗艰难拟梭菌的感染。

[0011] 实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

[0012] 一种能特异性结合艰难拟梭菌毒素TcdB的DNA适配体的制备方法，其步骤包括：

[0013] S01.构建一个单链寡核苷酸文库，扩增并回收该单链寡核苷酸文库；

[0014] S02.用该单链寡核苷酸文库与第一靶物质混合，形成第一靶物质—核苷酸的复合物，洗掉未与第一靶物质结合的核苷酸，分离与第一靶物质结合的核苷酸，以此核苷酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下轮的循环筛选过程，下一轮筛选过程中添加的第一靶物质较上一轮的添加量递减，通过重复的筛选与扩增，所述第一靶物质为TcdB毒素的FBD蛋白，TcdB毒素的FBD蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第1285‑1804位的氨基酸；

[0015] S03.当筛选循环中已富集寡核苷酸库的亲和力不再增加时，用该单链寡核苷酸文库与第二靶物质混合，形成第二靶物质—核苷酸的复合物，洗掉与第二靶物质结合的核苷酸，分离与第二靶物质不结合的核苷酸，以此核苷酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下轮的循环筛选过程，所述第二靶物质为TcdB毒素的CROPs蛋白，TcdB毒素的CROPs蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第1834‑2366位的氨基酸；

[0016] S04.重复步骤S02将已富集的寡核苷酸库与第一靶物质混合，筛选分离出与第一靶物质结合的核苷酸，直至亲和力不再增加，得到候选DNA适配体；

[0017] S05.使用ELONA法检测候选DNA适配体与TcdB毒素、TcdB毒素的FBD蛋白、TcdB毒素的CROPs蛋白结合的特异性，选出与TcdB毒素、TcdB毒素的FBD蛋白特异性结合后OD450不小于0.6，但与TcdB毒素的CROPs蛋白结合后OD450不大于0.2的候选DNA适配体，作为特异性结合艰难拟梭菌毒素TcdB的DNA适配体。

[0018] 进一步，所述单链寡核苷酸文库为SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，其中N代表A、T、C、G 四个随机碱基。

[0019] 进一步，一种能特异性结合艰难拟梭菌毒素TcdB的DNA适配体，其特征在于：所述DNA适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

[0020] 进一步，所述DNA适配体的核苷酸序列是含有以SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为核心序列并两边延长的序列。

[0021] 进一步，所述的DNA适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示， SEQ ID No.5所示的核苷酸序列是由SEQ ID No.4所示序列向3’和/或5’端延伸所得到的序列。

[0022] 一种能特异性结合艰难拟梭菌毒素TcdB的DNA适配体在制备治疗艰难拟梭菌感染的药物中的应用。

[0023] 一种治疗艰难拟梭菌感染的药物，其含所述DNA适配体。

[0024] 与现有技术相比，本发明的有益效果和优点在于：

[0025] 1、本发明获得的ssDNA适配体可特异性与TcdB的FBD区结合，从而阻断TcdB的FBD区与结肠上皮细胞FZD1/2/7受体的结合，进而减轻TcdB导致的Wnt信号通路传导抑制，因此，该适配体能治疗毒素TcdB对结肠上皮细胞的损伤，显著降低TcdB导致的细胞死亡率、提高细胞内重要能量分子ATP的水平。

[0026] 2、本发明获得的ssDNA适配体能够显著抑制TcdB介导巨噬细胞分泌IL‑1β和IL‑6等促炎因子，而这些促炎因子能杀伤正常肠上皮细胞，因此，该适配体能从抑制炎症的角度进一步缓解TcdB对正常肠组织的损伤。

[0027] 3、本发明获得的ssDNA适配体仅通过干扰毒素TcdB与受体结合，不产生抗生素选择压力，可以避免抗生素疗法带来的耐药问题，同时它只针对艰难拟梭菌发挥作用，对益生菌无害，可见，本发明为克服临床上艰难拟梭菌感染出现的日益严重的抗生素耐药问题、副作用大等问题提供了新的解决思路。

[0028] 4、动物实验结果表明，小鼠被TcdB感染后，使用本发明的ssDNA适配体FA10进行治疗后，结肠的病理变化明显减轻，生存率显著提高，整体上对TcdB感染的小鼠具有很好的治疗作用。

[0029] 5、本发明的适配体筛选过程简单，筛选成本低，筛选耗时短，而且筛选出的适配体已经克隆到pUC19载体上，且已经转化至大肠杆菌DH5α中，可以直接通过该菌种制备大量该适配体。

附图说明

[0030] 图1为实施例1成功提取与纯化TcdB受体结合区FBD重组蛋白的凝胶电泳图；

[0031] 图2为实施例1奇数筛选轮次获得的ssDNA文库与FBD蛋白的亲和力结果图；

[0032] 图3为实施例1获得的待筛选适配体FA1‑FA10与FBD蛋白的亲和力结果图；

[0033] 图4为实施例1不同剂量的FA10适配体与FBD蛋白的亲和力结果图；

[0034] 图5为实施例1获得的FA10适配体与不同蛋白结合的特异性结果图；

[0035] 图6为实施例1获得的FA10适配体的二级结构图；

[0036] 图7为在适配体FA10、FA7存在的条件下结肠上皮细胞与蛋白FBD或毒素TcdB的结合百分率图：其中图7（A）为蛋白FBD与肠上皮细胞的结合百分率图，图7（B）为毒素TcdB与肠上皮细胞的结合百分率图；

[0037] 图8为在适配体FA10、FA7存在的条件下FZD1/2/7与蛋白FBD或毒素TcdB的结合性能比较图：其中图8（A）为蛋白FBD与FZD1/2/7结合性能比较图，图8（B）为毒素TcdB与FZD1/2/7结合性能比较图；

[0038] 图9为在适配体FA10、FA7存在的条件下毒素TcdB对结肠上皮细胞的细胞毒性影响比较图；

[0039] 图10为在适配体FA10、FA7存在的条件下毒素TcdB对结肠上皮细胞的ATP水平影响比较图；

[0040] 图11为在适配体FA10、FA7存在的条件下毒素TcdB对结肠上皮细胞增殖抑制作用比较图；

[0041] 图12为在适配体FA10、FA7存在的条件下使用RT‑PCR检测毒素TcdB及蛋白FBD对Wnt/β‑catenin 信号通路相关基因mRNA表达抑制作用对比图：其中图12（A）为毒素TcdB的抑制作用对比图，图12（B）为蛋白FBD的抑制作用对比图；

[0042] 图13为在适配体FA10、FA7存在的条件下Western Blot检测检测毒素TcdB及蛋白FBD对Wnt/β‑catenin 信号通路相关基因蛋白表达抑制作用对比图：其中图13（A）为毒素TcdB的抑制作用对比图，图13（B）为蛋白FBD的抑制作用对比图；

[0043] 图14为在适配体FA10、FA7存在的条件下毒素TcdB刺激巨噬细胞分泌炎症因子抑制作用比较图：其中图14（A）为IL‑1β炎症因子，图14（B）为IL‑6炎症因子；

[0044] 图15为在适配体FA10、FA7存在的条件下TcdB直肠内灌注的小鼠结肠组织切片的免疫荧光染色图像：其中图15（A）为IL‑1β炎症因子表达情况图，图15（B）为IL‑6炎症因子表达情况图；

[0045] 图16为在适配体FA10、FA7存在的条件下TcdB直肠内灌注的小鼠结肠组织整体观；

[0046] 图17为在适配体FA10、FA7存在的条件下TcdB直肠内灌注的小鼠结肠组织的HE染色图；

[0047] 图18为在适配体FA10、FA7存在的条件下TcdB直肠内灌注的小鼠结肠组织的组织化学评分图：其中图18（A）为整体观方面；图18（B）为上皮破坏程度方面；图18（C）为水肿方面；图18（D）为炎性细胞浸润方面；18（E）为出血性水肿方面；

[0048] 图19为在适配体FA10、FA7存在的条件下TcdB直肠内灌注的小鼠存活率随感染时间的变化图。

具体实施方式

[0049] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

[0050] 实施例1 SELEX筛选并获得针对TcdB的FBD区高亲和力的适配体

[0051] 1、构建随机单链DNA文库及引物

[0052] 构建长度为88个碱基的随机单链DNA文库，如SEQ ID No.6所示：5’‑GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC‑N30‑GGGTCAATGCGTCATA‑3’，其中N代表A、T、C、G 四个随机碱基。SEQ ID No.1所示的上游引物为：5’‑GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC‑3’，画线部分为EcoR I的DNA限制性酶切位点；SEQ ID No.2所示的下游引物为：5’‑GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC‑3’，画线部分为Bam HI的DNA限制性酶切位点，随机单链DNA（ssDNA）文库及引物均可由公司合成。

[0053] 核酸序列表1

[0054]

[0055] 2、双链DNA（dsDNA）、单链DNA（ssDNA）文库的PCR扩增及保存

[0056] 先将ssDA文库扩增为dsDNA文库后保存，取少量dsDNA文库作为模板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。反应程序均为：94℃ 3min，94℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 20s，20‑30个循环，72℃ 3min。PCR产物通过3%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶纯化试剂盒进行回收。

[0057] 、SELEX筛选

[0058] 3.1、筛选的具体操作

[0059] 1）取浓度为40 pmol的ssDNA文库，置于95℃水浴10 min后迅速冰浴5 min，得到40 pmol的预处理的ssDNA文库；

[0060] 2）表达纯化的TcdB的FBD区蛋白（简称FBD蛋白）（按照参考文献“Peng Chen et al, Science. 2018; 360(6389): 664–669”的方法表达纯化，其电泳结果图如图1所示）；

[0061] 3）将原核表达纯化的TcdB的FBD蛋白溶于包被缓冲液（pH9.6碳酸盐缓冲液：40 mMNa2CO3，60 mMNaHCO3）中并包被于96孔ELISA板上，4℃过夜，使用筛选洗脱液反复洗涤6次后加入40 pmol的预处理的ssDNA文库，37℃孵育1 h，用筛选洗脱液（20 mM pH 7.4 Tris ·HCl，137 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl2，1 mM MgCl2）洗涤6次，以洗去非特异性结合的ssDNA文库；

[0062] 4）向ELISA板上的筛选孔中加入100 μL高压灭菌的双蒸水（ddH2O），95℃加热10分钟，使特异性结合FBD蛋白的ssDNA文库经高温变性后脱落；

[0063] 5）将筛选孔中的液体吸至新的EP管中，接着加入2倍体积的无水乙醇及1/10体积的NaCl（3M），置于‑70℃沉淀过夜，最后通过凝胶回收。

[0064] TcdB氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，是含有2366个氨基酸序列的巨大蛋白，主要分为四个结构功能域，其中联合重复寡肽（CROPs，1834‑2366位氨基酸，共533个氨基酸）结构域和近年新发现的卷曲蛋白受体结合区（FBD，1285‑1804位氨基酸，共520个氨基酸）能与细胞表面受体结合，介导TcdB进入细胞，以及代表TcdB生物活性的葡糖基转移酶结构域（GTD，1‑543位氨基酸，共543个氨基酸，即氨基末端1‑1629 bp基因序列）。

[0065] 、FBD梯度正筛选和CROPs反筛选

[0066] 前三轮筛选用10 μg的FBD蛋白，后续筛选逐渐降低FBD的用量，第4轮到第11轮FBD蛋白用量降至用1 μg，第12到第15轮FBD量降至0.1 μg。通过第1 4轮筛选出与TcdB的FBD区~蛋白高度亲和的适配体。第7轮先通过TcdB的CROPs区蛋白(按照参考文献“Tao L, et al. Nature. 2016, 538(7625): 350–355.”的方法表达纯化)进行反筛，除去与TcdB的CROPs区蛋白高度亲和的适配体，将反筛获得的ssDNA文库再与FBD蛋白进行正筛选，具体步骤如下：
收集第6轮获得的ssDNA适配体40 pmol，使用前置于85℃水10min后冰浴5 min；将1μg CROPs包被ELISA板，加入ssDNA适配体，37℃孵育1h后吸取上清液；然后将上清液中的ssDNA纯化后进行PCR对称扩增，获得双链DNA后以其为模板进行PCR不对称扩增以获得新的ssDNA，将其与包被于ELISA板的FBD进行结合，重复步骤3.1与FBD进行作用。

[0067] 、ELONA法检测奇数轮筛选获得的ssDNA文库与FBD的亲和力

[0068] 1）用奇数筛选轮次获得的ssDNA文库和生物素标记的上游引物通过不对称PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳回收，得到大量生物素标记的ssDNA文库，测浓度后备用；

[0069] 2）用0.8 μg的FBD蛋白包被ELISA板，4℃过夜，用含有0.05% Tween‑20的PBS（PBST）洗6次，每孔分别加入100 μL步骤1）扩增的后含生物素标记的ssDNA文库（40 pmol），37℃下孵育1 h，孵育完后用PBST洗6次，每孔加入1: 1000稀释的HRP 标记的链霉亲和素，
37℃下孵育30 min，PBST洗3次后加入TMB显色液进行显色，用酶标仪测定吸光度；

[0070] 3）结果如图2所示，由图2可知，第13轮筛选的ssDNA文库与FBD蛋白的亲和力最高。

[0071] 、亲和力最高的ssDNA文库的测序

[0072] 将第13轮筛选的ssDNA文库进行不对称PCR扩增，得到dsDNA文库产物，dsDNA文库产物T载体连接后，转化大肠杆菌DH5α（Hanahan，D.,1983），通过氨苄青霉素进行抗性筛选，挑取单克隆，提取质粒后进行测序，发现10种序列，将其分别命名为FA1‑FA10。

[0073] 、检测待筛选适配体FA1‑FA10与FBD蛋白的亲和力

[0074] 1）将待筛选适配体FA1‑FA10分别和生物素标记的上游引物通过不对称PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳回收，得到大量生物素标记的ssDNA，测浓度后备用；

[0075] 2）用0.8 μg的FBD蛋白包被ELISA板，4℃过夜，用含有0.05% Tween‑20的PBS（PBST）洗6次，每孔分别加入100 μL步骤1）扩增的后生物素标记的ssDNA（40 pmol），37℃下孵育1 h，孵育完后用PBST洗6次，每孔加入1: 1000稀释的HRP 标记的链霉亲和素，37℃下孵育30 min，PBST洗3次后加入TMB显色液进行显色，用酶标仪测定吸光度；

[0076] 3）结果如图3所示，由图3可知，如SEQ ID No.4所示的FA10与FBD亲和力最高，如SEQ ID No.7所示的FA7与FBD亲和力最低，故选取FA10为目的适配体，FA7为适配体对照。如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列上游引物42个碱基，下游引物25个碱基，中间是SEQ ID No.4所示的核心序列（FA10），一共97个碱基。

[0077] 、检测不同剂量的FA10适配体与FBD蛋白的亲和力

[0078] 1）将适配体FA10和生物素标记的上游引物通过不对称PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳回收，得到大量生物素标记的ssDNA；

[0079] 2）将生物素标记的FA10设置9个浓度梯度，检测不同浓度的生物素标记的FA10与FBD靶蛋白（500 ng/mL）的亲和力；

[0080] 3）结果如图4所示，由图4可知，在固定浓度的FBD靶蛋白下，随着FA10浓度的增大，其OD值也随之增大，但随着FA10浓度的增大其OD值也逐渐趋于平台。对FA10和FA7的亲和力值KD进行计算，结果显示：FA10的KD值为31.07±3.95 nM，FA7的KD值为365.40±46.82 nM。FA10的KD值为nM数量级，显示出FA10对FBD有较高的亲和力。

[0081] 、ELONA法检测适配体FA10与FBD、TcdB蛋白结合的特异性

[0082] 1）将TcdB毒素、TcdB毒素的FBD蛋白、TcdB毒素的CROPs蛋白、TcdB毒素的GTD蛋白、破伤风痉挛毒素（Tetanus spasmodic toxins, TSD）、白喉毒素（Diphtheria toxin, DT）、金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcus aureus enterotoxin, SAE）、His和BSA包被于微孔板，然后用40 pM的FA10适配体检测与上述各种蛋白的结合力，以TcdB蛋白的FBD区与FA7结合的特异性作为对照。

[0083] 2）结果如图5所示，只有TcdB蛋白的FBD区和TcdB蛋白与FA10有高结合力，与其它蛋白亲和力很低，说明适配体FA10结合TcdB蛋白的FBD区、TcdB蛋白特异性强，可以阻断艰难拟梭菌毒素TcdB的毒性作用，具有作为小分子抑制剂的价值。

[0084] 、DNAMAN软件模拟的FA7和FA10适配体二级结构

[0085] 用DNAMAN软件对FA7和FA10适配体二级结构进行模拟，结果如图6所示，由图6可知，FA10适配体二级结构具备茎环结构，理论上比较稳定。

[0086] 试验一、适配体FA10作为小分子抑制剂阻断FBD蛋白、TcdB毒素与结肠上皮结合的机制试验

[0087] 1、流式细胞技术检测FBD、TcdB与结肠上皮的结合力

[0088] 试验方法：

[0089] 1）取对数期生长的结肠上皮Caco‑2细胞传代至6孔培养板中，培养箱培养48 h；

[0090] 2）待细胞融合至50%后，使用PBS清洗，换新鲜培养基，将FBD‑His蛋白和TcdB蛋白分别加入培养基中，并加入煮沸变性后的适配体进行阻断，与Caco‑2细胞培养箱孵育3 h；

[0091] 3）PBS洗三遍后，去除掉非特异性结合的蛋白，消化并收获各组细胞；

[0092] 4）FBD‑His蛋白组加入一抗（鼠源的抗his的抗体），TcdB蛋白组加入一抗（兔源的抗TcdB‑GTD区的抗体），冰上孵育1 h；

[0093] 5）PBS洗一遍后，将荧光标记的抗鼠/抗兔的二抗按抗体说明书稀释浓度加入上述对应的各组细胞中，冰上孵育1h；

[0094] 6）PBS洗一遍，重悬后上机检测，将流式细胞仪检测的结合百分率（Binding percentage）结果进行统计，以适配体FA10和适配体FA7作为步骤2)添加的阻断剂进行对照。

[0095] 试验结果：

[0096] 结果如图7所示，由图7（A）和图7（B）可知，适配体FA10能阻断蛋白FBD (图7A)或毒素TcdB(图7B)与结肠上皮细胞Caco‑2的结合。

[0097] 、ELONA法检测FZD1/2/7与FBD或TcdB的结合性能

[0098] 试验方法：

[0099] 1）使用生物素标记的上游引物行对适配体FA10不对称PCR扩增，得到大量生物素标记的适配体FA10；

[0100] 2）将FBD靶蛋白和TcdB毒素（500 ng/mL）分别包被于ELISA板，置于37℃湿盒中孵育1 h后，PBST洗5次；

[0101] 3）加入200 μL鲑鱼精DNA封闭液（100 μg/mL），37℃下孵育1 h；

[0102] 4）PBST洗3次后分别加入浓度为300 nM的适配体FA10，置于37℃湿盒孵育1 h；

[0103] 5）分别加入FZD1‑Fc、FZD2‑Fc、FZD7‑Fc（500 ng/mL），37℃下孵育1 h；

[0104] 6）PBST洗3次，向每孔加入100 µL的1: 3000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG，置于37℃湿盒孵育30 min；

[0105] 7）PBST洗3次后加入TMB显色液进行显色，37℃下孵育8 min；

[0106] 8）加入ELISA终止液后酶标仪检测OD450 nm，以适配体FA7为对照；

[0107] 试验结果：

[0108] 结果如图8所示，由图8可知，适配体FA10能阻断FZD1/2/7与FBD蛋白或毒素TcdB的结合，适配体FA10通过阻断毒素TcdB的FBD区蛋白与FZD1/2/7受体的结合从而抑制TcdB与结肠上皮细胞的结合（图8A），而适配体FA7阻断FZD1/2/7与FBD蛋白或TcdB毒素的结合的作用很弱，即适配体FA7不能通过阻断毒素TcdB的FBD区蛋白与FZD1/2/7受体的结合从而抑制TcdB与结肠上皮细胞的结合（图8B）。

[0109] 试验二、适配体FA10治疗TcdB毒素对结肠上皮细胞的损伤试验

[0110] 1、CCK8检测试剂盒检测结肠上皮细胞增殖情况

[0111] 试验方法：

[0112] 将处于对数期生长的结肠上皮细胞Caco‑2细胞以2×104个/孔（100 µL，2×105个/mL）传代种植于96孔板中，培养箱培养24 h后，分别加入TcdB及TcdB+FA10、TcdB+FA7，在不同点加入相同浓度的CCK8试剂，继续培养四个小时后，酶标仪检测OD450 nm。

[0113] 试验结果：

[0114] 结果如图9所示，从图9可知看出，TcdB具有较强的细胞毒性，能引起细胞显著受损、抑制细胞增殖甚至死亡，当加入适配体FA10治疗时，TcdB导致的细胞死亡率有明显下降，而加入适配体FA7治疗时，没有治疗效果。

[0115] 、ATP检测试剂盒检测结肠上皮细胞ATP水平

[0116] 试验方法

[0117] 1）将处于对数期生长的结肠上皮细胞Caco‑2细胞以2×104个/孔（100 µL，2×105个/mL）传代种植于96孔板中，培养箱培养24 h后，分别加入TcdB、TcdB+FA10和TcdB+FA7，继续培养四个小时，接着使用ATP裂解液将Caco‑2细胞进行裂解，裂解后在4℃和12000 rpm下离心5 min，取上清，用于后续的测定的样品；

[0118] 2）加100μL ATP检测工作液到检测孔或检测管内，室温放置3‑5min，以使本底性的ATP全部被消耗掉，从而降低本底，在检测孔内加上20μL样品，迅速用枪混匀，间隔2 s后，用化学发光仪(luminometer)测定RLU值，根据标准曲线计算各分组细胞ATP浓度，同时使用共聚焦高内涵成像分析系统观察细胞生长状态；

[0119] 试验结果：

[0120] ATP水平结果如图10所示，由图10可知，TcdB具有较强的细胞毒性，能导致最重要的能量分子ATP水平下降，当加入适配体FA10治疗时，ATP水平显著回升，当加入适配体FA7治疗时，ATP水平无明显改变；

[0121] 细胞生长状态图如图11所示，由图11可知，适配体FA10能缓解TcdB对细胞增殖的抑制作用。

[0122] 试验三、适配体FA10逆转FBD蛋白、TcdB毒素对Wnt/β‑catenin信号通路的抑制作用试验

[0123] 1、RT‑PCR检测Wnt/β‑catenin 信号通路相关基因mRNA表达

[0124] 试验方法：

[0125] 将结肠上皮细胞Caco‑2细胞接种12孔培养板中，培养箱培养24 h后换新鲜培养基，并按照以下实验分组给予刺激：PBS、TcdB、TcdB+FA10、TcdB+FA7，刺激培养24 h后使用TRIzol试剂提取结肠上皮细胞总RNA，进行逆转录，按Takara的TB Green® Fast qPCR Mix方法进行相对定量分析，每组设置3个复孔。根据产物的溶解曲是否为单一峰值可以确定扩增的特异性，再根据目的基因的CT值（Cyclethreshold，即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数）和管家基因GAPDH的CT值可计算样本中目的基因mRNA的相对表达水平；

[0126] 试验结果：

[0127] 结果如图12所示，由图12（A）和图12（B）可知，Q‑PCR检测 Wnt/β‑catenin信号通路关键蛋白如β‑catenin、GSK‑3β及Wnt/β‑catenin信号通路相关靶基因如CyclinDl、C‑myc等的表达，发现毒素TcdB和蛋白FBD都能引起相关蛋白或靶基因表达降低，且蛋白CROPs不影响Wnt/β‑catenin信号通路关键蛋白及相关靶基因的表达，而适配体FA10可以使相关蛋白表达回升，逆转相关趋势。

[0128] 、Western Blot检测Wnt/β‑catenin信号通路相关基因蛋白表达

[0129] 试验方法：

[0130] 将结肠上皮细胞Caco‑2细胞接种6孔培养板中，培养箱培养24 h后换新鲜培养基，并按照以下实验分组给予刺激：PBS、TcdB、TcdB+FA10、TcdB+FA7，刺激培养24 h后用PBS清洗两遍，将蛋白裂解液按照200 μL/孔加入至6孔板中，使用细胞刮反复刮取，放置冰上裂解15 min，在12000 rpm 和4℃下离心15 min，小心吸取上清（即为细胞总蛋白），使用BCA试剂盒检测细胞总蛋白浓度，将细胞总蛋白中加入相应体积的5×Loadingbuffer，混匀后100℃变性10 min备用；

[0131] 制备10%的PAGE胶，加入上述蛋白样品进行蛋白质PAGE凝胶电泳，电泳结束后将凝胶上的蛋白转印到PVDF膜上，恒流200 mA转膜80 min；之后将PVDF膜置于5％的脱脂牛奶中，室温封闭60 min；用5％脱脂牛奶配相应一抗，将上述膜于4℃摇床孵育过夜；洗5次后根据一抗的来源种属选择相同种属的二抗，用5％脱脂牛奶配置二抗，室温摇床孵育1 h；洗5次后加入适量的ECL显色液放到成像仪的载物托盘上，根据曝光结果调整曝光时间，获得比较理想的曝光图片；

[0132] 试验结果：

[0133] 结果如图13所示，由图13（A）和图13（B）可知，免疫印迹检测Wnt/β‑catenin信号通路关键蛋白如β‑catenin、GSK‑3β等及Wnt/β‑catenin信号通路相关靶基因如CyclinDl、C‑myc等的表达，发现毒素TcdB和蛋白FBD都能引起相关蛋白或靶基因表达降低，且蛋白CROPs不影响Wnt/β‑catenin信号通路关键蛋白及相关靶基因的表达，而适配体FA10可以使相关蛋白表达回升，逆转相关趋势。

[0134] 由上述可知，毒素TcdB是通过其FBD区蛋白而不是CROPs区蛋白发挥抑制Wnt信号通路的作用，而FA10正是通过阻断毒素TcdB的FBD区蛋白与FZD受体的的结合才减轻毒素TcdB导致的Wnt/β‑catenin信号传导抑制，从而减轻毒素TcdB引起的结肠上皮细胞损伤。

[0135] 试验四、适配体FA10显著抑制TcdB刺激THP‑1源性巨噬细胞分泌炎症因子试验[0136] 试验方法：

[0137] 1）使用浓度为100 ng/mL的PMA诱导48 h使得THP‑1细胞分化为巨噬细胞，用TcdB、TcdB+FA10和TcdB+FA7分别刺激巨噬细胞，刺激48 h后收集细胞培养上清，将收集的上清与稀释好的梯度浓度标准品分别加入孔中（100 μL/孔），在37℃恒温箱中孵育90min；

[0138] 2）每孔加洗涤液350 μL，摇床2 min后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，重复洗板4次并甩尽孔内液体；

[0139] 3）将生物素标记的IL‑1β或IL‑6抗体与抗体稀释液按1：100稀释，稀释后加入孔中（100μL/孔），在37℃恒温箱中孵育60 min后洗板4次，洗板的方法同步骤2）；

[0140] 4）将酶结合物（辣根过氧化物标记的链霉亲和素）与酶结合物稀释液按1: 100稀释，稀释后加入孔中(100 μL/孔)，在37℃恒温箱中孵育30 min后洗板5次，洗板的方法同步骤2）；

[0141] 5）加入显色剂100 μL/孔，避光，在37℃恒温箱中孵育10 min；

[0142] 6）加入终止液100 μL/孔，混匀后即刻测量OD450值；

[0143] 7）将所得结果通过Excel软件进行标准曲线的绘制，以此换算得出样品值，并进行统计学分析；

[0144] 试验结果：

[0145] 结果如图14所示，IL‑1β和IL‑6细胞因子作为促炎因子，会加剧正常组织的损伤，FA10抑制TcdB刺激巨噬细胞分泌IL‑1β（图14（A））和IL‑6（图14（B）），而适配体FA7不能抑制TcdB刺激巨噬细胞分泌IL‑1β（图14（A））和（图14（B））。

[0146] 试验五、适配体FA10的小鼠活体实验

[0147] 1、小鼠模型的构建和分组

[0148] 1）将24 只雌性BALB/c小鼠（年龄：6‑8周，购自湖北医药学院实验动物中心）随机分成4组，每组6只；

[0149] 2）将适配体FA10和适配体FA7分别进行如下处理：经95℃处理5分钟后，立即置于冰上5分钟，取5 μM适配体与1μg的TcdB在37℃下结合2小时，PBS洗两次后，用100μL PBS重悬，制成含适配体FA10或适配体FA7的感染试剂；

[0150] 3）按照下表对每组小鼠进行直肠内灌注感染处理：

[0151] 表2. BALB/c小鼠的分组及感染处理

[0152] 感染试剂 感染途径 剂量 小鼠数量PBS 直肠内灌注 100 μL 6
TcdB 直肠内灌注 1 μg/100 μL 6
TcdB+FA10 直肠内灌注 1 μg/5 μM/100 μL 6
TcdB+FA7 直肠内灌注 1 μg/5 μM/100 μL 6

[0153] 在感染处理时，用1%戊巴比妥钠（使用浓度为50 mg/kg）麻醉小鼠，将直径为1毫米的管子从肛门插入直肠（ 4 cm）并注入感染试剂，随后用医用吻合胶封住肛门，防止毒素~外泄，各组小鼠在实验期间可以自由获得饮用水和食物（常规饮食）；

[0154] 2、小鼠结肠组织免疫荧光检测

[0155] 检测方法：

[0156] 1）石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 15min‑二甲苯Ⅱ 15min‑无水乙醇Ⅰ 5min‑无水乙醇Ⅱ 5min‑85%酒精 5min‑75%酒精 5min‑蒸馏水洗；

[0157] 2）抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH9.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火至沸后断电间隔10min中低火至沸，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；

[0158] 3）BSA封闭：切片稍甩千后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用3% BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min；

[0159] 4）加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

[0160] 5）加二抗：玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光孵育50 min；

[0161] 6）DAPI 复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min；

[0162] 7）封片：玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片；

[0163] 8）镜检拍照：切片于共聚焦显微镜下观察并采集图像；

[0164] 检测结果：

[0165] 结果如图15所示，TcdB+FA10组与TcdB组相比，CD68阳性细胞比例更低，即能减少巨噬细胞浸润，同时能抑制IL‑1β（图15（A））和IL‑6（图15（B））的分泌，该趋势与图14（A）和图14（B）显示的结果相符，进一步适配体FA10能显著降低TcdB介导巨噬细胞分泌IL‑1β和IL‑6等炎症因子水平。

[0166] 、小鼠结肠组织整体观

[0167] 检测方法：

[0168] 无菌条件下取小鼠结肠组织，PBS冲洗3遍后放置托盘中拍照。

[0169] 检测结果：

[0170] 结果如图16所示，观察小鼠结肠组织大体标本，可见单独TcdB刺激后的小鼠结肠，结肠大体充血水肿，质地脆弱，肉眼观察可见结肠组织粘膜下的毛细血管纹理消失，弥漫性的点状出血及触之时易出血。而正常组结肠组织大体无充血水肿，结肠粘膜光滑，血管纹理清晰，适配体FA10治疗组小鼠结肠组织的这些现象明显减轻。

[0171] 、小鼠结肠组织的HE染色

[0172] 检测方法：

[0173] 1）制作切片：将小鼠直肠内滴注实验小鼠的结肠解剖PBS清洗，4%多聚甲醛固定的结肠组织予以常规的石蜡包埋，然后制成4 μm的切片；

[0174] 2）切片烘干：将切片放至热水中烫平，再贴到载玻片上，放置于45℃恒温箱中烘干；

[0175] 3）石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 10 min‑二甲苯Ⅱ 10 min‑无水乙醇Ⅰ 5 min‑无水乙醇Ⅱ 5 min‑95%酒精5 min‑90%酒精5 min‑80%酒精5 min‑70%酒精5 min‑蒸馏水洗；

[0176] 4）苏木素染细胞核：切片入苏木素染色6 min，用自来水洗，接着用1%的盐酸酒精分化数秒，用自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗；

[0177] 5）伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色2min；

[0178] 6）脱水封片：将切片依次放入95%酒精I 5 min ‑95%酒精II 5 min‑无水乙醇Ⅰ 5 min ‑无水乙醇Ⅱ 5 min ‑二甲苯Ⅰ 5 min ‑二甲苯Ⅱ 5 min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；

[0179] 7）正置显微镜镜检：染色切片由两名病理学家根据总体观、上皮破坏、水肿程度、炎性细胞浸润、出血性充血以0到3（轻度到重度）的等级进行评分；

[0180] 检测结果：

[0181] 小鼠结肠组织的HE染色图如图17所示，小鼠结肠组织的整体观、上皮破坏程度、水肿炎性细胞浸润和出血性水肿等方面的评分如图18所示，图17显示TcdB刺激组结肠上皮破坏，黏膜下明显水肿，固有层分泌大量炎性细胞，整体结肠组织呈现出血性水肿状态，但给适配体FA10治疗后，从小鼠结肠组织整体观（图18A）、上皮破坏程度（图18B）、水肿（图18C）、炎性细胞浸润（图18D）、出血性水肿（图18E）等方面的评分来看都有明显改善。

[0182] 、小鼠生存情况分析

[0183] 观察各分组小鼠死亡时间，计算其存活率率，各组小鼠的存活率随感染时间变化图如图19所示，

[0184] 从图19可以看出，TcdB组小鼠多在30h左右开始出现死亡，到40 h时，小鼠全部死亡；而TcdB+FA10组小鼠，从42 h开始有小鼠出现死亡，到48 h仍有66.7%小鼠正常存活。