一种针对动脉粥样硬化的药物

摘要

本发明提供了一种针对动脉粥样硬化的药物，属于医学技术领域。该药物包括络石苷和药学上可接受的载体。本发明发现，络石苷可以有效的降低ox‑LDL导致的人冠状动脉内皮细胞生存活性下降，并且可以有效的降低ox‑LDL导致的人冠状动脉内皮细胞中内皮细胞血管黏附分子VCAM1和细胞间黏附分子ICAM1的蛋白表达升高。同时，其可以有效的降低ox‑LDL导致的细胞凋亡升高。因此，本发明创造性的将络石苷用于制备治疗动脉粥样硬化的药物。

权利要求

1.络石苷在制备动脉粥样硬化治疗药物中的应用，其特征在于，所述络石苷的CAS号为

33464‑71‑0。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述络石苷降低ox‑LDL导致的人冠状动脉内皮细胞生存活性下降。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述络石苷降低ox‑LDL导致的人冠状动脉内皮细胞中内皮细胞血管黏附分子VCAM1和细胞间黏附分子ICAM1的蛋白表达升高。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述络石苷降低ox‑LDL导致的促凋亡基因BAX的mRNA表达上调，所述络石苷上调ox‑LDL导致的抑凋亡基因Bcl‑2的mRNA表达下调。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述络石苷的使用浓度为大于等于5ug/ml。

说明书

一种针对动脉粥样硬化的药物

技术领域

[0001] 本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种针对动脉粥样硬化的药物。

背景技术

[0002] 近些年来，中国心血管疾病患者的人数持续升高，目前，心血管疾病已经变成中国城乡居民死亡的首要威胁因素。其中，动脉粥样硬化是一种常见的动脉血管病变，其是由脂质、胆固醇、钙等物质和周围细胞所组成的粥样斑块沉积在血管壁上导致血管狭窄所导致的，同时，斑块亦可破裂形成血栓进而已发其他的缺血性疾病。

[0003] 血管内皮细胞在动脉粥样硬化中扮演着重要的作用，当血管内皮细胞发生损伤时，其会通过上调内皮细胞血管黏附分子VCAM1和细胞间黏附分子ICAM1的表达来使单核细胞聚集到早期的动脉粥样斑块处。同时，血管内皮细胞可以释放多种细胞黏附分子，促进血小板，粒细胞，单核细胞粘附于血管内皮，从而促进动脉粥样硬化的发生和发展。因此，以血管内皮细胞作为研究方向来深入的研究动脉粥样硬化的发生发展的分子机制，对于动脉粥样硬化的治疗具有深远的临床意义。

[0004] 络石苷的分子式为C27H34O12，CAS号为33464‑71‑0，现有技术显示络石苷可以通过刺激 ERK1/2 来促进角质形成细胞的增殖。然而，关于络石苷在动脉粥样硬化中的应用尚无报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供络石苷在动脉粥样硬化治疗中的新应用。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

[0007] 其一是络石苷在制备动脉粥样硬化治疗药物中的应用，所述络石苷的CAS号为33464‑71‑0。

[0008] 优选地，所述络石苷降低ox‑LDL导致的人冠状动脉内皮细胞生存活性下降。

[0009] 优选地，所述络石苷降低ox‑LDL导致的人冠状动脉内皮细胞中内皮细胞血管黏附分子VCAM1和细胞间黏附分子ICAM1的蛋白表达升高。

[0010] 优选地，所述络石苷降低ox‑LDL导致的促凋亡基因BAX的mRNA表达上调，所述络石苷上调ox‑LDL导致的抑凋亡基因Bcl‑2的mRNA表达下调。

[0011] 优选地，所述络石苷的使用浓度为大于等于5ug/ml。

[0012] 其二是一种动脉粥样硬化治疗药物，所述药物包括络石苷和药学上可接受的载体。

[0013] 优选地，所述药物上可接受的载体为稀释剂，载剂或赋性剂。

[0014] 优选地，所述药物剂型为汤剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、片剂、注射剂。

[0015] 其三是络石苷在制备人冠状动脉内皮细胞生存活性促进剂中的应用，所述络石苷降低ox‑LDL导致的人冠状动脉内皮细胞生存活性下降。

[0016] 其四是络石苷在制备人冠状动脉内皮细胞中黏附分子蛋白表达抑制剂中的应用，所述络石苷降低ox‑LDL导致的人冠状动脉内皮细胞中内皮细胞血管黏附分子VCAM1和细胞间黏附分子ICAM1的蛋白表达升高。

[0017] 其五是络石苷在制备人冠状动脉内皮细胞凋亡抑制剂中的应用，所述络石苷降低ox‑LDL导致的促凋亡基因BAX的mRNA表达上调，所述络石苷上调ox‑LDL导致的抑凋亡基因Bcl‑2的mRNA表达下调。

[0018] 优选地，所述络石苷的使用浓度为大于等于5ug/ml。

[0019] 本发明的有益效果是：

[0020] 本发明证明了使用络石苷预处理后可以有效的降低ox‑LDL导致的人冠状动脉内皮细胞生存活性下降；

[0021] 其次，本发明证明了使用络石苷预处理后可以有效的降低ox‑LDL导致的人冠状动脉内皮细胞中内皮细胞血管黏附分子VCAM1和细胞间黏附分子ICAM1的蛋白表达升高；

[0022] 除此之外，本发明证明了使用络石苷预处理后可以通过降低ox‑LDL导致的促凋亡基因BAX的mRNA表达上调，所述络石苷上调ox‑LDL导致的抑凋亡基因Bcl‑2的mRNA表达下调来降低凋亡。

[0023] 因此，可以将络石苷用于制备治疗动脉粥样硬化的药物。

附图说明

[0024] 图1 络石苷预对于ox‑LDL导致的内皮细胞血管黏附分子VCAM1和细胞间黏附分子ICAM1的蛋白表达的影响；

[0025] 图2 络石苷对于ox‑LDL导致的BAX的mRNA表达的影响；

[0026] 图3络石苷对于ox‑LDL导致的BCL‑2的mRNA表达的影响。

具体实施方式

[0027] 本发明所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

[0028] 实施例1

[0029] 络石苷在氧化低密度脂蛋白导致的HCAEC细胞（人冠状动脉内皮细胞）生长抑制中的作用

[0030] （1）将生长状态良好，生长密度已达80%的HCAEC细胞按照细胞传代的方法，将细胞收集到离心管中，用完全培养基将细胞重悬；

[0031] （2）取10ul的细胞悬液使用血球计数板进行计数，之后根据细胞结束的结果对细4
胞悬液进行稀释，使其密度为3×10个/ML；

[0032] （3）在96孔板的每个孔中加入100ul悬液，轻轻晃动混匀，然后在接种细胞的周围孔中加入PBS，从而防止由于水分蒸发而导致的边缘效应；

[0033] （4）24h后，去除96孔板内的培养基，每孔加入100ul含有0.1%牛血清蛋白的无血清培养基，使细胞处于饥饿状态并将所有细胞状态调成一致，待细胞饥饿处理6h后，去除培养基；

[0034] （5）按照如下的分组：对照组使用完全培养基进行培养，实验组a使用0ug/ml络石苷处理24h后，使用含有100mg/L ox‑LDL的完全培养基进行培养24h，实验组b使用含有5ug/ml络石苷处理24h后，使用含有100mg/L ox‑LDL的完全培养基进行培养24h，实验组c使用含有10ug/ml络石苷处理24h后，使用含有100mg/L ox‑LDL的完全培养基进行培养24h；实验组d使用含有25ug/ml络石苷处理24h后，使用含有100mg/L ox‑LDL的完全培养基进行培养24h；实验组e使用含有50ug/ml络石苷处理24h，使用含有100mg/L ox‑LDL的完全培养基进行培养，每组设置有3个重复孔。

[0035] （6）按照10:1的体系向100ul培养基中添加10ul的CCK‑8检测试剂，继续放回培养箱中孵育4h后，检测450nm吸光度，计算生长抑制率。

[0036] 实施例2

[0037] （1）将HCAEC细胞接种于6孔培养基板中，待细胞密度达到85%时，对照组使用完全培养基进行培养；实验组a使用0ug/ml络石苷处理24h后，使用含有100mg/L ox‑LDL的完全培养基进行培养24h；实验组b使用25ug/ml络石苷处理24h后，使用含有100mg/L ox‑LDL的完全培养基进行培养24h，每组设置有3个重复孔；

[0038] （2）处理结束之后，去除培养基后，使用PBS洗涤细胞，每个孔中加入100ul RIPA细胞裂解液，充分裂解30min；

[0039] （3）裂解结束后，将裂解液转移到离心管中，之后将离心管置于低温高速离心机中，4℃，12000g/min离心18min后，取出离心管，将上清转移到新的离心管中；

[0040] （4）取2ul上清参照BCA蛋白检测试剂盒的说明书进行蛋白浓度检测；

[0041] （5）根据检测的蛋白浓度加入上样缓冲液，沸水煮5min，得到蛋白样品、[0042] 实施例3

[0043] （1）将配置好的凝胶放入垂直电泳仪中，并将电泳缓冲液加入到电泳槽的指定刻度线处；

[0044] （2）将20ug蛋白样品加入到凝胶孔内，并在第一个凝胶孔内加入蛋白Marker；

[0045] （3）按照正负极顺序正确安装好电泳仪，浓缩胶电泳条件为80V 30min，然后调节电压为120V直至电泳条带至最下方，停止电泳；

[0046] （4）将PVDF膜依次放入甲醇、超纯水和转膜缓冲液中浸泡，同时，将海绵浸泡在转膜缓冲液中30min，电泳结束后，取出凝胶，按照海绵、PVDF膜、胶、海绵的顺序摆放整齐后放入半干转膜仪中，转膜250mA 90min；

[0047] （5）转膜结束后，将PVDF膜放入5%的脱脂奶粉中封闭1h，TBST溶液洗脱3×5min；

[0048] （6）将膜放入含有2%的脱脂奶粉的一抗稀释液中，4℃过夜，TBST溶液中洗脱3×5min；

[0049] （7）将膜放入含5%脱脂奶粉的二抗稀释液中，室温1h，TBST溶液中洗脱3×5min；

[0050] （8）将ECL显色液滴加在PVDF膜上反应1min，之后置于凝胶成像仪中观察结果。

[0051] 实施例4

[0052] （1）将HCAEC细胞接种于6孔培养基板中，待细胞密度达到85%时，对照组使用完全培养基进行培养；实验组a使用0ug/ml络石苷处理24h后，使用含有100mg/L ox‑LDL的完全培养基进行培养24h；实验组b使用25ug/ml络石苷处理24h后，使用含有100mg/L ox‑LDL的完全培养基进行培养24h，每组设置有3个重复孔；

[0053] （2）去除培养基，加入1mlTrizol，使用移液器吹打细胞将细胞吹打下来，室温放置5min，将混合液吸入到离心管中；

[0054] （3）置于低温离心机中，12000rpm离心5min，吸取上清，去除沉淀；

[0055] （4）加入0.2mL氯仿，震荡混匀后，室温放置15分钟；

[0056] （5）之后，将离心管置于离心机中，4℃ 12000rpm离心 15min；

[0057] （6）将上清转移至新的离心管中，加入等体积预冷的异丙醇混匀，混匀后冰上静置8分钟；

[0058] （7）再次将离心管置于离心机中，4℃ 12000rpm离心10分钟，去除上清，保留沉淀；

[0059] （8）在沉淀中加入1ml 75%乙醇，震荡离心将沉淀悬浮；

[0060] （9）4℃ 8000rpm离心5分钟，使用移液器小心的去除上清；

[0061] （10）室温静置10分钟干燥RNA，之后使用50μL DEPC水溶解沉淀；

[0062] （11）使用微量紫外分光光度计测定组织总RNA的纯度和浓度。

[0063] 实施例5

[0064] （1）去除基因组DNA

[0065] 反应试剂：5×gDNA Eraser Buffer   2.0μL，

[0066] gDNA Eraser                    1.0μL，

[0067] Total RNA                      1.0μg，

[0068] RNase Free dH2O                up to 10.0μL。

[0069] 反应条件：42℃ 2分钟，4℃。

[0070] （2）逆转录反应

[0071] 反应试剂：步骤（1）的反应液      10.0μL，

[0072] PrimeScript RT Enzyme Mix I   1.0μL，

[0073] RT Primer Mix                 1.0 μL，

[0074] 5×PrimeScript Buffer 2       4.0 μL，

[0075] RNase Free dH2O               4.0 μL。

[0076] 反应条件：37℃ 15分钟，85℃   5秒，4℃。

[0077] （3）荧光定量PCR检测

[0078] 反应试剂: SYBR Green Premix Ex Taq（2×）  10.0μl，

[0079] 上游引物：                       0.4μL，

[0080] 下游引物：                       0.4μL，

[0081] cDNA模板                        2.0μL，

[0082] ddH2O                           7.2μL。

[0083] 反应条件：95℃ 10min；95℃ 15s，59℃ 60s 40个循环；75℃ 5min。

[0084] 引物序列如下：

[0085] BCL‑2

[0086] 上游引物：5‑GACTTCGCCGAGATGTCCAG‑3；

[0087] 下游引物：5‑CGGTGCTTGGCAATTAGTGG‑3；

[0088] BAX

[0089] 上游引物：5‑ATGGAGCTGCAGAGGATTCG‑3；

[0090] 下游引物：5‑AATGTCCAGCCCATGATGGT‑3；

[0091] β‑actin

[0092] 上游引物：5‑CATGAGAAGTATGACAACAG‑3；

[0093] 下游引物：5‑AGTCCTTCCACGATACCAAA‑3；

[0094] 本发明的实验结果如下：

[0095] 实施例1的实验结果：

[0096] 表1 络石苷在氧化低密度脂蛋白导致的HCAEC细胞生长抑制中的作用

[0097]实验分组 生长抑制率
实验组a 30.88±1.26
**
实验组b 22.31±1.54
***
实验组c 17.72±1.55
***
实验组d 10.15±0.82
***
实验组e 14.06±0.98

[0098] 从上表中可以看出，使用ox‑LDL处理后，可以抑制HCAEC细胞的生长，而使用络石苷预处理HCAEC细胞后可以有效的降低ox‑LDL导致的HCAEC细胞的生长抑制，差异具有统计学意义。而且，可以看出，实施例d的效果最好，因此本发明将25ug/ml络石苷作为最优处理浓度。

[0099] 实施例3的实验结果

[0100] 从图1中可以看出，使用ox‑LDL处理后，可以有效的促进HCAEC细胞中ICAM‑1和VCAM‑1的蛋白表达，说明使用ox‑LDL处理后可以增加细胞表达细胞黏附因子，从而促进单核细胞和淋巴细胞的黏附；

[0101] 而使用25ug/ml络石苷预处理之后，相较于实验组a，ICAM‑1和VCAM‑1的蛋白表达的水平显著下降，说明使用络石苷预处理之后可以有效的降低ox‑LDL所导致的细胞黏附因子表达，从而有效的防止发生动脉粥样硬化。

[0102] 实施例5的实验结果

[0103] 从图2中可以看出，使用ox‑LDL处理后，可以有效的促进HCAEC细胞中促凋亡基因BAX的mRNA表达（1.87±0.22，差异具有统计学意义），而使用25ug/ml络石苷预处理之后，相较于实验组a，实验组b的BAX的mRNA表达水平下降（1.31±0.17，差异具有统计学意义）；

[0104] 从图3中可以看出，使用ox‑LDL处理后，可以有效的降低HCAEC细胞中抑凋亡基因Bcl‑2的mRNA表达（0.51±0.06），而使用25ug/ml络石苷预处理之后，相较于实验组a，实验组b的Bcl‑2的mRNA表达水平上调（0.86±0.07）；

[0105] 综合上述结果可以看出，使用25ug/ml络石苷预处理处理后，可以有效的降低ox‑LDL所导致的细胞凋亡。