一种均相化学发光免疫检测技术所用微球组合物的制备方法

摘要

本发明为一种均相化学发光免疫检测技术所用微球组合物及其制备方法，所述微球组合物由包被了生物功能物质的供体微球和受体微球组成，所述供体微球由聚合物基质和光敏剂组成，所述受体微球由聚合物基质和发光化合物组成。本发明的微球组合物提高了灵敏度和线性范围，同时可以降低试剂使用浓度从而降低试剂成本。

权利要求

1.一种均相化学发光检测技术所用微球组合物的制备方法，其特征在于，微球组合物由包被了生物功能物质的供体微球和受体微球组成，所述供体微球由聚合物基质和光敏剂组成，所述受体微球由聚合物基质和发光化合物组成，所述发光化合物为如下结构，所述发光化合物1，其中R1＝H,R2＝CH3，合成步骤如下：将1.3g 2‑乙酰基‑9,10‑二甲基蒽、1.25g五氟丙酸乙酯、0.5g甲醇钠依次加入到15mL无水乙醚中，室温搅拌24小时，反应结束后加入100mL浓度为10％的稀硫酸，继续搅拌10分钟，减压除掉乙醚，粗产物用水洗涤后在乙醇中重结晶，得到中间产物1g，将290mg该中间产物、92mg的EuCl3、60mg的2,2’,2”三联吡啶、0.75mL浓度1M的氢氧化钠水溶液依次加入到

10mL乙醇中搅拌1小时，反应结束后过滤，将沉淀物用水洗涤，粗产物用乙醇重结晶得到发光化合物1。

2.根据权利要求1所述的微球组合物的制备方法，其特征在于，供体微球所包含的光敏剂是卟啉、叶绿素或酞菁类化合物中的一种或它们的组合。

3.根据权利要求2所述的微球组合物的制备方法，其特征在于，所述聚合物基质为天然聚合物、改性天然聚合物或合成聚合物中的一种或几种组合。

4.根据权利要求3所述的微球组合物的制备方法，其特征在于，所述天然聚合物、改性天然聚合物和合成聚合物包括琼脂糖、纤维素、聚丙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯中的一种或几种组合。

5.根据权利要求3所述的微球组合物的制备方法，其特征在于，所述聚合物基质具有官能团，所述官能团为羧基、氨基、巯基、醛基中的一种或几种组合，从而连接生物活性物质。

6.根据权利要求3所述的微球组合物的制备方法，其特征在于，所述聚合物基质为带有羧基或醛基的聚苯乙烯微球或为外层包裹了羧基葡聚糖的聚苯乙烯微球。

7.根据权利要求1‑6的任意一项所述的微球组合物的制备方法，其特征在于，所述供体微球和受体微球的粒径在100‑300nm。

8.根据权利要求1所述的微球组合物的制备方法，其特征在于，供体微球和受体微球的使用浓度为1‑20000μg/mL。

9.根据权利要求1所述的微球组合物的制备方法，其特征在于，供体微球和受体微球的使用浓度为10‑10000μg/mL。

说明书

一种均相化学发光免疫检测技术所用微球组合物的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于化学发光免疫分析技术领域，具体涉及一种均相化学发光免疫检测技术所用微球的制备方法。

背景技术

[0002] 均相化学发光检测技术最早是基于1994年Ullman等人开发的LOCI(Luminescent Oxygen Channeling Assay)技术发展而来。其原理是基于供体和受体两种微球。供体微粒中含有光敏剂，受体微球中含有多种化合物。感光微球在680nm光激发下由光敏剂释放单线态氧。单线态氧在水中传播距离约为200nm,因此只有当感光微球与发光微球通过待测物(如抗原)相连时，单线态氧才能扩散至发光微球。此时，单线态氧与发光微球中的化合物发生一系列反应，产生光信号。通过检测该光信号强度可以实现定性或定量检测。

[0003] 目前该技术已经被PerkinElmer公司商品化。PerkinElmer公司产品主要分为AlphaScreen和AlphaLISA两种系列。两种方法都使用同一种供体微球，但使用不同的受体微球。AlphaScreen受体微球上包埋了三种化合物：二甲基噻吩，蒽和红荧烯。最终发光的荧光染料红荧烯会在520‑620nm的波段发出可检测光。在AlphaLISA受体微球中，蒽和红荧烯被铕配合物替代。单线氧与二甲基噻吩反应产生紫外光，该光激发铕(Eu)配合物在615nm左右形成窄波段高强度的光信号。因此，AlphaLISA比AlphaScreen受到的干扰更小，灵敏度更高。

[0004] 美国专利5,709,994公开了光敏剂包括亚甲基蓝、叶绿素、酞菁等；化学发光化合物包括烯胺、烯醇醚等；稀土配合物包括Eu(fod)3、Eu(TTA)3等。专利CN 200510025360.8公开了光激化学发光的微球组合，该专利中感光微球的粒径小于发光微球粒径，采用这种感光微球和发光微球的组合是为了提高检测灵敏度。该专利中供体微球中的光敏剂包括亚甲基蓝、卟啉、叶绿素等，受体微球包含铕配合物和含不饱和烯键的化合物。随着检测行业的发展，对试剂的灵敏度、线性范围、成本都提出了更高的要求。

发明内容

[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种均相化学发光检测技术所用微球组合物。本发明人经过研究发现，将与单线态氧反应和发射615nm荧光这两部分功能集成到一个分子上，将其作为发光化合物填充到聚合物基质内作为受体微球，可以提高化学发光效率。因此本发明提供了一种均相化学发光检测技术所用微球组合物，微球组合物由包被了生物功能物质的供体微球和受体微球组成。所述供体微球由聚合物基质和光敏剂组成，受体微球由聚合物基质和发光化合物组成。所述发光化合物为如下结构之一或它们的组合；

[0006]

[0007]

[0008] 其中R1＝H或COOCH3，R2＝H或CH3。

[0009] 供体微球所包含的光敏剂可以是卟啉、叶绿素或酞菁。

[0010] 供体微球或受体微球所用的聚合物基质可以为天然聚合物、改性天然聚合物或合成聚合物中的一种或几种组合，这些天然聚合物、改性天然聚合物和合成聚合物包括但不限于琼脂糖、纤维素、聚丙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯。

[0011] 所述聚合物基质具有常见的官能团，如羧基、氨基、巯基、醛基，从而可以连接生物活性物质。进一步，聚合物基质优选带有羧基或醛基的聚苯乙烯微球或为外层包裹了羧基葡聚糖的聚苯乙烯微球。

[0012] 所述供体微球和受体微球的粒径在100‑300nm。供体微球和受体微球的使用浓度为1‑20000μg/mL，进一步地供体微球和受体微球的使用浓度为10‑10000μg/mL。

[0013] 本发明的有益效果是提高了灵敏度和线性范围，同时可以降低试剂使用浓度从而降低试剂成本。

附图说明

[0014] 图1为本发明实施例1制备的中间产物核磁氢谱(400M，CDCl3)。

[0015] 图2为本发明实施例1制备的发光化合物核磁氢谱(400M，(CD3)2SO)。

具体实施方式

[0016] 下面结合一些实施例进一步说明本发明。

[0017] 实施例1：发光化合物1(R1＝H,R2＝CH3)的合成

[0018] 将1.3g 2‑乙酰基‑9,10‑二甲基蒽、1.25g五氟丙酸乙酯、0.5g甲醇钠依次加入到15mL无水乙醚中，室温搅拌24小时。反应结束后加入100mL浓度为10％的稀硫酸，继续搅拌
10分钟。减压除掉乙醚，粗产物用水洗涤后在乙醇中重结晶，得到中间产物1g。将290mg该中间产物、92mg的EuCl3、60mg的2,2’,2”三联吡啶、0.75mL浓度1M的氢氧化钠水溶液依次加入到10mL乙醇中搅拌1小时。反应结束后过滤，将沉淀物用水洗涤，粗产物用乙醇重结晶得到发光化合物1。

[0019] 实施例2：受体微球的制备

[0020] 以20mg的Thermofisher的羧基乳胶微球为聚合物基质，将其和20mg的化合物1加入到含有2mL二氯甲烷中，搅拌12小时后除去二氯甲烷，将微球用2mL水分散即得到受体微球。

[0021] 实施例3：供体微球的制备

[0022] 以20mg的Thermofisher的羧基乳胶微球为聚合物基质，将其和2mg的酞菁类光敏剂加入到含有2mL二氯甲烷中，搅拌12小时后除去二氯甲烷，将微球用2mL水分散即得到供体微球。

[0023] 实施例4：供体微球包被链霉亲和素

[0024] 第一步配制如下溶液：①20mM‑MES缓冲溶液，PH7.0；②100mM‑glycine+0.3％BSA+0.02％SDS+0.1％吐温+0.1％防腐剂，PH8.0；③20mM‑HEPES+0.1％BSA+0.1％防腐剂+0.1％吐温，PH8.0。

[0025] 第二步：取供体微球200ul+纯水200ul混匀，21000G离心10分钟，去上清。

[0026] 第三步：往离心管中加入485ul溶液①混匀，超声一分钟；用溶液①配制10mg/mL的NHS和EDC；依次加入NHS溶液10ul和EDC溶液5ul，混匀；活化15分钟后，21000G离心10分钟，去上清。

[0027] 第四步：往离心管种加入500ul溶液①混匀，超声一分钟，加入15ul链酶亲和素，放置于避光条件下，血液混匀仪混匀2小时。

[0028] 第五步：将微球21000G离心10分钟，去上清；加入200ul溶液②混匀，超声一分钟；放置于避光条件下，血液混匀仪混匀1小时。

[0029] 第六步：将微球21000G离心10分钟，去上清；加入200ul溶液①混匀，超声一分钟；重复以上操作二次；加入400ul溶液③混匀，超声一分钟，得到包被好链霉亲和素的供体微球，记为试剂1。

[0030] 实施例5：受体微球包被胃蛋白酶原II(PGII)抗体

[0031] 第一步配制如下溶液：④50mM‑MES，PH7.0；⑤100mM‑glycine+0.3％BSA+0.02％SDS+0.1％吐温+0.1％防腐剂，PH8.0；⑥10mM‑TRIS+0.1％BSA+0.1％防腐剂+0.1％吐温，PH8.0。

[0032] 第二步：取受体微球200ul+纯水200ul混匀，21000G离心10分钟，去上清。

[0033] 第三步：往离心管中加入485ul溶液④混匀，超声一分钟；用溶液④配制10mg/mL的NHS和EDC；依次加入NHS溶液10ul和EDC溶液5ul，混匀；活化15分钟后，21000G离心10分钟，去上清。

[0034] 第四步：往离心管种加入500ul溶液④混匀，超声一分钟，加入10uLPGII抗体，放置于避光条件下，血液混匀仪混匀2小时。

[0035] 第五步：将微球21000G离心10分钟，去上清；加入200ul溶液⑤混匀，超声一分钟；放置于避光条件下，血液混匀仪混匀1小时。

[0036] 第六步：将微球21000G离心10分钟，去上清；加入200ul溶液④混匀，超声一分钟；重复以上操作二次；加入400ul溶液⑥混匀，超声一分钟，得到包被好PGII抗体的供体微球，记为试剂2。

[0037] 实施例6、7及比较例8

[0038] 将上述实施例中的试剂1和试剂2按表1比例稀释，将不同浓度的标样试剂25μL(Medix Biochemcia公司，经逐级稀释)、试剂2稀释液50μL、生物素化抗体50μL、试剂1稀释液50μL分别加入到微孔板中，37℃孵育10分钟后，用均相化学发光免疫分析仪测试，取十次实验的平均值列于表2中。同时，按专利CN201910743273.8的方法制备供体微球和受体微球组合，采用实例4和5的方法分别包被链霉亲和素和抗体后作为对比。

[0039] 表1

[0040]

[0041]

[0042] 表2

[0043]

[0044] 表2中B/A反映了检测限，F/A反映了线性范围，拟合直线的斜率反映了灵敏度。可以看出实施例6的B/A、F/A和斜率值均高于比较例8，即在同样的微球和抗体使用量情况下本发明的检测限和线性范围和灵敏度均优于已有技术。实施例7的B/A和F/A值略低于实施例6，但仍均高于比较例8，与此同时实施例7中试剂2的稀释倍数为比较例的2倍，因此实施例7中受体微球及其包被抗体的用量相对于比较例8节省了50％。

[0045] 显然，本发明并不局限于所描述的实施例。基于本发明中的实施例，熟悉本技术领域的人员还可据此做出多种变化，但任何与本发明等同或相类似的变化都属于本发明保护的范围。