一种基于化学增强的CE-RAA-CRISPR快速检测副溶血弧菌的方法转让专利
申请号 : CN202210401694.4
文献号 : CN114752656B
文献日 : 2022-12-23
发明人 : 叶蕾 , 吕新瑞 , 张璜 , 曹炜伟 , 阙慕仪 , 张依琳 , 石磊
申请人 : 暨南大学
摘要 :
本发明公开了一种基于化学增强的CE‑RAA‑CRISPR快速检测副溶血弧菌的方法。本发明将RAA扩增技术与CRISPR系统相结合，优化相关检测条件，筛选最优检测方法，实现痕量食源副溶血弧菌残留的检测。并通过化学试剂的添加进一步增强检测灵敏度。本研究与传统的培养检测方法相比，克服了培养技术周期长，过程繁冗，安全时效性差的难题，与以往的分子检测技术相比，提高了灵敏度和准确性，缩短致病菌检测的时间，以及提升了对多种细菌高通量的检测能力和隐性细菌的鉴定能力。
权利要求 :
1.一种非疾病诊断目的的副溶血弧菌的检测方法，其特征在于包括如下步骤：（1）RAA引物设计：
根据副溶血弧菌特异性基因tlh的保守序列，设计3条RAA上引物：F1 AGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACG；
F2 TTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTA；
F3 TTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACG；
以及3条RAA下引物：
R1 GTCACCGAGTGCAACCACTTTGTTGATTTGA；
R2 TTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCGAGTG；
R3 TGTTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCGAGTG；
根据引物扩增区域，设计相对应ssDNA‑FQ探针；ssDNA‑FQ探针为：6‑FMA‑TTATT‑BHQ1；
（2）采用CRISPR体系：
根据扩增区域设计crRNA序列；采用CRISPR反应体系；
crRNA序列为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUCUGGCUGCAUUGCUGCGU；
（3）采用CE‑RAA‑CRISPR方法：建立CE‑RAA‑CRISPR方法，下层为RAA反应体系，中间层用石蜡油分隔，RAA反应结束后，在管盖内侧中加入CRISPR体系，通过离心方式进行混合，然后置于荧光检测仪上，37 ℃反应20‑30 min，每隔30 s进行一次荧光测定；
所述CRISPR反应体系中含有50 200 nM LbCas12a、50 200 nM crRNA、500 nM ssDNA‑~ ~FQ探针、2 µL 100 µg/mL BSA溶液、2 µL 5M L‑脯氨酸溶液和2 µL 10×反应Buffer；
所述LbCas12a：crRNA的摩尔比为2:1。
说明书 :
一种基于化学增强的CE‑RAA‑CRISPR快速检测副溶血弧菌的
方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种副溶血弧菌的检测方法。
背景技术
[0002] 聚类规则间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)和CRISPR相关联的蛋白(CRISPR associated,Cas)共同组成了CRISPR/Cas系统，该系统是细菌中由核糖核酸引导的适应性防御机制，是生命进化史上细菌与病毒斗争产生的免疫武器，使细菌免受病毒和外来遗传物质的入侵。在该系统中，CRISPR序列是由众多短而保守的重复序列区(repeat)和间隔区(spacer)组成的。该系统将俘获的外源DNA序列整合至Spacer区，不同外源DNA之前由Repeat区中相同的回文序列间隔开。Cas基因负责编码蛋白，与CRISPR序列区域共同发生作用。
[0003] 近年来，CRISPR/Cas系统除了具有出色的基因组编辑能力外，在核酸检测的生物传感方面也显示出了巨大的潜力。利用Cas12a在与目标DNA结合时具有剪切活性，种不同的CRISPR/Cas12a生物传感器被引入用于检测不同的核酸靶点，包括癌症突变、致病菌和病毒、细菌耐药性等各个方面。其检测具有快速、便携以及操作简便等优势。然而，该方法在实际应用中仍然存在许多障碍和局限性，仅依靠CRISPR/Cas12a系统较难实现痕量致病菌的定量检测。
[0004] 重组酶介导等温核酸扩增(Recombinase Aided Amplification,RAA)是利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶在恒温环境下，进行核酸扩增的一项分子生物学检测技术。其原理是重组酶、单链结合蛋白与寡核苷酸引物相结合形成复合物，根据碱基互补配对原则，特异性识别模板上的靶序列并使双链DNA解旋，此时单链结合蛋白与其中一条链相结合防止单链DNA复性，在DNA聚合酶的作用下，有5’开始向3’进行链的延伸，最终使模板呈指数形式积累。
[0005] 然而采用上述方法检测副溶血弧菌均存在不足之处。
发明内容
[0006] 本发明的目的是克服上述现有技术的不足，提供一种利用RAA技术与CRISPR/Cas系统联用，以致病性副溶血弧菌为检测目标，通过化学添加方法来增强荧光检测信号，建立快速、灵敏且特异的CE‑RAA‑CRISPR核酸检测方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种副溶血弧菌的检测方法，包括如下步骤：
[0009] (1)RAA引物设计：
[0010] 根据副溶血弧菌特异性基因(tlh)的保守序列，设计3条RAA上引物：
[0011] F1 AGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACG；
[0012] F2 TTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTA；
[0013] F3 TTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACG；
[0014] 以及3条RAA下引物：
[0015] R1 GTCACCGAGTGCAACCACTTTGTTGATTTGA；
[0016] R2 TTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCGAGTG；
[0017] R3 TGTTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCGAGTG；
[0018] 根据引物扩增区域，设计相对应crRNA序列；
[0019] (2)采用CRISPR体系：
[0020] 根据扩增区域设计crRNA序列；采用CRISPR反应体系；
[0021] (3)采用CE‑RAA‑CRISPR方法：
[0022] 建立CE‑RAA‑CRISPR方法，下层为RAA反应体系，中间层用石蜡油分隔，RAA反应结束后，在管盖内侧中加入CRISPR体系，通过离心方式进行混合，然后置于荧光检测仪上，37℃反应20‑30min，每隔30s进行一次荧光测定。
[0023] 作为优选的，在上述的副溶血弧菌的检测方法中，所述CRISPR反应体系中含有50～200nM LbCas12a、50～200nM crRNA、500nM ssDNA‑FQ探针、2μL BSA溶液(1mg/mL)、2μL L‑脯氨酸溶液(5M)和2μL 10×反应Buffer，用水补足至10μL。所述LbCas12a：crRNA的最佳摩尔比为2:1。
[0024] 与现有的技术相比，本发明的有益效果是：
[0025] 1.本发明针对副溶血性弧菌特异性tlh基因设计了RAA特异性引物及探针检测，并对其进行了优化，对副溶血弧菌特异性强；本发明所述的副溶血性弧菌定量检测方法灵敏度高，检测限为67CFU/mL，能够对实际样本中不同浓度的副溶血弧菌进行准确定量。本发明所述的副溶血性弧菌定量检测方法采用了化学试剂增强荧光信号，在普通优化Cas12a/crRNA浓度比例基础上进一步提高了检测灵敏度。
[0026] 2.本发明将RAA扩增技术与CRISPR系统相结合，优化相关检测条件，筛选最优检测方法，实现痕量食源副溶血弧菌残留的检测。并通过化学试剂的添加进一步增强检测灵敏度。本研究与传统的培养检测方法相比，克服了培养技术周期长，过程繁冗，安全时效性差的难题，与以往的分子检测技术相比，提高了灵敏度和准确性，缩短致病菌检测的时间，以及提升了对多种细菌高通量的检测能力和隐性细菌的鉴定能力。
附图说明
[0027] 图1为RAA引物优化结果图；
[0028] 图2为Cas12a/crRNA浓度优化图；
[0029] 图3化学添加剂优化图；
[0030] 图4为CE‑RAA‑CRISPR方法灵敏度显示图。
具体实施方式
[0031] 实施例1：基于化学增强的CE‑RAA‑CRISPR快速检测副溶血弧菌的方法[0032] 1、实验材料：副溶血弧菌标准菌株、副溶血弧菌分离菌株、溶藻弧菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、阪崎克罗诺杆菌以及单增李斯特菌。
[0033] 2、细菌培养及DNA制备：将保存于‑80℃甘油菌平板划线，37℃培养18‑24h，取平板上单菌落接种到液体增菌培养基中，培养至生长对数期。取生长对数期的菌液1mL，采用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，储存于‑20℃备用。
[0034] 3、RAA引物设计及优化：根据副溶血弧菌特异性基因(tlh)的保守序列，使用Primer Premier 5.0分别设计3条RAA上引物3条RAA下引物；根据引物扩增区域，设计相对应探针序列，如表1。所涉及引物均有生工生物工程(上海)有限公司合成。采用荧光法RAA试剂盒进行引物扩增能力测定。如图1所示，当上引物F1与下引物R1进行组合时，出峰点最早，其荧光值达到最大值，引物扩增效率最好。
[0035] 4、RAA‑CRISPR反应体系：普通RAA体系为10μL，包含5μL缓冲溶液，0.8μL(10μM)上下游引物，0.6μL乙酸镁(280mM)以及2μL DNA模板。在RAA反应体系上层加入10μL石蜡油，在RAA反应完成后，通过离心与CRISPR试剂进行混合。CRISPR反应体系中含有50～200nM LbCas12a、50～200nM crRNA、500nM ssDNA‑FQ探针和2μL 10×反应Buffer。所得结果如图2所示，当Cas12a蛋白与crRNA比例为2:1时，其荧光值达到最大值。因此，选择Cas12a：crRNA为2:1最为CRISPR体系最佳反应条件，并在最佳添加下进行后续实验。
[0036] 本实验采用了在CRISPR体系中进行化学添加的方法来进一步增强荧光信号，建立了CE‑RAA‑CRISPR检测体系，从图3中可见，BSA的加入能够显著增强终点荧光信号值。再次基础上，一些化学添加剂如L‑脯氨酸、甘油以及甜菜碱等能够进一步对荧光信号起到了增强作用，但L‑脯氨酸的增强效果更为显著，因此，选择0.5M的L‑脯氨酸作为荧光信号增强的化学添加剂并用于后续实验。
[0037] 5、纯培养物中CE‑RAA‑CRISPR反应体系灵敏度比较及分析：将培养至对数期的菌液进行10倍梯度稀释，采用细菌基因组提取试剂盒进行基因组DNA的提取。同时采用平板涂布确定菌液浓度。将提取的DNA作为模板，在最优条件下，分别采用RAA‑CRISPR技术和化学1
增强的CE‑RAA‑CRISPR检测方法进行定量检测。如图4所示，当菌液浓度低至6.7×10CFU/mL时，荧光值与阴性值之间仍存在显著性差异(P<0.05)，当菌液浓度进一步降低到6.7×
100CFU/mL时，荧光强度与阴性值之前无明显差异，因此，在纯培养物种，针对副溶血弧菌，
1
化学增强的CE‑RAA‑CRISPR检测方法灵敏度为6.7×10 CFU/mL，与未添加化学试剂的RAA‑CRISPR方法相比，灵敏度降低了10倍。
增强的CE‑RAA‑CRISPR检测方法进行定量检测。如图4所示，当菌液浓度低至6.7×10CFU/mL时，荧光值与阴性值之间仍存在显著性差异(P<0.05)，当菌液浓度进一步降低到6.7×
100CFU/mL时，荧光强度与阴性值之前无明显差异，因此，在纯培养物种，针对副溶血弧菌，
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化学增强的CE‑RAA‑CRISPR检测方法灵敏度为6.7×10 CFU/mL，与未添加化学试剂的RAA‑CRISPR方法相比，灵敏度降低了10倍。
[0038] 6、化学增强的CE‑RAA‑CRISPR反应体系特异性分析：
[0039] 分别提取材料中所述的各种菌的基因组DNA，在最佳检测条件下，采用CE‑RAA‑CRISPR方法进行定量检测，以验证所建立方法的特异性。如表2所示，本专利所建立的CE‑RAA‑CRISPR检测方法只能够检测到目标副溶血弧菌，而对其他菌荧光响应值较低，证明所建立的检测方法特异性较好。
[0040] 表1.本实施例中所用引物和探针
[0041]
[0042]
[0043] 表2.RAA‑CRISPR方法特异性
[0044]序号 菌种 株 特异性结果
1 副溶血弧菌 ATCC 17802 +
2 副溶血弧菌分离菌 JNUFN 01 +
3 副溶血弧菌分离菌 JNUFN 02 +
4 副溶血弧菌分离菌 JNUFN 03 +
5 副溶血弧菌分离菌 JNUFN 04 +
6 副溶血弧菌分离菌 JNUFN 05 +
7 溶藻弧菌 ATCC 33787 ‑
8 大肠杆菌O157:H7 ATCC 35150 ‑
9 金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 ‑
10 阪崎克罗诺杆菌 ATCC29544 ‑
11 单增李斯特菌 ATCC 19115 ‑
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1 副溶血弧菌 ATCC 17802 +
2 副溶血弧菌分离菌 JNUFN 01 +
3 副溶血弧菌分离菌 JNUFN 02 +
4 副溶血弧菌分离菌 JNUFN 03 +
5 副溶血弧菌分离菌 JNUFN 04 +
6 副溶血弧菌分离菌 JNUFN 05 +
7 溶藻弧菌 ATCC 33787 ‑
8 大肠杆菌O157:H7 ATCC 35150 ‑
9 金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 ‑
10 阪崎克罗诺杆菌 ATCC29544 ‑
11 单增李斯特菌 ATCC 19115 ‑
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