一种软枣猕猴桃丛生芽的诱导方法

摘要

本发明公开了一种软枣猕猴桃丛生芽的诱导方法，属于猕猴桃组培快繁技术领域。该方法包括将苗龄为30‑60d的无芽茎段接入诱导培养基诱导丛生芽生长，再将丛生芽接入生根培养基诱导生根的步骤；所述诱导培养基包括：MS+ZT 2mg·L‑1；所述生根培养基包括：MS+IBA 0.4mg·L‑1。本发明以软枣猕猴桃无芽茎段为外植体，研究不同光照强度、培养温度、苗龄及植物生长调节剂对其无芽茎段愈伤组织诱导及植株再生的影响，由此建立了快速稳定有效的软枣猕猴桃快繁技术体系，能有效的运用于生产中，解决了丛生芽分化率及增殖系数低的问题，可在短期内提供大量优质种苗，为软枣猕猴桃组培苗工厂化生产提供技术支持。

权利要求

1.一种软枣猕猴桃丛生芽的诱导方法，其特征在于，包括将苗龄为30‑60d的无芽茎段接入诱导培养基诱导丛生芽生长，再将丛生芽接入生根培养基诱导生根的步骤；

‑1 ‑1 ‑1

所述诱导培养基为MS+ZT 2mg·L +蔗糖30g·L +琼脂5g·L ；所述生根培养基为MS+‑1 ‑1 ‑1IBA 0.4‑0.5mg·L +蔗糖30g·L +琼脂5g·L ；

所述诱导丛生芽生长的条件为光照强度50LX、光照时间12h/d、温度20℃和pH5.8。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导丛生芽生长的时间为55d。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导生根的条件为光照强度1500LX、光照时间12h/d、温度25±2℃和pH5.8。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苗龄为30‑60d的无芽茎段是从软枣猕猴桃茎尖诱导培养30‑60d的成苗上切取的。

说明书

一种软枣猕猴桃丛生芽的诱导方法

技术领域

[0001] 本发明涉及猕猴桃组培快繁技术领域，特别是涉及一种软枣猕猴桃丛生芽的诱导方法。

背景技术

[0002] 软枣猕猴桃(Actinidia arguta(Sieb.&Zucc)Planch.ex Miq.)，又名猕猴梨、软枣子、藤梨、藤瓜，属于猕猴桃科(Actinidiaceae)、猕猴桃属(Actinidia)大型落叶藤本植物，常用的英文名称包括Hardy Kiwifruit、Grape Kiwi及Baby Kiwifruit等。作为古老的野生树种资源，其始载于《开宝本草》，在《本草纲目》中也有整株入药的记载，具有一定的医疗保健价值。软枣猕猴桃果皮光滑无毛且可食用、果肉细腻酸甜、营养成分丰富、富含维生素C且风味独特。成株具有极强的耐寒特性，在‑38℃下可安全越冬，既可直接进行栽培，也可用作生产上的抗寒砧木，是猕猴桃品种改良的重要种质资源。软枣猕猴桃传统育苗方式主要有播种、扦插和嫁接，但这些方式易受外界因素的干扰，如定植时间、气温、病害等，因此离体快繁技术对软枣猕猴桃规模化、标准化生产具有重要意义。同时离体快繁技术亦是超低温种质保存、遗传转化、体细胞杂交等的基础。

[0003] 目前，虽然关于软枣猕猴桃离体快繁技术的研究已有较多报道，但都集中在不同基本培养基、不同植物生长调节剂及不同外植体类型等条件对其离体快繁技术的影响上。关于光照强度、培养温度、苗龄等培养条件对软枣猕猴桃离体快繁技术的影响尚未见报道。
同时关于无芽茎段丛生芽诱导上也存在分化率及增殖系数低等问题。如张远记等的研究中无芽茎段外植体容易愈伤化，但其愈伤组织难以分化，分化率仅为27.5％，产生的芽少，生长慢。李昌禹等的研究中经2,4‑D处理的无芽茎段形成愈伤组织后，转至ZT(0.5～4mg/L)的培养基中均形成高矮不等的小植株，但并未给出具体数据。朴一龙等的研究中野生软枣猕猴桃无芽茎段的芽分化率为30％。王广富等的研究中软枣猕猴桃“魁绿”无芽茎段愈伤组织诱导率为94.7％，不定芽分化率为41.3％。

[0004] 针对上述问题，本发明以软枣猕猴桃“奇异莓6号”无芽茎段为材料，研究不同光照强度、培养温度、苗龄及植物生长调节剂对其无芽茎段愈伤组织诱导及植株再生的影响，以期为软枣猕猴桃组培苗工厂化生产提供技术支持。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种软枣猕猴桃丛生芽的诱导方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法解决了丛生芽分化率及增殖系数低的问题，可在短期内提供大量优质种苗，为软枣猕猴桃组培苗工厂化生产提供技术支持。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0007] 本发明提供一种软枣猕猴桃丛生芽的诱导方法，包括将苗龄为30‑60d的无芽茎段接入诱导培养基诱导丛生芽生长，再将丛生芽接入生根培养基诱导生根的步骤；

[0008] 所述诱导培养基包括：MS+ZT 2mg·L‑1；所述生根培养基包括：MS+IBA0.4‑0.5mg·‑1L 。

[0009] 进一步地，所述诱导丛生芽生长的条件为光照强度50LX、光照时间12h/d、温度20℃和pH5.8。

[0010] 进一步地，所述诱导丛生芽生长的时间为55d。

[0011] 进一步地，所述诱导生根的条件为光照强度1500LX、光照时间12h/d、温度25±2℃和pH5.8。

[0012] 进一步地，所述MS包括蔗糖30g·L‑1和琼脂5g·L‑1。

[0013] 进一步地，所述苗龄为30‑60d的无芽茎段是从软枣猕猴桃茎尖诱导培养30‑60d的成苗上切取的。

[0014] 本发明公开了以下技术效果：

[0015] 本发明以软枣猕猴桃无芽茎段为外植体，研究不同光照强度、培养温度、苗龄及植物生长调节剂对其无芽茎段愈伤组织诱导及植株再生的影响，结果表明：选择无芽茎段苗‑1 ‑1 ‑1龄30d、诱导培养基MS+ZT 2mg·L (含蔗糖30g·L ，琼脂5g·L ，pH5.8)，在光照强度50LX(12h，另12h暗培养)、培养温度20℃下培养55d，无芽茎段愈伤组织诱导率、愈伤组织分化率及不定芽数均最佳，分别为100％、100％及18.87个/块；将诱导培养的丛生芽转入生根培养‑1 ‑1 ‑1
基MS+IBA0.4mg·L (含蔗糖30g·L ，琼脂5g·L ，pH5.8)，在光照强度1500LX(12h，另12h暗培养)、培养温度25℃条件下培养30d，每株生根苗根数达8.53个，根长1.68cm、根粗
0.14cm，达到栽培条件。由此可见，本发明建立了快速稳定有效的软枣猕猴桃快繁技术体系，能有效的运用于生产中，解决了丛生芽分化率及增殖系数低的问题，可在短期内提供大量优质种苗，为软枣猕猴桃组培苗工厂化生产提供技术支持。

附图说明

[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0017] 图1为不同诱导培养基诱导丛生芽的生长情况，其中1‑9分别为1‑9处理组；

[0018] 图2为无芽茎段培养55d的生长情况；

[0019] 图3为经生根培养30d的生根苗的生长情况。

具体实施方式

[0020] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0021] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0022] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0023] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

[0024] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0025] 1材料与方法

[0026] 1.1试验材料

[0027] 以前期试验中软枣猕猴桃“奇异莓6号”的茎尖作为外植体诱导出的无菌苗无芽茎段为试材。

[0028] 诱导方法如下：于春季切取约0.5cm软枣猕猴桃“奇异莓6号”幼嫩侧芽回实验室。在流水下冲洗30min以上，放入超级工作台中。经75％酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，转
0.1％升汞消毒10min,无菌水冲洗5～6次。在解剖镜下，将消毒后的软枣猕猴桃侧芽用注射‑1
器针尖剥去外层叶片，切取0.3～0.5mm大小的茎尖接种在MS+ZT 0.5mg·L 中培养，成苗后切取无菌苗无芽茎段为本研究的外植体。

[0029] 1.2软枣猕猴桃无芽茎段离体高效再生技术体系的建立

[0030] 基本培养基为MS固体培养基(含蔗糖30g·L‑1，琼脂5g·L‑1，pH5.8)，于121℃灭菌‑120min。组培室光照12h·d 。

[0031] 1.2.1植物生长调节剂浓度与配比对软枣猕猴桃无菌苗无芽茎段丛生芽诱导的影响试验

[0032] 将培养30d的软枣猕猴桃无菌苗无芽茎段分别培养在含有不同浓度的玉米素(简‑1 ‑1称ZT，0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3mg·L )，萘乙酸(简称NAA，0.01、0.03mg·L )的MS培养基中，每个处理10个外植体，5次重复。组培苗培养室温度为20±2℃，光照强度(50LX)。

[0033] 1.2.2光暗条件对无菌苗无芽茎段丛生芽诱导的影响试验

[0034] 将培养30d的软枣猕猴桃无菌苗无芽茎段接种在MS(添加2mg·L‑1ZT)培养基中，分‑1别进行光照12h·d (光照强度1500LX、50LX和暗培养基)处理。各处理10个外植体，5次重复。组培苗培养室温度为20±2℃。

[0035] 1.2.3培养温度对无菌苗无芽茎段丛生芽诱导的影响试验

[0036] 将软枣猕猴桃无菌苗无芽茎段接种在MS(添加2mg·L‑1ZT)培养基中，分别进行不同温度处理(15℃、20℃、25℃、28℃)。组培室光照强度(50LX)。

[0037] 1.2.4苗龄对无菌苗无芽茎段丛生芽诱导的影响试验

[0038] 将培养30d的软枣猕猴桃苗龄(30d、60d、90d)的无菌苗无芽茎段分别接种在MS(添‑1加2mg·L ZT)培养基中，每个处理10个外植体，5次重复。组培苗培养室温度为20±2℃，光照强度(50LX)。

[0039] 1.2.5生根培养

[0040] 将上述培养获得的软枣猕猴桃幼苗转入温度为25±2℃、光照强度为1500LX的组‑1培室培养30d后，切取幼苗分别接种在MS(添加0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg·L 吲哚丁酸(IBA))培养基中，每个处理8个外植体，5次重复，30d后统计生根率、根长、根数、根粗。组培苗培养室温度为25±2℃，光照强度(1500LX)。

[0041] 1.2.6数据分析与处理

[0042] 数据采用DPS7.05和Excel2010软件进行整理、统计和分析。其中愈伤组织诱导率、分化率、生根率计算公式如下：

[0043] 愈伤组织诱导率(％)＝产生愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100％

[0044] 分化率(％)＝分化的外植体数/产生愈伤组织的外植体数×100％

[0045] 生根率(％)＝生根株数/培养株数×100％

[0046] 不定芽数(个/块)＝不定芽总数/分化的外植体数

[0047] 2结果与分析

[0048] 2.1不同ZT和NAA浓度对软枣猕猴桃无菌苗无芽茎段诱导产生丛生芽的影响[0049] 对软枣猕猴桃无菌苗无芽茎段使用不同浓度ZT和NAA进行不定芽诱导，各处理的不定芽诱导情况明显不同(见图1)。无芽茎段培养40d两端开始形成淡绿色愈伤组织，培养45d愈伤组织表面出现红色小点，开始形成不定芽，培养55d统计试验结果，详见表1。由表1可知植物生长调节剂的种类及浓度对软枣猕猴桃无芽茎段丛生芽诱导存在显著影响。随着ZT浓度升高，无芽茎段愈伤组织诱导率、愈伤组织分化率及不定芽数均呈先升高后降低的‑1
趋势。当ZT浓度为2mg·L 时，无芽茎段愈伤组织诱导率、愈伤组织分化率及不定芽数均最大，分别为100％、100％及18.87个/块，显著高于其他组合。当细胞分裂素ZT浓度相同时，不添加NAA的处理不定芽数(18.87个/块)显著高于添加NAA的处理(7.87个/块、9.42个/块)，说明加入NAA并不能促进愈伤组织分化，反而抑制了不定芽的形成。

[0050] 表1 不同ZT和NAA浓度对软枣猕猴桃无菌苗无芽茎段诱导率的影响

[0051]

[0052] 2.2不同光暗条件对无菌苗无芽茎段诱导丛生芽的影响

[0053] 光培养下软枣猕猴桃无芽茎段随培养时间的增加茎段由绿色转为黑色，期间无愈伤组织产生；弱光培养下软枣猕猴桃无芽茎段40d两端开始形成淡绿色愈伤组织，愈伤组织诱导率100％，培养45d愈伤组织表面出现红色小点，开始形成不定芽，分化率100％，培养55d不定芽数为18.87个/块；暗培养下软枣猕猴桃无芽茎段50d开始形成白色愈伤组织，分化率低，仅12.33％，产生不定芽少，为0.67个/块。由表2可知，弱光培养下软枣猕猴桃无芽茎段丛生芽诱导效果最好。

[0054] 2.3培养温度对无菌苗无芽茎段诱导丛生芽的影响

[0055] 15℃培养下软枣猕猴桃无芽茎段一直保持绿色，有少量愈伤组织产生，无分化；20℃培养下软枣猕猴桃无芽茎段40d两端开始形成淡绿色愈伤组织，愈伤组织诱导率100％，培养45d愈伤组织表面出现红色小点，开始形成不定芽，分化率100％，培养55d不定芽数为18.87个/块；25℃培养下软枣猕猴桃无芽茎段27d开始形成淡绿色愈伤组织，愈伤组织诱导率92.50％，培养55d愈伤组织分化率为86.79％，不定芽数为11.63个/块；28℃培养下软枣猕猴桃无芽茎段20d开始形成淡绿色愈伤组织，愈伤组织诱导率82.50％，继续培养培养55d愈伤组织分化率为60.56％，不定芽数为5.95个/块。培养温度对软枣猕猴桃无芽茎段丛生芽诱导的影响表现为随温度的升高茎段出现愈伤的时间越早，但诱导率、分化率及不定芽数却有所下降。综合表2数据，20℃为最佳培养温度，在该培养温度下，无论是愈伤组织诱导率、分化率还是产生的不定芽数都显著高于其他温度。

[0056] 2.4苗龄对无菌苗无芽茎段诱导丛生芽的影响

[0057] 由表2可知软枣猕猴桃苗龄30d与60d的无芽茎段培养55d后，其愈伤组织诱导率、分化率及产生的不定芽数二者间并无显著差异，但显著高于苗龄90d的无芽茎段。由此可知最佳苗龄为30d到60d。

[0058] 表2 不同光暗条件、培养温度及苗龄对软枣猕猴桃无芽茎段丛生芽诱导的影响[0059]

[0060] 2.5生根培养

[0061] 由表3可知，与未加入IBA的组合相比，IBA在软枣猕猴桃无菌苗生根过程中能够促进根的生长，2～6号处理的根数、根长、根粗均优于1号处理，但2～6号处理根数与根长两个指标并无显著差异，而5～6号处理的根粗显著优于其他组合。综合考虑根数、根长及根粗三‑1个指标和节约成本原则，选择IBA0.4mg·L 为最佳生根浓度。

[0062] 表3 不同IBA浓度对软枣猕猴桃无菌苗生根的影响

[0063]

[0064] 综合上述，软枣猕猴桃丛生芽诱导的最优方案为：光照强度50LX(12h，另12h暗培‑1 ‑1养)、培养温度20℃、无芽茎段苗龄30d、诱导培养基MS+ZT2mg·L (含蔗糖30g·L ，琼脂‑1
5g·L ，pH5.8)。在该条件下培养55d，无芽茎段愈伤组织诱导率、愈伤组织分化率及不定芽数均达最佳，分别为100％、100％及18.87个/块，见图2。随后转入光照强度1500LX(12h，另
12h暗培养)、培养温度25℃的组培室培养30d，切取上述3～5cm的小苗转入MS+IBA0.4mg·‑1 ‑1 ‑1
L (含蔗糖30g·L ，琼脂5g·L ，pH5.8)进行生根培养30d可达移栽要求，此时每株根数可‑1
达8.53、根长1.68cm、根粗0.14cm，见图3。余下的愈伤组织及芽点转入MS+ZT2mg·L (含蔗‑1 ‑1
糖30g·L ，琼脂5g·L ，pH5.8)继代增殖培养。

[0065] 注：无芽茎段苗龄30d即由前期在MS+IBA0.2mg·L‑1的固体培养基上培养的软枣猕‑1猴桃苗，切取有芽茎段转入MS+ZT2mg·L 的固体培养基中培养30d的无菌苗切取而来。以上‑1 ‑1
两种培养基均含蔗糖30g·L ，琼脂5g·L ，pH5.8。

[0066] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。