一种利用GC特征指纹图谱鉴别阳春砂或绿壳砂的方法转让专利
申请号 : CN202110836134.7
文献号 : CN114755315B
文献日 : 2023-05-02
发明人 : 石典花 , 卢琪 , 张军 , 戴衍朋 , 俎龙辉
申请人 : 山东省中医药研究院
摘要 :
本发明公开了一种利用GC特征指纹图谱鉴别阳春砂或绿壳砂的方法，具体为将去除前5分钟以溶剂峰为主的待测砂仁GC特征指纹图谱与去除前5分钟以溶剂峰为主的标准砂仁GC特征指纹图谱进行相似性分析，若相似度为0.900~1.000时，鉴定为阳春砂或绿壳砂；标准砂仁GC特征指纹图谱的鉴定方法为：取若干批次的阳春砂或绿壳砂标准品粉末，加乙醇溶解并超声处理，滤过，滤液注入气相色谱仪，得GC指纹图谱，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后进行分析，生成阳春砂和绿壳砂标准砂仁GC特征指纹图谱。本发明可有效鉴别是否为阳春砂或绿壳砂，尤其是将其粉碎成颗粒、粉末甚至制剂难以鉴别时，具有操作简单、鉴定结果可靠和经济环保的优点。
权利要求 :
1.一种利用GC特征指纹图谱鉴别阳春砂或绿壳砂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)标准砂仁GC特征指纹图谱建立：分别取若干批次阳春砂和绿壳砂标准样品粉末，加乙醇溶解并超声处理，过滤，滤液作为标准品溶液，进行气相色谱分析，获得GC指纹图谱，将获得的每一批次的GC指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后进行分析，生成阳春砂和绿壳砂标准砂仁GC特征指纹图谱；
(2)待测砂仁样品指纹图谱测定：取待测砂仁样品粉末，加乙醇溶解并超声处理，过滤，滤液作为供试品溶液，进行气相色谱分析，获得待测砂仁GC指纹图谱；
(3)将步骤(2)中待测砂仁的GC指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后，与步骤(1)中的标准砂仁GC特征指纹图谱进行相似度分析，若相似度为0.900～1.000时，鉴定为阳春砂或绿壳砂；
所述的气相色谱条件为：色谱柱：DB‑1毛细管柱，100％二甲基聚硅氧烷为固定相，柱长为30m，内径为0.25mm，膜厚度为0.25μm；柱温100℃，进样口温度230℃；FID检测器温度250℃；分流比为10:1。
2.根据权利要求1所述的利用GC特征指纹图谱鉴别阳春砂或绿壳砂的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述的标准样品或待测样品的取样量为0.5～2g，标准样品或待测样品与乙醇的比例为1g:25mL，超声处理时间为20～40min。
3.根据权利要求1所述的利用GC特征指纹图谱鉴别阳春砂或绿壳砂的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的阳春砂或绿壳砂标准样品的取样批次为10～20批。
4.根据权利要求1所述的利用GC特征指纹图谱鉴别阳春砂或绿壳砂的方法，其特征在于，所述的中药色谱指纹图谱相似度评价系统为中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版。
说明书 :
一种利用GC特征指纹图谱鉴别阳春砂或绿壳砂的方法
技术领域
[0001] 本发明属于中药品种分析技术领域，具体涉及一种利用GC特征指纹图谱鉴别阳春砂或绿壳砂的方法。
背景技术
[0002] 砂仁是姜科植物阳春砂（Amomum villosum Lour.）、绿壳砂（Amomum villosum Lour. var. xanthioides T. L. Wu et Senjen）或海南砂（Amomum longiligulare T. L. Wu）的干燥成熟果实。其性辛、温，归脾、胃、肾经，具有化湿开胃，温脾止泻，理气安胎的功效，在我国具有较长的民间药用和临床使用历史，常用于治疗湿浊中阻，脘痞不饥，脾胃虚寒，呕吐泄泻，妊娠恶阻，胎动不安等症。现代研究表明砂仁的药理作用主要有胃肠保护功能、抗炎、镇痛、止泻、降血糖等。
[0003] 砂仁既是传统中药，又是现代临床常用中药，市场需求量大。2020版《中国药典》中收载砂仁为3个基源，分别为阳春砂、绿壳砂和海南砂。通过市场调研及咨询专门从事砂仁研究的广州中医药大学张丹雁教授，目前市售砂仁几乎全为阳春砂，而绿壳砂多为进口，主要来源为老挝，量极少。海南砂在我国目前仅有中国医学科学院药用植物研究所海南分所有少量种植，产量仅供科研使用。由于阳春砂、绿壳砂品质高，价格高，导致市场上出现用劣质、非药典收载品种砂仁或者用碎的益智仁冒充阳春砂的现象。此外由于不同地区用药习惯等差异，常将姜科植物益智、草果、长序砂仁以及建砂仁等作为砂仁使用。因此造成了市售砂仁基源混乱、品种不纯、来源不明等问题。若非常年从事砂仁研究的专业人员难以将多基源或者混合的砂仁进行有效鉴别。此外在药材收集过程中发现，有的砂仁为去壳砂仁，有的为捣碎的砂仁米，而现行标准中砂仁性状描述有一定局限性，无法对种子进行有效鉴别，不同产区、不同加工方式、不同栽培品种、不同栽培方式生长的砂仁存在差异，更给鉴别带来困难。
[0004] 外观性状、显微、理化等鉴别方法多用于易混淆药材品种的鉴别，具有操作简单，经济环保的优点，但对性状较为相似的来源于同属的砂仁，尤其捣碎成砂仁米后或粉碎成颗粒、粉末甚至制成制剂时，传统鉴别方法往往无法做到有效鉴别。薄层色谱法是一种检测砂仁中有效成分的方法，不同砂仁均含有乙酸龙脑酯，因此，较难区分出是否为阳春砂或绿壳砂。DNA条形码是利用基因组中一段公认标准的DNA片段鉴定物种的新技术，鉴别方法快速、准确、鉴定结果不受植物的生长发育阶段和性状特征等因素的影响，可作为传统鉴定方法的科学佐证，但该鉴别方法在实际操作过程中专业性比较强、成本较高，在实际应用中也很难推广。现有技术中有采用气相色谱法对砂仁中单一成分（如挥发油含量或乙酸龙脑酯含量）的含量进行鉴别，或在指纹图谱相似度鉴别中以单一成分色谱峰为参照计算相似度，无法对砂仁的整体质量状态进行评价，亦无法区分不同基源的砂仁，而使用采用GC指纹图谱法鉴别不同基源的砂仁，容易受溶剂峰的干扰，使得砂仁的特征峰的相对峰面积过小，导致直接利用指纹图谱相似度鉴别难度较大，不能进行有效区分。
[0005] 2020版《中国药典》中砂仁性状描述未对阳春砂和绿壳砂进行区分，两者的挥发油含量和乙酸龙脑酯含量没有区别，且通过前期研究发现，阳春砂和绿壳砂虽然为不同基源砂仁，但相似度很高，因此可以将阳春砂和绿壳砂一起鉴别。而且阳春砂品质高且市场流通品种主要为阳春砂，因此鉴别出砂仁是否为阳春砂或绿壳砂，可有效提高砂仁使用质量，保障临床疗效。
[0006] 综上所述，研发一种能够快速有效鉴别阳春砂或绿壳砂的方法至关重要。
发明内容
[0007] 针对现有技术中存在的砂仁药材或饮片基源繁多、药用状况混乱、质量参差不齐，而传统鉴别阳春砂、绿壳砂和海南砂或混合基源砂仁的方法准确性低和成本高的问题，本发明提供了一种利用GC特征指纹图谱鉴别鉴别阳春砂或绿壳砂的方法，该方法操作简单、准确性强，能有效保证砂仁药效质量和保障患者的临床用药，为临床用药提供了指导标准。
[0008] 本发明通过以下技术方案实现：
[0009] 一种利用GC特征指纹图谱鉴别阳春砂或绿壳砂的方法，将去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后的待测砂仁GC特征指纹图谱与去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后的标准砂仁GC特征指纹图谱进行相似性分析，若相似度为0.900 1.000时，鉴定为阳春砂或绿壳~砂；
[0010] 所述的标准砂仁GC特征指纹图谱的鉴定方法为：取若干批次的阳春砂或绿壳砂标准品粉末，加乙醇溶解并超声处理，滤过，滤液注入气相色谱仪，得GC指纹图谱，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后进行分析，生成阳春砂和绿壳砂标准砂仁GC特征指纹图谱。
[0011] 进一步地，所述阳春砂或绿壳砂的鉴别方法具体包括以下步骤：
[0012] （1）标准砂仁GC特征指纹图谱建立：分别取若干批次阳春砂或绿壳砂标准品样品粉末，加乙醇溶解并超声处理，过滤，滤液作为标准品溶液，进行气相色谱分析，获得GC指纹图谱，将获得的每一批次的GC指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后进行分析，生成阳春砂和绿壳砂标准砂仁GC特征指纹图谱；
[0013] （2）待测砂仁样品指纹图谱测定：取待测砂仁样品粉末，加乙醇溶解并超声处理，过滤，滤液作为供试品溶液，进行气相色谱分析，获得待测砂仁GC指纹图谱；
[0014] （3）将步骤（2）中待测砂仁的GC指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后，与步骤（1）中的标准砂仁GC特征指纹图谱进行相似度分析，若相似度为0.900 1.000时，鉴定为阳春砂或绿壳砂。~
[0015] 进一步地，步骤（1）和步骤（2）中所述的标准样品或待测样品的取样量为0.5 2g，~标准样品或待测样品与乙醇的比例为1g:25mL，超声处理时间为20 40 min。
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[0016] 进一步地，步骤（1）中所述的阳春砂或绿壳砂标准样品的取样批次为10 20批。~
[0017] 进一步地，所述的相似性分析系统为中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版。
[0018] 进一步地，所述的气相色谱条件为：色谱柱：DB‑1毛细管柱，100%二甲基聚硅氧烷为固定相，柱长为30m，内径为0. 25mm，膜厚度为0.25µm；柱温100℃，进样口温度230℃；FID检测器温度250℃；分流比为10:1。
[0019] 有益效果
[0020] （1） 本发明采用去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰的气相色谱指纹图谱及相似度计算的数值进行有效鉴别是否为阳春砂或绿壳砂，尤其是将其粉碎成颗粒、粉末甚至制剂难以鉴别时，提供了有效鉴别阳春砂或绿壳砂的方法；
[0021] （2） 本发明方法具有操作简单、鉴定结果可靠和经济环保的优点，能有效保证砂仁药效质量和保障患者的临床用药，为临床用药提供了用药标准。
附图说明
[0022] 图1为完整的砂仁GC指纹图谱，其中S1为标准砂仁，S2‑S11为10批次阳春砂，S12‑S14为3批次绿壳砂，S15‑S16为2批次海南砂，S17‑S18为2批海南砂、小阳春砂伪品；
[0023] 图2为去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后生成的GC特征指纹图谱，其中S1为标准砂仁，S2‑S11为10批次阳春砂，S12‑S14为3批次绿壳砂；
[0024] 图3为去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后生成的GC特征指纹图谱，其中S1为标准砂仁，S15‑S16为2批次海南砂；
[0025] 图4为去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后生成的GC特征指纹图谱，其中S1为标准砂仁，S17‑S18为2批次砂仁混合品。
具体实施方式
[0026] 为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
[0027] 本发明实施例中不同批次的砂仁如表1所示：
[0028] 表1 不同批次砂仁收集情况
[0029]
[0030] 本发明实施例中的气相色谱测试条件：色谱柱：DB‑1毛细管柱（100%二甲基聚硅氧烷为固定相）（柱长为30m，内径为0. 25mm，膜厚度为0.25µm；色谱条件：柱温100℃，进样口温度230℃，检测器（FID）温度250℃；分流比为10:1；理论板数按不低于10000。
[0031] 实施例1
[0032] （1）标准砂仁GC指纹图谱的建立：分别取10批阳春砂S2 S11和3批绿壳砂S12 S14~ ~（样品产地及厂家见表1，经专家鉴定为阳春砂和绿壳砂）种子团粉末各1g，精密加无水乙醇
25ml，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为标准品溶液，分别精密吸取标准品溶液1μL注入气相色谱仪，得GC指纹图谱，将13批次砂仁的GC指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”中，生成标准砂仁GC指纹图谱S1；
25ml，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为标准品溶液，分别精密吸取标准品溶液1μL注入气相色谱仪，得GC指纹图谱，将13批次砂仁的GC指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”中，生成标准砂仁GC指纹图谱S1；
[0033] （2）分别取17批S2‑S18砂仁（样品信息见表1）种子团粉末（待测样本）各1g，精密称定，加无水乙醇25ml，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液各1μL注入气相色谱仪，得待测样本GC指纹图谱；
[0034] （3）将步骤（2）中待测砂仁GC指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”分析，与步骤（1）中的砂仁对照GC指纹图谱（S1）进行相似度分析，得到的相似度均为1.000，标准砂仁GC指纹图谱（S1）和10批次阳春砂（S2‑S11），3批次绿壳砂（S12‑S14），2批次海南砂（S15‑S16）及2批海南砂、小阳春砂伪品（S17‑S18）的GC指纹图谱如图1所示。
[0035] 实施例2
[0036] （1）标准砂仁GC特征指纹图谱的建立：分别取10批阳春砂S2‑S11和3批绿壳砂S12‑S14（样品产地及厂家见表1，经专家鉴定为阳春砂和绿壳砂）种子团粉末各1g，精密加无水乙醇25ml，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为标准品溶液，分别精密吸取标准品溶液1μL注入气相色谱仪，得GC指纹图谱，将13批次砂仁的GC指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰，生成标准砂仁GC特征指纹图谱；
[0037] （2）分别取10批阳春砂S2‑S11和3批绿壳砂S12‑S14（样品信息见表1）种子团粉末（待测样本）各1g，精密称定，加无水乙醇25ml，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液各1μL注入气相色谱仪，得待测样本GC指纹图谱；
[0038] （3）将步骤（2）中待测砂仁GC指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”分析，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰，与步骤（1）中的砂仁对照GC特征指纹图谱S1进行相似度分析，得到的相似度分别为0.996、0.992、0.969、0.999、0.998、0.999、
0.998、0.997、0.999、0.998、0.997、0.999和0.999，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后的标准砂仁GC特征指纹图谱（S1）和10批次阳春砂（S2‑S11），3批次绿壳砂（S12‑S14）的GC特征指纹图谱如图2所示。
0.998、0.997、0.999、0.998、0.997、0.999和0.999，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后的标准砂仁GC特征指纹图谱（S1）和10批次阳春砂（S2‑S11），3批次绿壳砂（S12‑S14）的GC特征指纹图谱如图2所示。
[0039] 实施例3
[0040] （1）标准砂仁GC特征指纹图谱的建立与实施例2步骤（1）相同；
[0041] （2）分别取2批海南砂S15 S16（样品信息见表1）粉末（待测样本）各1g，精密称定，~加稀乙醇25ml，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液各1μL注入气相色谱仪，得待测砂仁GC指纹图谱；
[0042] （3）将步骤（2）中待测砂仁GC指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”分析，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后，与步骤（1）中的标准砂仁GC特征指纹图谱进行相似度分析，得到的相似度分别为0.774、0.800，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后的标准砂仁GC特征指纹图谱（S1）和待测2批次海南砂（S15‑S16）的GC特征指纹图谱如图3所示。
[0043] 实施例4
[0044] （1）标准砂仁GC特征指纹图谱的建立与实施例2步骤（1）相同；
[0045] （2）分别取砂仁（市售2批次海南砂、小阳春砂混合品）粉末各1g，精密称定，加无水乙醇25ml，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液各1μL注入气相色谱仪，得待测砂仁GC指纹图谱；
[0046] （3）将步骤（2）中待测砂仁GC指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”分析，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后，与步骤（1）中的标准砂仁GC特征指纹图谱进行相似度分析，得到的相似度分别为0.759、0.694，去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后的标准砂仁GC特征指纹图谱（S1）和待测2批次海南砂、阳春砂混合品（S17‑S18）的GC特征指纹图谱如图4所示。
[0047] 以完整色谱峰标准砂仁GC指纹图谱为参照物，进行GC比对及相似度计算，各批砂仁与对照GC指纹图谱的相似度数值均为1.000，无法将阳春砂、绿壳砂和劣质、非药典收载品种砂仁及伪品区分。去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后，13批阳春砂及绿壳砂的相似度数值在0.900以上，2批海南砂的相似度数值为0.774、0.800，2批海南砂、阳春砂混合品的相似度数值为0.759、0.694，因此认为去除前5分钟以溶剂峰为主的色谱峰后可采用特征指纹图谱及相似度数值进行有效鉴别是否为阳春砂或绿壳砂，尤其是将其粉碎成颗粒、粉末甚至制剂难以鉴别时，可采用该方法进行有效鉴别。