N-杂尼罗红鎓盐类化合物及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202210395680.6
文献号 : CN114773361B
文献日 : 2023-04-11
发明人 : 赵晓东 , 孙敬勇 , 刘波 , 刘爱芹
申请人 : 山东第一医科大学(山东省医学科学院)
摘要 :
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一类N‑杂尼罗红鎓盐类化合物及其制备方法和应用。具有式Ⅰ所示结构。本发明提供的N‑杂尼罗红鎓盐类化合物在低浓度即可快速定位于线粒体，实时、长期的追踪活细胞中的线粒体，对线粒体的染色不受线粒体膜电位的影响。该N‑杂尼罗红鎓盐类化合物在红光LED灯照射下能够产生超氧阴离子，具有较强的杀死肿瘤细胞作用，在线粒体荧光成像和光动力治疗中具有良好的应用前景。
权利要求 :
1.通式(I)所示N‑杂尼罗红鎓盐类化合物，通式I
其中，n＝7‑13。
2.根据权利要求1所述的N‑杂尼罗红鎓盐类化合物，其结构特征在于，所述N‑杂尼罗红鎓盐类化合物结构式如下：
3.权利要求1所述的N‑杂尼罗红鎓盐类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)：将5‑二乙氨基‑2‑亚硝基苯酚盐酸盐与8‑羟基喹啉加入DMF或乙酸或甲苯中加热至90～120℃反应5～24h，得到9‑(二乙氨基)‑5H‑吡啶并[3,2‑a]吩噁嗪‑5‑酮；
步骤2)：将步骤(1)所得的9‑(二乙氨基)‑5H‑吡啶并[3,2‑a]吩噁嗪‑5‑酮与1‑碘代烷烃在乙腈中回流反应3～24h，得通式(I)所示的烷基取代N‑杂尼罗红鎓盐类化合物。
反应路线如下所示：
其中n＝7‑13。
4.权利要求1和2任一项所述的N‑杂尼罗红鎓盐类化合物在制备靶向肿瘤细胞线粒体的荧光成像剂中的应用。
5.权利要求1和2任一项所述的N‑杂尼罗红鎓盐类化合物在制备光动力治疗光敏剂中的应用。
6.权利要求1和2任一项所述的N‑杂尼罗红鎓盐类化合物在制备具有光动力肿瘤治疗作用药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌，结肠癌、食管癌或黑色素瘤。
说明书 :
N‑杂尼罗红鎓盐类化合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一类N‑杂尼罗红鎓盐类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 线粒体是大多数真核细胞的一种半自主的细胞器，执行多种细胞内功能，包含能量供应、信号转导、钙稳态(calciumhomeostasis)、细胞分化等。线粒体代谢对于肿瘤的发生和肿瘤生长至关重要，线粒体代谢的改变可以使线粒体活性氧(ROS)的产生增加并改变细胞氧化还原状态，从而改变基因表达并刺激癌细胞增殖，增加肿瘤细胞的可塑性并通过多种机制应对恶劣的环境条件。线粒体对于固有细胞凋亡的调控和多种形式的非凋亡细胞死亡(调节性坏死)过程中起着关键作用，因此靶向线粒体代谢和线粒体是一项有效的治疗策略,已有大量的实验表明,靶向线粒体可以有效提高抗肿瘤效果，并可能克服肿瘤耐药性。
[0003] 光动力治疗是一种很有前景的无创局部疗法，是适当波长光激发光敏剂通过Ⅰ型(电子转移)或Ⅱ型(能量转移)的光化学机制产生高毒性活性氧(ROS)。ROS攻击各种生物分子，包含DNA，蛋白，脂质等，导致细胞凋亡或细胞坏死进一步达到疾病的治疗。提高光敏剂的亚细胞器靶向性是提高光动力疗效的有效方法之一，由于线粒体易受过量ROS的影响，已经设计并证明了许多光敏剂通过线粒体靶向改善光动力治疗(PDT)。然而，线粒体电位随着线粒体状态变化很大，可能会对光敏剂的静电相互作用和线粒体的靶向能力产生不利影响，尤其在光敏剂作用下线粒体膜电位会降低丧失，可能导致光敏剂从线粒体泄漏出来。这限制了光敏剂在线粒体中的滞留时间并极大的影响治疗效果。因此，有必要开发线粒体靶向稳定性更高的光敏剂。
[0004] 鉴于此，本发明开发设计了具有线粒体靶向稳定性的N‑杂尼罗红鎓盐类化合物光敏剂，对线粒体的荧光标记，癌症的光动力治疗具有重大价值。
发明内容
[0005] 针对以上问题，本发明提供了一类线粒体靶向和光动力治疗的N‑杂尼罗红鎓盐类化合物及其制备方法和应用，具有靶向线粒体进行体内外荧光成像诊断、发挥光动力治疗效果的生物医药用途，特别是体内外肿瘤细胞和组织的荧光成像诊断和/或治疗。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007] 通式(I)所示N‑杂尼罗红鎓盐类化合物：
[0008]
[0009] 通式I
[0010] 其中，n＝7‑13。
[0011] 优选地，所述N‑杂尼罗红鎓盐类化合物结构式如下：
[0012]
[0013] 本申请中， 代号及其代表的化合物名称为NRNC‑8：4‑辛基‑9‑(二乙基氨基)‑5‑氧代‑5H‑吡啶并[3,2‑a]吩噁嗪‑4‑碘化鎓；
[0014] 代号及其代表的化合物名称为NRNC‑10：9‑(二乙氨基)‑4‑癸烷基‑5‑氧代‑5H‑吡啶并[3,2‑a]吩噁嗪‑4‑碘化鎓；
[0015] 代号及其代表的化合物名称为NRNC‑12、9‑(二乙氨基)‑4‑十二烷基‑5‑氧代‑5H‑吡啶并[3,2‑a]吩噁嗪‑4‑碘化鎓。
[0016] 本发明的另一个目的是提供了一种N‑杂尼罗红鎓盐类化合物的制备方法，包含：
[0017] 步骤1)：将5‑二乙氨基‑2‑亚硝基苯酚盐酸盐与8‑羟基喹啉加入DMF或乙酸或甲苯中加热至90～120℃反应5～24h，得到9‑(二乙氨基)‑5H‑吡啶并[3,2‑a]吩噁嗪‑5‑酮；
[0018] 步骤2)：将步骤(1)所得的9‑(二乙氨基)‑5H‑吡啶并[3,2‑a]吩噁嗪‑5‑酮与1‑碘代烷烃在乙腈中回流反应3～24h，得通式(I)所示的烷基取代N‑杂尼罗红鎓盐类化合物。
[0019] 反应路线如下所示：
[0020]
[0021] 本发明的再一个目的是提供上述的N‑杂尼罗红鎓盐类化合物在制备靶向肿瘤细胞线粒体的荧光成像剂中的应用，该N‑杂尼罗红鎓盐类化合物具有稳定的靶向肿瘤细胞线粒体的荧光特性，可低浓度快速实现肿瘤细胞的荧光成像。其中，肿瘤细胞为乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌，结肠癌、食管癌、黑色素瘤等。
[0022] 本发明的又一目的是提供一类N‑杂尼罗红鎓盐类化合物在制备具有光动力肿瘤治疗的药物中的应用，可实现肿瘤组织或细胞的荧光成像和/或治疗。其中，N‑杂尼罗红鎓盐类化合物经过激光或LED红光照射后可以产生超氧阴离子杀死肿瘤细胞。
[0023] 本发明的有益效果如下：
[0024] 本发明在刚性平面结构N‑杂尼罗红环上引入亲脂性阳离子，获得具有线粒体靶向的N‑杂尼罗红鎓盐类化合物，该类化合物在低浓度即可快速定位于线粒体，实时、长期的追踪活细胞中的线粒体，对线粒体的染色不受线粒体膜电位影响。该N‑杂尼罗红鎓盐类化合物在红光LED灯照射下能够产生超氧阴离子，具有较强的杀死肿瘤细胞作用，在线粒体荧光成像和光动力治疗中具有良好的应用前景。
附图说明
[0025] 图1实施例中化合物NRNC‑8、NRNC‑10、NRNC‑12的质谱图；
[0026] 图2实施例1中化合物NRNC‑8的EPR图谱；
[0027] 图3实施例中化合物NRNC‑8、NRNC‑10、NRNC‑12的活细胞线粒体共定位和固定细胞成像。
具体实施方式
[0028] 下面结合附图和具体实施方式来对本申请作进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本申请，但这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，即所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0029] 因此，以下对提供的本发明一部分实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明范围，而是仅仅是本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030] 实施例1
[0031] 4‑辛基‑9‑(二乙基氨基)‑5‑氧代‑5H‑吡啶并[3,2‑a]吩噁嗪‑4‑碘化鎓(NRNC‑8)的制备
[0032] 将5‑二乙氨基‑2‑亚硝基苯酚盐酸盐(1.62g，7mmol)溶于15mLDMF中，加入8‑羟基喹啉(1.02g，7mmol)氮气保护下于105℃反应过夜，反应毕，减压浓缩，剩余物硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得化合物9‑(二乙氨基)‑5H‑吡啶并[3,2‑a]吩噁嗪‑5‑酮0.23g，收率10.3％。表征数据如下：
[0033] 1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.97‑9.02(m，2H)，7.63(d，J＝9.2Hz，1H)，7.64((dd，J＝8.4，4.4Hz，1H)，6.71(dd，J＝9.2，2.8Hz，1H)，6.59(s，1H)，6.51(d，J＝2.8Hz，1H)，3.50(q，J＝7.2Hz，4H)，1.28(t，J＝7.2Hz，6H)。
[0034] 13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ182.1，151.8，151.7，151.4，147.0，146.7，138.1，132.3，131.4，128.5，125.4，125.2，110.2，107.0，96.3，45.2，12.6。
[0035] HR‑MS：m/z：calcd for[C19H17N3O2]：319.1321；found：320.1379[M+H]+，342.1234+ +[M+Na]，661.2576[2M+Na]。
[0036] 取化合物9‑(二乙氨基)‑5H‑吡啶并[3,2‑a]吩噁嗪‑5‑酮(64mg，0.2mmol)溶于10mL乙腈中，加入1‑碘代正辛烷(240mg,1.0mmol)回流反应24h，反应毕减压蒸出溶剂，剩余物过碱性氧化铝柱(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝25/1)，得产物4‑辛基‑9‑(二乙基氨基)‑5‑氧代‑5H‑吡啶并[3,2‑a]吩噁嗪‑4‑碘化鎓(NRNC‑8)46mg，收率41.1％。表征数据如下：
[0037] 1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ10.16(dd，J＝5.6，1.2Hz，1H)，9.78(dd，J＝8.8，0.8Hz，1H)，8.55(dd，J＝8.4，6.0Hz，1H)，7.76(d，J＝9.2Hz，1H)，6.96(dd，J＝9.2，2.8Hz，1H)，
6.66(s，1H)，6.62(d，J＝2.8Hz，1H)，5.55(t，J＝7.6Hz，2H)，3.62(q，J＝7.2Hz，4H)，2.04(m，2H)，1.53(m，2H)，1.23‑1.40(m，14H)，0.87(t，J＝6.8Hz，3H)。
6.66(s，1H)，6.62(d，J＝2.8Hz，1H)，5.55(t，J＝7.6Hz，2H)，3.62(q，J＝7.2Hz，4H)，2.04(m，2H)，1.53(m，2H)，1.23‑1.40(m，14H)，0.87(t，J＝6.8Hz，3H)。
[0038] 13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ174.5，154.1，151.3，151.0，148.1，141.5，135.9，133.5，133.1，131.2，128.2，128.0，113.3，108.6，96.2，62.1，46.1，32.9，31.7，29.1，26.4，
22.6，14.1，12.7。
22.6，14.1，12.7。
[0039] HR‑MS：m/z[M‑I]+：calcd for[C27H34N3O2+]：432.2646；found：432.2644。
[0040] 实施例2
[0041] 9‑(二乙氨基)‑4‑癸烷基‑5‑氧代‑5H‑吡啶并[3,2‑a]吩噁嗪‑4‑碘化鎓(NRNC‑10)的制备
[0042] 参照实施例1的制备方法，将1‑碘代正辛烷替换为1‑碘代正癸烷，最后得到化合物NRNC‑10，表征数据如下：
[0043] HR‑MS：m/z[M‑I]+：calcd for[C29H38N3O2+]：460.2959；found：460.2959。
[0044] 实施例3
[0045] 9‑(二乙氨基)‑4‑十二烷基‑5‑氧代‑5H‑吡啶并[3,2‑a]吩噁嗪‑4‑碘化鎓(NRNC‑12)的制备
[0046] 参照实施例1的制备方法，将1‑碘代正辛烷替换为1‑碘代正十二烷，最后得到化合物NRNC‑12，表征数据如下：
[0047] HR‑MS：m/z[M‑I]+：calcdfor[C31H42N3O2+]：488.3272；found：488.3271。
[0048] 实施例4：实施例1中制备的化合物NRNC‑8电子顺磁共振(EPR)分析检测O2·‑的生成
[0049] 以实施例1制备的NRNC‑8为例使用5,5‑二甲基‑1‑吡咯啉N‑氧化物(DMPO)作为自‑3旋捕集剂在BrukerA300 EPR光谱仪测试。将NRNC‑8溶解在100μLDMSO中，浓度为2×10 M，然
2
后在上述NRNC‑8溶液中加入5μLDMPO，红色LED灯照射2分钟(50mW/cm)。最后，在室温下记录EPR信号。如图2所示，纯DMPO溶液用红色LED照射无EPR信号，DMPO+NRNC‑8在黑暗中EPR信号较弱，与先前报道(Biochemistry,2003,42,11924‑11931.)的结果一致，DMPO+NRNC‑8用红色LED照射2分钟后，观察到明显增强的强特征顺磁性加合物，与O2·‑信号很好地保持一致，说明NRNC‑8在光照下能高效产生超氧阴离子。
2
后在上述NRNC‑8溶液中加入5μLDMPO，红色LED灯照射2分钟(50mW/cm)。最后，在室温下记录EPR信号。如图2所示，纯DMPO溶液用红色LED照射无EPR信号，DMPO+NRNC‑8在黑暗中EPR信号较弱，与先前报道(Biochemistry,2003,42,11924‑11931.)的结果一致，DMPO+NRNC‑8用红色LED照射2分钟后，观察到明显增强的强特征顺磁性加合物，与O2·‑信号很好地保持一致，说明NRNC‑8在光照下能高效产生超氧阴离子。
[0050] 实施例5：实施例中N‑杂尼罗红鎓盐类化合物的肿瘤线粒体定位
[0051] 接种于共聚焦玻底皿中长势良好的MCF‑7细胞用线粒体商业染料罗丹明123(Rh123)(1μM，200μL)孵育20分钟，然后分别用实施例制备得到的化合物NRNC‑8、NRNC‑10、NRNC‑12(100nM，200μL)染色20分钟，然后DPBS洗涤三次，激光共聚焦成像(绿色通道：488nm激发，500‑550nm收集；红色通道：640nm激发，665‑705nm收集)来观察实施例中所得化合物红色荧光信号与罗丹明123的荧光信号的重叠情况，结果表明，NRNC‑8、NRNC‑10、NRNC‑12在体外培养条件下可被肿瘤细胞高效快速摄取，显示强的红色荧光信号，与来自于线粒体的绿色荧光信号能够很好的重合，证明化合物进入细胞后，主要分布于细胞线粒体，化合物NRNC‑8、NRNC‑10、NRNC‑12与罗丹明123的共定位系数都大于0.8，结果见附图3和表1。所得结果表明本发明的N‑杂尼罗红鎓盐类化合物能够在低浓度(100nM)和短时间快速靶向肿瘤细胞线粒体，且靶向效果显著，为线粒体荧光标记示踪和医学诊断提供了一种可行的方法。
[0052] 表1实施例中N‑杂尼罗红鎓盐类化合物与Rh123的共定位系数表
[0053] 序号 光敏剂 商业线粒体染料 共定位系数(Pr)实施例1 NRNC‑8 Rh123 0.91
实施例2 NRNC‑10 Rh123 0.92
实施例3 NRNC‑12 Rh123 0.84
实施例2 NRNC‑10 Rh123 0.92
实施例3 NRNC‑12 Rh123 0.84
[0054] 线粒体膜电位(MMP)是线粒体功能的主要指标，线粒体膜电位消失会引起细胞功能障碍甚至死亡，在光动力治疗过程中线粒体膜电位的降低消失会使光敏剂从线粒体逸出，降低治疗效果。本发明进一步测试了实施例中化合物NRNC‑8、NRNC‑10、NRNC‑12在线粒体膜电位消失时对线粒体的靶向性。当细胞被固定时，MMP消失。我们进一步研究了NRNC‑8、NRNC‑10、NRNC‑12在固定细胞中的染色能力，以验证在MMP消失后它们是否能在线粒体中固定。活的MCF‑7细胞先用Rh123(1μM,200μL)孵育20分钟，然后分别用实施例制备得到的化合物NRNC‑8、NRNC‑10、NRNC‑12(100nM，200μL)染色20分钟，最后用4％甲醛固定液固定20分钟，激光共聚焦成像(绿色通道：488nm激发，500‑550nm收集；红色通道：640nm激发，665‑705nm收集)来观察，如图3所示，固定后Rh123的荧光几乎看不到，而NRNC‑8、NRNC‑10、NRNC‑
12的红色荧光仍明显大量保留，这表明NRNC‑8、NRNC‑10、NRNC‑12在MMP消失时，仍可以固定在线粒体中，具有良好的线粒体靶向稳定性，这可以有效降低光动力治疗中光敏剂从线粒体的逸出，提高光动力治疗效果。
12的红色荧光仍明显大量保留，这表明NRNC‑8、NRNC‑10、NRNC‑12在MMP消失时，仍可以固定在线粒体中，具有良好的线粒体靶向稳定性，这可以有效降低光动力治疗中光敏剂从线粒体的逸出，提高光动力治疗效果。
[0055] 实施例6：实施例中化合物对肿瘤细胞暗毒性和光毒性试验
[0056] 将MCF‑7细胞以每孔约1×105数量接种于96孔板中孵育过夜。去除培养基后，向孔中加入100μL不同浓度(0‑5μM)的NRNC‑8、NRNC‑12的DPBS溶液，细胞继续在37℃孵育1h，然2
后将细胞在红色LED灯(50mW/cm)下照射0分钟或10分钟，然后换成DMEM培养基，37℃孵育
24小时，每孔加入CCK‑8(10μL，5mg/mL)并在CO2培养箱中再培养2小时。然后在酶标仪上测量450nm处的吸光度。他们的CCK‑8检测结果分别如表2所示。结果表明，NRNC‑8、NRNC‑10、NRNC‑12线粒体靶向的光敏剂暗毒性较低，具有强的光毒性，可以用于光动力抗肿瘤治疗。
后将细胞在红色LED灯(50mW/cm)下照射0分钟或10分钟，然后换成DMEM培养基，37℃孵育
24小时，每孔加入CCK‑8(10μL，5mg/mL)并在CO2培养箱中再培养2小时。然后在酶标仪上测量450nm处的吸光度。他们的CCK‑8检测结果分别如表2所示。结果表明，NRNC‑8、NRNC‑10、NRNC‑12线粒体靶向的光敏剂暗毒性较低，具有强的光毒性，可以用于光动力抗肿瘤治疗。
[0057] 表2实施例1‑3制得的光敏剂的光动力效果评价表
[0058]
[0059] L(‑)表示没有光照；L(+)表示红光LED灯照射。