大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用

摘要

本发明公开了大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用。本发明以大丽轮枝菌的VdNRPS3作为靶标基因，通过VIGS技术研究其与病原菌致病力之间的关系并利用转基因和RNAi技术相结合获得能够显著提高植物抗性的靶基因片段，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。本发明进一步提供了采用所述靶基因片段构建的Gateway干扰载体。本发明的大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段以及采用该靶基因片段构建的Gateway干扰载体能应用于提高作物对大丽轮枝菌所导致病害的抗性以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种等方面。

权利要求

1.大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

2.由权利要求1所述大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段所转录的dsRNA。

3.含有权利要求1所述大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段的RNA干扰载体；

其中，所述RNA干扰载体是Gateway干扰载体。

4.一种构建权利要求3所述RNA干扰载体的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段插入到Gateway干扰载体，即得。

5.权利要求1所述大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段在提高植物对大丽轮枝菌所导致病害抗性中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建含有权利要求1所述大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段的Gateway干扰载体；（2）将所构建的Gateway干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌所导致病害抗性提高的转基因植物。

7.权利要求3所述RNA干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌所导致疾病的抗性中的应用，包括：（1）将所述RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（2）筛选获得对大丽轮枝菌所导致疾病抗性提高的转基因植物。

8.一种培育抗大丽轮枝菌所导致病害的转基因植物新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建含有权利要求1所述大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段的RNA干扰载体；（2）将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌所导致疾病的抗性提高的转基因植物新品种。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物，包括但不限于烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种。

说明书

大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体

和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及大丽轮枝菌抗病原菌靶基因片段以及含有所述靶基因片段的RNA干扰载体，尤其涉及大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段以及所述RNA干扰载体在提高作物或蔬菜对大丽轮枝菌抗病性中的应用，属于大丽轮枝菌抗病原菌靶基因片段及抗病性应用领域。

背景技术

[0002] 棉花黄萎病（Cotton Verticillium Wilt）被称为“棉花癌症”，在很多国家使棉花平均减产10‑35%，严重危害棉花生产，造成了巨大的经济损失。其致病菌为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae），它具有很强的致病性，在整个棉花生长阶段内，它都能够进行侵染，导致棉花出现叶片萎蔫、变黄等现象；发病严重时，整个棉花叶片枯焦破碎，最终死亡。同时，它的寄主植物范围较为广泛，能够侵染的植物种类达六百多种，包括一年生草本植物、多年生草本植物和木本植物，其中不乏十字花科、茄科、菊科和蔷薇科等多种具有重要经济价值的农作物、苗木和花卉等，并且可侵染的寄主的范围还在不断扩大。由于大丽轮枝菌是土传植物病原真菌，防治困难，目前生产上还没有效果较好的防治药剂。

[0003]  丝状真菌可以通过非核糖体途径合成一系列低分子量的具有药用价值的多肽类次级代谢产物，这种结构复杂、种类繁多的多肽类化合物统称为非核糖体肽（non‑ribosomal peptides，NRP）。目前发现的非核糖体肽超过80%来自于真菌和放线菌,其次是粘细菌和蓝藻等单细胞原核生物。基因组序列分析结果表明,古生菌、后生动物和甲藻也有合成非核糖体肽的潜力（Wang H, Fewer D P, Holm L, et al. Atlas of nonribosomal peptide and polyketide biosynthetic pathways reveals common occurrence of nonmodular enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(5): 9259‑ 9264.）。它们具有抗菌、抗病毒和抗癌等多种生物活性，目前已经得到了广泛的应用。NRP主要是由非核糖体肽合成酶（NRPS）催化形成，第一个被鉴定的NRPS是L‐氨基己二酰‐L‐半胱氨酸‐D‐缬氨酸合酶，它催化β‐内酰胺类抗生素生物合成的第一步反应，将3个氨基酸缩合成一个三肽化合物进而形成青霉素等β‐内酰胺抗生素（Smith D J, Burnham M K R, Bull J H, et al. Beta‑lactam antibiotic biosynthetic genes have been conserved in clusters in prokaryotes and eukaryotes. Embo Journal, 1990, 9(3): 741‑ 747）。NRPS具有多种生理功能，可作为抗生素（Antibiotics）抑制同自身进行营养物质竞争的竞争者；也可作为毒素（Toxins），在病原菌侵入寄主并定殖的过程中扮演着重要的角色；还有一些可以作为铁载体（Siderophores）参与微生物生长；还可作为储存含氮物质的场所或作为信号因子，调节微生物的生长、繁殖以及分化等。有些NRPS还与其他酶系如聚酮类（Polyketide）或萜类（Terpenoid）合成酶系共同完成杂合分子的合成。典型的NRPS由多个模块（Module）组成，这些模块按特定的空间顺序排列，每个模块由多个功能结构域（Domain）或催化单元组成，结构多样的非核糖体肽在这些模块及其结构域上有序地进行合成。近期玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）全基因组测序数据显示，玉米小斑病菌中编码NRPS的基因有12个，其中NPS6作为玉米小斑病中的典型的毒力决定因子，不仅参与其致病还参与对H2O2的耐受性，是玉米病原菌（Cochliobolus miyabeanus）的毒力决定因素，与H2O2的耐受性有关。水稻病原菌宫部旋孢腔菌（Cochliobolus miyabeanus），小麦赤霉病病原菌禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）和拟南芥病原菌（Alternaria brassicicola）中与NPS6同源基因的缺失也会导致它们相对应的毒力下降和对H2O2的耐受性变差（Oide S, Moeder W, Krasnoff S  , et al. NPS6, encoding a nonribosomal peptide synthetase involved in siderophore‑mediated iron metabolism, is a conserved virulence determinant of plant pathogenic ascomycetes. Plant Cell, 2006, 18(10): 2836‑ 2853.）。

[0004] 本发明人通过对大丽轮枝菌的基因组序列分析发现共存在6个NRPS基因，对不同侵染时期的基因表达量进行分析，发现VdNRPS3在侵染初期显著上调表达，可能与大丽轮枝菌的致病力密切相关。因此，从VdNRPS3基因中筛选获得抗病靶基因片段并构建相应的干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性。

发明内容

[0005] 本发明的目的之一是提供大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病靶基因片段；

[0006] 本发明的目的之二是提供含有所述大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病靶基因片段的RNA干扰载体；

[0007] 本发明的目的之三是将所述大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病靶基因片段以及含有该靶基因片段的RNA干扰载体应用于植物抗病或构建获得抗病的转基因植物新品种。

[0008] 为实现上述目的，本发明所采取的主要技术方案包括：

[0009] 本发明首先公开了能够提高植物抗病原菌的大丽轮枝菌VdNRPS3靶基因片段，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示；优选的，所述靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

[0010] 本发明还公开了含有所述的大丽轮枝菌VdNRPS3靶基因片段的RNA干扰载体以及含有所述RNA干扰载体的宿主细胞。

[0011] 此外，由SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示的靶基因片段所转录的dsRNA也包含在本发明的保护范围之内。

[0012] 本发明所述大丽轮枝菌VdNRPS3靶基因片段能够应用于提高植物对大丽轮枝菌所导致的疾病的抗病性，包括以下步骤：（1）构建含有所述大丽轮枝菌VdNRPS3靶基因片段的RNA干扰载体；（2）将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

[0013] 优选的，一种构建所述RNA干扰载体的方法，包括：通过BP反应，将所述的大丽轮枝菌VdNRPS3靶基因片段连接至pDONR207中再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中得到Gateway干扰载体。

[0014] 本发明所述RNA干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌所导致的疾病的抗病性，包括以下步骤：（1）将所述RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（2）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

[0015] 本发明中所述的大丽轮枝菌所导致的病害优选为棉花黄萎病。

[0016] 本发明进一步公开了一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，包括以下步骤：（1）构建含有所述大丽轮枝菌VdNRPS3靶基因片段的RNA干扰载体；（2）将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物新品种。

[0017] 所述转化的方案以及将所述核苷酸引入植物的方案可适用于转化的植物或植物细胞的类型而变化。将所述核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化和直接基因转移等。

[0018] 本发明所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物，优选为农作物或蔬菜，包括：烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种。

[0019] 本发明采用寄主诱导的基因沉默技术（Host‑induced gene silencing，HIGS），以高致病力的大丽轮枝菌株V991为实验材料，构建多个针对大丽轮枝菌靶标基因非核糖体肽合成酶3（non‑ribosomal peptide synthetase 3, NRPS3  ,VDAG_05314）的烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）干扰质粒。通过农杆菌注射的方法转化本氏烟草（Nicotina benthamiana），并进行大丽轮枝菌接种，将其中可以明显降低植物病情指数的靶标片段构建Gateway干扰载体，获得稳定遗传的转基因植物。通过病情指数以及分子生物学手段检测真菌生物量以及靶标基因的转录水平，筛选到效果最佳的干扰片段。本发明筛选得到的大丽轮枝菌VdNRPS3靶基因片段以及应用该靶基因片段所构建的RNA干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌所导致疾病的抗病性以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。

[0020] 本发明整体技术方案详述

[0021] 本发明根据大丽轮枝菌VdNRPS3编码序列信息，设计引物，扩增获得针对靶标基因的5个不同区段。这5个靶标基因分别为VdNRPS3‑1、VdNRPS3‑2、VdNRPS3‑3、VdNRPS3‑4和VdNRPS3‑5，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。通过BamH I和EcoR I将克隆获得的靶标片段进行酶切，然后将其构建到TRV2载体中，成为VIGS系列RNAi载体。通过菌液扩增和DNA测序进行验证后，发现序列与靶标片段序列完全一致。然后，将验证正确的阳性质料转化至农杆菌GV3101，用于本氏烟草的注射。

[0022] 从注射后的第7天起，本氏烟草的新生嫩芽开始出现白化现象。待到第10天，新生的叶片全部为白色，并且这种叶片白化的现象可以持续45天。这表明，接种后的第7天，本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA，并发挥着干扰作用。因此，本发明选择了从注射6
VIGS系列载体后的第7天，进行10 cfu/mL孢子悬液的蘸根法接种。对接菌后的10 dpi（days post‑inoculation）、11 dpi和12 dpi进行本氏烟草的病情指数统计。结果显示，与空载相比，注射真菌靶标基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降；随着天数的增加，病情指数逐渐上升。VdNRPS3‑2、VdNRPS3‑3、VdNRPS3‑5三组烟草中，病情指数一直保持在较低水平，初步说明这三段靶标片段的引入可以降低植物的病情指数。

[0023] 本发明通过VIGS筛选的方法，获得了3个可以提高植物对病原菌抗性的靶标区段，为了进一步验证VdNRPS3与病原菌致病性之间的关系，以及干扰后能显著降低病原菌致病力的区段，获得稳定遗传的转基因本氏烟草，设计了针对靶标基因的引物，引物两端带有BP位点，通过扩增获得了目的基因片段。本发明通过BP反应和LR反应，将克隆获得的3个VdNRPS3靶标片段连接到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0上形成含有真菌靶标基因的植物转化载体。

[0024] 为了获得能够稳定遗传针对病原菌靶标基因VdNRPS3的dsRNA，通过农杆菌介导及组织培养的方法，将构建好的Gateway干扰载体转化至本氏烟草，最终获得转基因烟草并对转基因烟草的抗病性分析。

[0025] 对获得的含有dsVdNRPS3‑2、3、5的阳性转基因烟草，进行大丽轮枝菌接种。然后从接种后10 dpi、11 dpi和12 dpi进行病情指数分析。从试验结果可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，病情指数下降约40‑85%。提取转基因烟草根部DNA，利用qRT‑PCR进行真菌生物量分析。转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，约为野生型的20‑40%。病情指数统计以及真菌生物量分析，可以明显观察到转基因阳性烟草对病原菌具有更强的抗性。

[0026] 为了进一步验证植物病情指数降低与靶标基因表达之间的关系，本发明通过对植物根部病原菌靶标基因的表达量分析，可以观察到与野生型植物相比，转基因植物体内靶标基因表达量下降了约50‑80%。同时，图片显示RNAi‑VdNRPS3转基因烟草的抗病性明显优于野生型烟草。并且根据三个材料的病情指数、真菌量和靶标基因表达量检测，表明VdNRPS3基因的区段2（VdNRPS3‑2）作为靶标片段设计dsRNA，可以达到最佳的干扰效果，从而可以有效降低病原菌的致病力。

[0027] 本发明所涉及到的术语定义

[0028] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

[0029] 术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。

[0030] 术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。

[0031] 术语“RNA干扰（RNA interference, RNAi）”意指通过外源或内源性的双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现象。

附图说明

[0032] 图1为VIGS载体示意图。

[0033] 图2为VIGS不同区段扩增结果。

[0034] 图3为VIGS干扰载体菌液扩增验证；M为marker，N为阴性对照，1‑4（第1片段）、5‑8（第2片段）、9‑12（第3片段）、13‑16（第4片段）和17‑20（第5片段）为针对VdNRPS3基因构建VIGS质粒的菌液扩增结果。

[0035] 图4为病情指数统计结果。

[0036] 图5为RNAi扩增结果；M为marker，M为marker，1、2、3为针对VdNRPS3‑2、VdNRPS3‑3、VdNRPS3‑5的条带。

[0037] 图6为RNAi载体示意图。

[0038] 图7为转基因阳性烟草PCR检测结果；M：marker，1‑4（第2片段）、5‑8（第3片段）、9‑12（第5片段）为转基因阳性烟草，WT为野生型烟草。

[0039] 图8为转基因烟草病情指数分析结果。

[0040] 图9为植物体内真菌生物量分析结果。

[0041] 图10为植物体内真菌靶标基因表达量分析结果。

具体实施方式

[0042] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

[0043] 实施例1大丽轮枝菌VdNRPS3抗病原菌靶基因片段的筛选、RNA干扰载体的构建和转烟草抗病性验证

[0044] ⒈材料与方法

[0045] ⑴材料

[0046] 烟草：本氏烟草（Nicotiana benthamiana）品系。

[0047] 培养条件：种植于高温高压灭菌过的混合营养土（芳洁营养土：蛭石 = 1：1）中，温度23 ± 2℃，相对湿度75 ± 5 %，光周期L：D为16 h：8 h。

[0048] ⑵菌株和质粒

[0049] 棉花黄萎病原菌：大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）V991，高致病力落叶型菌株，由中国农科院植物保护研究所简桂良研究员惠赠。

[0050] 病毒载体：烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）双元载体（TRV1与TRV2）由清华大学刘玉乐教授惠赠。

[0051] 农杆菌：菌株GV3101和LBA4404，由本发明人实验室保存。

[0052] 植物稳定遗传载体：pDONR207和pK7GWIWG2(I),0载体由本发明人实验室保存。

[0053] ⑶真菌的培养以及植物接种方式

[0054] 将大丽轮枝菌孢子培养于液体CM培养基中，25℃振荡培养5‑7天。经5层纱布过滤，6
离心收集孢子，用蒸馏水稀释并在显微镜下观察，将孢子浓度调整至10 cfu/mL后备用。

[0055] 当本氏烟草的叶片长至6‑8片真叶时，选取长势一致的幼苗进行接种。用镊子从根6
部将幼苗挖出，并在蒸馏水中清洗根部泥土。将幼苗根部完全浸泡于稀释好的10 cfu/mL孢子悬液或蒸馏水中2 min后，尽快将幼苗移回原来的塑料钵中，并浇水，使土壤湿润，进行病情指数统计。

[0056] ⑷植物病情指数统计

[0057] 根据相关文献（Wang HM,  Lin ZX,  Zhang XL, et al. Mapping  and quantitative trait loci analysis of Verticillium wilt resistance genes in cotton. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50(2): 174‑ 182.）并做出适当调整，制定本实验中本氏烟草感染大丽轮枝菌的病情等级（如表1）。病情指数计算公式如下（公式1）：

[0058] 表1 病情指数统计

[0059]

[0060]  公式1 病情指数= [Ʃ (number × level) / (total plant × highest level) ] ×100

[0061] ⑸VIGS干扰载体的构建

[0062] 为了筛选得到干扰效果最佳的靶标基因区段，根据大丽轮枝菌非核糖体肽合成酶3（non‑ribosomal peptide synthetase 3, NRPS3 ,VDAG_05314）的编码序列，设计2对特异性引物，引物两端含有EcoR I和BamH I酶切位点（如表2），分别对目的片段进行扩增。然后利用l%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并进行片段回收。将目的片段以及载体分别进行酶切反应，并利用T4连接酶将其构建至TRV2载体中。最后，利用酶切以及测序分析，将验证好的阳性质粒转化至农杆菌GV3101中。

[0063] 表2 VdNRPS3不同区段引物信息

[0064]

[0065] 注：加粗斜体处为酶切位点。

[0066] ⑹VIGS转化方法

[0067] 将含有阳性质粒的农杆菌单克隆放于LB液体培养基（25 µg/mL Rif和50 µg/mL Kan）中，28℃摇床过夜培养。次日将菌液（比例为2%）加入LB液体培养基中再次培养，振荡培养至OD600为0.5 ‑ 0.6时，低温离心收集菌体。弃去废液，将菌体重悬于注射基质（10 mM MES、10 mM MgCl2、100 µM 乙酰丁香酮）中，调整OD600至0.8 ‑ 1.0。把两种农杆菌菌株（TRV1与TRV2+靶标基因片段）以1：1混合，在室温中静置3‑5 h，不要摇动。最后利用注射器将农杆菌混合液注射于最嫩的叶片中。

[0068] ⑺稳定遗传载体的构建

[0069] 为了获得稳定遗传的含有靶标基因dsRNA的本氏烟草，对能够明显提高植物对病原菌抗性的DNA区段，重新设计引物（两端含有部分BP位点），然后再用attb引物进行扩增（如表3），用于稳定遗传干扰载体的构建。通过BP反应，将靶标序列连接至pDONR207中；然后通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中；最后将构建好的载体转化至农杆菌LBA4404中。

[0070] 表3 稳定遗传干扰引物信息

[0071]

[0072] ⑻本氏烟草的转化

[0073] 将种在MS基本培养基上的本氏烟草叶片，切成0.4×0.6 cm大小的小段（除去边缘和主要叶脉），放入OD600为0.1 ‑ 0.2的含有阳性质粒的农杆菌LBA4404菌液中浸泡5 min，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液。然后将小叶片置于铺有一层滤纸的烟草芽分化培养基（MS + NAA 0.2 mg/L + 6‑BA 2 mg/L）上进行培养，25℃暗室内培养3天。将经过共培养的烟草外植体转移到含有相应抗生素的筛选培养基（MS + NAA 0.2 mg/L + 6‑BA 2 mg/L + Kan 100 mg/L + Carb 500 mg/L）中进行培养，光照周期为16 h光照/8 h黑暗。2‑3周后待抗性芽生长至1‑2 cm高时，用无菌手术刀切下小芽转入生根培养基（MS + Kan 100 mg/L + Carb 500 mg/L）中诱导生根，1 2周后就会有不定根形成。然后提取转基因植物DNA，并~进行PCR检测（如表4），获得转基因阳性植株。

[0074] 表4 检测引物信息

[0075]

[0076] ⑼真菌生物量检测

[0077] 为了比较转基因本氏烟草与野生型本氏烟草中病原菌的生物量变化，我们利用qRT‑PCR测定不同植物基因型根部大丽轮枝菌的生物量。提取接菌12天本氏烟草根部总DNA，以大丽轮枝菌内部转录间隔区ITS为靶标片段，同时以本氏烟草的持家基因actin为持家片段，进行相对定量测定（如表5）。

[0078] qRT‑PCR反应在ABI7500上反应完成，结果采用2‑∆∆Ct法进行结果分析。引物的单峰性以及扩增效率满足实验要求。

[0079] 表5 荧光定量引物信息

[0080]

[0081] ⑽靶标基因的表达量分析

[0082] 为了确定本氏烟草抗性的提高与靶标基因的下降存在一定的关系，我们利用qRT‑PCR进一步测定本氏烟草中靶标基因的转录水平。提取接菌12天本氏烟草根中总RNA，并进行反转录分析。以病原菌中VdNRPS3基因的编码序列设计引物作为目的片段（表6），同时以病原菌actin作为持家片段，进行转录水平的相对定量测定。

[0083] qRT‑PCR反应在ABI7500上反应完成，结果采用2‑∆∆Ct法进行结果分析。引物的单峰性以及扩增效率满足实验要求。

[0084] 表6 荧光定量引物信息

[0085]

[0086] ⒉实验结果

[0087] ⑴大丽轮枝菌VdNRPS3干扰载体的构建

[0088] 本实验采用清华刘玉乐老师提供的烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）载体（图1）。TRV的cDNA位于双35S启动子和胭脂碱合成酶终止子（nopaline synthase terminator，NOSt）之间。TRV1包含了病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）、可移动蛋白（Movement Protein，MP）、16 kDa富含半胱氨酸区域等其它元件。TRV2包含病毒的衣壳蛋白（coat protein，CP）、多克隆位点（multiple cloning site，MCS）等其它元件。多克隆位点的引入，方便了外源基因的插入。

[0089] 根据大丽轮枝菌VdNRPS3编码序列信息，设计引物，扩增获得针对靶标基因的5个不同区段（图2）。这5个靶标基因分别为VdNRPS3‑1、VdNRPS3‑2、VdNRPS3‑3、VdNRPS3‑4和VdNRPS3‑5，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。

[0090] 通过BamH I和EcoR I将克隆获得的靶标片段进行酶切，然后将其构建到TRV2载体中，成为VIGS系列RNAi载体。通过菌液扩增和DNA测序进行验证后，发现序列与靶标片段序列完成一致（图3），然后，将验证正确的阳性质料转化至农杆菌GV3101，用于本氏烟草的注射。

[0091] ⑵本氏烟草的病情指数分析

[0092] 从注射后的第7天起，本氏烟草的新生嫩芽开始出现白化现象。待到第10天，新生的叶片全部为白色，并且这种叶片白化的现象可以持续45天。这表明，接种后的第7天，本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA，并发挥着干扰作用。因此，我们选择了从注射6
VIGS系列载体后的第7天，进行10 cfu/mL孢子悬液的蘸根法接种。对接菌后的10 dpi、11 dpi和12 dpi进行本氏烟草的病情指数统计。结果显示（图4），与空载相比，注射真菌靶标基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降；随着天数的增加，病情指数逐渐上升。VdNRPS3‑
2、VdNRPS3‑3、VdNRPS3‑5三组烟草中，病情指数一直保持在较低水平，初步说明这三段靶标片段的引入可以降低植物的病情指数。

[0093] ⑶转基因植株的获得

[0094] 通过VIGS筛选的方法，获得了3个可以提高植物对病原菌抗性的靶标区段。为了进一步验证VdNRPS3与病原菌致病性之间的关系，以及干扰后能显著降低病原菌致病力的区段，获得稳定遗传的转基因本氏烟草，我们设计了针对靶标基因的引物，引物两端带有BP位点，通过扩增获得了目的基因片段。从电泳图5中可以发现明亮的目的条带。通过进一步的DNA测序、比对后发现，序列与靶标序列完全一致。

[0095] 通过BP反应和LR反应，将克隆获得的3个VdNRPS3靶标片段连接到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0（图6）上，形成含有真菌靶标基因的植物转化载体。

[0096] 为了获得能够稳定遗传针对病原菌靶标基因VdNRPS3的dsRNA，通过农杆菌介导及组织培养的方法，将构建好的Gateway干扰载体转化至本氏烟草，最终获得转基因烟草（图7）。

[0097] ⑷转基因烟草的抗病性分析

[0098] 对获得的含有dsVdNRPS3‑2、3、5的阳性转基因烟草，进行大丽轮枝菌接种。然后从接种后10 dpi、11 dpi和12 dpi进行病情指数分析。从图8可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，病情指数下降约40‑85%。提取转基因烟草根部DNA，利用qRT‑PCR进行真菌生物量分析。图9表明，转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，约为野生型的20‑40%。病情指数统计以及真菌生物量分析，可以明显观察到转基因阳性烟草对病原菌具有更强的抗性。

[0099] 为了进一步验证植物病情指数降低与靶标基因表达之间的关系，通过对植物根部病原菌靶标基因的表达量分析，可以观察到与野生型植物相比，转基因植物体内靶标基因表达量下降了约50‑80%（图10）。同时，图片显示RNAi‑VdNRPS3转基因烟草的抗病性明显优于野生型烟草。并且根据三个材料的病情指数、真菌量和靶标基因表达量检测，表明VdNRPS3基因的区段2（VdNRPS3‑2）作为靶标片段设计dsRNA，可以达到最佳的干扰效果，可有效降低病原菌对植物的致病力。