从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法

摘要

本发明涉及肌红蛋白天然提取领域，具体公开了一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法。从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法包括以下步骤：步骤1，取马心破碎处理，加入肌红蛋白提取液，匀浆，静置提取2‑2.5h，离心，取滤液，得到粗提取物；步骤2，向粗提取物中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节粗提取物的pH为7.60，再加入硫酸铵粉末盐析，静置2‑3h，离心，取固体沉淀，得到肌红蛋白沉淀物；步骤3，向肌红蛋白沉淀物中加入浓度为10mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液溶解，再将溶解得到的溶液经凝胶过滤层析柱洗脱后，得到肌红蛋白。本发明的提取与纯化方法具有使得肌红蛋白在提取过程中不容易被氧化，有利于提高提取率的优点。

权利要求

1.一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，取马心破碎处理，加入肌红蛋白提取液，匀浆，静置提取2‑2.5h，离心，取滤液，得到粗提取物；

所述肌红蛋白提取液含有浓度为10mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液、浓度为0.22mmol/L的向日葵籽油、浓度为0.23mmol/L的油橄榄果油、浓度为0.5mmol/L的聚山梨酯‑80、浓度为

1mmol/L的葡萄糖；

所述肌红蛋白提取液的制备方法如下：先按上述浓度比例混合向日葵籽油、油橄榄果油、聚山梨酯‑80以及葡萄糖，升高温度至60‑65℃，以1000‑1200r/min的转速搅拌5‑10min，形成均匀的混合液，再将混合液置于冰水中，在30s内降低温度至室温，最后加入Tris‑HCl缓冲溶液，混合均匀；

所述步骤1中，先降低肌红蛋白提取液的温度至1‑3℃，再加入至马心中；

步骤2，向粗提取物中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节粗提取物的pH为7.60，再加入硫酸铵粉末盐析，静置2‑3h，离心，取固体沉淀，得到肌红蛋白沉淀物；

步骤3，向肌红蛋白沉淀物中加入浓度为10mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液溶解，再将溶解得到的溶液经凝胶过滤层析柱洗脱后，得到肌红蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征在于：所述步骤1中，马心的质量与肌红蛋白提取液的体积的比例为4:1。

3.根据权利要求1‑2任一所述的一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征在于：所述步骤1中的肌红蛋白提取液的pH为8.0‑8.5。

4.根据权利要求1‑2任一所述的一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征在于：所述步骤2中，加入硫酸铵粉末至硫酸铵的饱和度为80‑83%。

5.根据权利要求1‑2任一所述的一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征在于：所述步骤3中，用于溶解肌红蛋白沉淀物的Tris‑HCl缓冲溶液的体积为肌红蛋白沉淀物质量的3倍。

6.根据权利要求1‑2任一所述的一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征在于：所述步骤3中的凝胶过滤层析柱的平衡缓冲液含有浓度为5mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液以及浓度为1mmol/L的EDTA溶液。

7.根据权利要求6所述的一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征在于：所述凝胶过滤层析柱的平衡缓冲液的pH值为8.5。

8.根据权利要求7所述的一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征在于：所述步骤3中的凝胶过滤层析柱的洗脱液含有浓度为0.5mol/L的氯化钾溶液、浓度为

5mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液以及浓度为1mmol/L的EDTA溶液。

9.根据权利要求8所述的一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征在于：所述步骤3中的凝胶过滤层析柱的洗脱液的pH值为8.5。

说明书

从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及肌红蛋白天然提取领域，尤其是涉及一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法。

背景技术

[0002] 肌红蛋白是肌肉呈色的主要蛋白，是一种结合蛋白。一分子肌红蛋白由一分子珠蛋白和一分子辅基亚铁血红素结合而成。

[0003] 在有生命活动的组织内，呈还原态的暗紫红色的肌红蛋白与呈充氧态的鲜红色氧合肌红蛋白处于平衡状态。鲜肉的鲜红色是氧合肌红蛋白存在的表现，若再进一步氧化成高铁肌红蛋白，肉色则呈现不良的棕红色，这也是经过贮存后肉类外表面常见的典型肉色。因此，为了保证鲜肉的销售质量，使得肉色呈现鲜红色，对于肌红蛋白的稳定性的研究就很重要。

[0004] 目前对于肌红蛋白的稳定性的研究一般都是通过先将肌红蛋白从体内提取出来，然后通过体外实验进行肌红蛋白的稳定性的研究。

[0005] 而马心中含有丰富的肌红蛋白，但目前却未见有与马心的肌红蛋白的提取的相关研究。

发明内容

[0006] 为了从马心中提取得到肌红蛋白，本申请提供一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法。

[0007] 本申请提供的一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法，采用如下的技术方案：

[0008] 一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法，包括以下步骤：

[0009] 步骤1，取马心破碎处理，加入肌红蛋白提取液，匀浆，静置提取2‑2.5h，离心，取滤液，得到粗提取物；所述肌红蛋白提取液含有浓度为10mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液、浓度为0.22mmol/L的向日葵籽油、浓度为0.23mmol/L的油橄榄果油、浓度为0.5mmol/L的聚山梨酯‑80、浓度为1mmol/L的葡萄糖；所述肌红蛋白提取液的制备方法如下：先按上述浓度比例混合向日葵籽油、油橄榄果油、聚山梨酯‑80以及葡萄糖，升高温度至60‑65℃，以1000‑
1200r/min的转速搅拌5‑10min，形成均匀的混合液，再将混合液置于冰水中，在30s内降低温度至室温，最后加入Tris‑HCl缓冲溶液，混合均匀；

[0010] 步骤2，向粗提取物中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节粗提取物的pH为7.60，再加入硫酸铵粉末盐析，静置2‑3h，离心，取固体沉淀，得到肌红蛋白沉淀物；

[0011] 步骤3，向肌红蛋白沉淀物中加入浓度为10mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液溶解，再将溶解得到的溶液经凝胶过滤层析柱洗脱后，得到肌红蛋白。

[0012] 通过采用特定浓度的向日葵籽油、油橄榄果油、聚山梨酯‑80、葡萄糖以及Tris‑HCl缓冲溶液协同作为肌红蛋白提取液，向日葵籽油以及油橄榄果油既有利于在提取出来的肌红蛋白表面形成一层保护膜，又有利于在肌红蛋白在提取过程中阻隔空气中的空气，形成液封，从而有利于减少空气中的氧气对肌红蛋白的影响，使得肌红蛋白在提取过程中更加不容易被氧化成氧合肌红蛋白或者进一步被氧化成高铁肌红蛋白，有利于更好地提高肌红蛋白的提取率；同时，向日葵籽油以及油橄榄果油混合后对肌红蛋白具有更强的依附性，有利于更好地保护肌红蛋白在后续提取过程中更加不容易被氧化；聚山梨酯‑80以及葡萄糖协同复配还有利于更好地提高向日葵籽油以及油橄榄果油的与Tris‑HCl缓冲溶液的相容性，使得肌红蛋白提取液的稳定性更高，从而有利于肌红蛋白更好地发挥提取作用，进而使得肌红蛋白的提取率更高；同时，配合先将向日葵籽油、油橄榄果油、聚山梨酯‑80以及葡萄糖混合均匀，再通过升高温度、高速搅拌以及急速降温的工艺，有利于各组分更好地混合均匀并更好地相容，形成更加稳定的体系，从而有利于更好地保护肌红蛋白在提取过程中不被氧化，使得肌红蛋白的提取率提高。

[0013] 另外，协同盐析以及凝胶过滤层析柱进一步纯化，有利于更好地提高提取所得的肌红蛋白的纯度，还不容易对肌红蛋白的结构造成破坏。

[0014] 优选的，所述步骤1中，先降低肌红蛋白提取液的温度至1‑3℃，再加入至马心中。

[0015] 通过先降低肌红蛋白提取液的温度，再加入至马心中，有利于降低肌红蛋白的提取温度，从而有利于更好地抑制肌红蛋白的氧化，使得肌红蛋白的提取率更高。

[0016] 优选的，所述步骤1中，马心的质量与肌红蛋白提取液的体积的比例为4:1。

[0017] 通过控制马心的质量与肌红蛋白提取液的体积的比例，有利于更好地提高肌红蛋白提取的效率以及性价比，既可更大限度地实现肌红蛋白的提取，又不容易对后续的肌红蛋白进一步提纯造成麻烦。

[0018] 优选的，所述步骤1中的肌红蛋白提取液的pH为8.0‑8.5。

[0019] 通过控制肌红蛋白提取液的pH值，有利于马心中的肌红蛋白更好地被提取出来，使得肌红蛋白的提取率更高。

[0020] 优选的，所述步骤2中，加入硫酸铵粉末至硫酸铵的饱和度为80‑83%。

[0021] 通过控制硫酸铵的饱和度，有利于更好地提纯肌红蛋白，使得肌红蛋白的提取率以及纯度提高。

[0022] 优选的，所述步骤3中，用于溶解肌红蛋白沉淀物的Tris‑HCl缓冲溶液的体积为肌红蛋白沉淀物质量的3倍。

[0023] 通过控制肌红蛋白沉淀物的质量与Tris‑HCl缓冲溶液的体积的比例，有利于肌红蛋白在保证更好地完全溶解的前提下，使得肌红蛋白沉淀物与Tris‑HCl缓冲溶液溶解形成的溶液在后续过凝胶过滤层析柱洗脱时，肌红蛋白更容易被洗脱出来，有利于提高肌红蛋白的提取效率以及提取纯度。

[0024] 优选的，所述步骤3中的凝胶过滤层析柱的平衡缓冲液含有浓度为5mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液以及浓度为1mmol/L的EDTA溶液。

[0025] 优选的，所述凝胶过滤层析柱的平衡缓冲液的pH值为8.5。

[0026] 通过采用特定浓度的溶液混合形成凝胶过滤层析柱的平衡缓冲液，并控制平衡缓冲液的pH值，使得肌红蛋白沉淀物与Tris‑HCl溶液溶解形成的溶液在后续过凝胶过滤层析柱洗脱时，肌红蛋白更容易被吸附于凝胶过滤层析柱上，从而有利于更好地提高肌红蛋白的提取率。

[0027] 优选的，所述步骤3中的凝胶过滤层析柱的洗脱液含有浓度为0.5mol/L的氯化钾溶液、浓度为5mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液以及浓度为1mmol/L的EDTA溶液。

[0028] 优选的，所述步骤3中的凝胶过滤层析柱的洗脱液的pH值为8.5。

[0029] 通过采用特定浓度的溶液混合形成凝胶过滤层析柱的洗脱液，并控制洗脱液的pH值，利用特定的洗脱液与Tris‑HCl缓冲溶液以及特定的平衡缓冲液配合，使得被吸附于凝胶过滤层析柱上的肌红蛋白更容易被洗脱出来，从而有利于更好地提高肌红蛋白的提取率。

[0030] 综上所述，本申请具有以下有益效果：

[0031] 1、通过采用特定浓度的向日葵籽油、油橄榄果油、聚山梨酯‑80、葡萄糖以及Tris‑HCl缓冲溶液协同作为肌红蛋白提取液，使得肌红蛋白在提取过程中更加不容易被氧化成氧合肌红蛋白或者进一步被氧化成高铁肌红蛋白，有利于更好地提高肌红蛋白的提取率。

[0032] 2、向日葵籽油以及油橄榄果油混合后对肌红蛋白具有更强的依附性，有利于更好地保护肌红蛋白在后续提取过程中更加不容易被氧化。

[0033] 3、聚山梨酯‑80以及葡萄糖协同复配还有利于更好地提高向日葵籽油以及油橄榄果油的与Tris‑HCl缓冲溶液的相容性，使得肌红蛋白提取液的稳定性更高，进而使得肌红蛋白的提取率更高；

[0034] 4、葡萄糖还在一定程度上有利于更好地提高肌红蛋白的稳定性，使得肌红蛋白在提取过程中更加不容易被氧化。

[0035] 5、先将向日葵籽油、油橄榄果油、聚山梨酯‑80以及葡萄糖混合均匀，再通过升高温度、高速搅拌以及急速降温的工艺，有利于各组分更好地混合均匀并更好地相容，形成更加稳定的体系，从而有利于更好地提高肌红蛋白的提取率。

具体实施方式

[0036] 以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。

[0037] 实施例1

[0038] 本申请实施例公开一种从马心中提取肌红蛋白的提取与纯化方法，包括以下步骤：

[0039] 步骤1，取马心加入至破碎机中搅碎，并取100g搅碎的马心加入300mL肌红蛋白提取液，然后在转速为10000r/min的转速下进行匀浆处理，静置提取2.5h，随后再在10000r/min的转速下进行离心，过滤，取滤液，得到粗提取物。

[0040] 其中，肌红蛋白提取液含有浓度为10mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液、浓度为0.22mmol/L的向日葵籽油、浓度为0.23mmol/L的油橄榄果油、浓度为0.5mmol/L的聚山梨酯‑80、浓度为1mmol/L的葡萄糖。

[0041] 肌红蛋白提取液的制备方法如下：先按上述浓度比例混合向日葵籽油、油橄榄果油、聚山梨酯‑80以及葡萄糖，升高温度至60℃，以1000r/min的转速搅拌10min，形成均匀的混合液，再将混合液置于冰水中，在30s内降低温度至室温，最后加入Tris‑HCl缓冲溶液，搅拌均匀，并调节肌红蛋白提取液的pH值为8.0。

[0042] 步骤2，向粗提取物中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节粗提取物的pH为7.60，再加入硫酸铵粉末，直至硫酸铵的饱和度为80%，静置盐析3h，随后在10000r/min的转速下进行离心，取固体沉淀，得到肌红蛋白沉淀物。

[0043] 步骤3，向肌红蛋白沉淀物中加入浓度为10mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液溶解，且Tris‑HCl缓冲溶液的添加体积为肌红蛋白沉淀物的质量的2倍，搅拌均匀，使得肌红蛋白沉淀物完全溶解，形成肌红蛋白溶液。

[0044] 先利用pH值为8.5的平衡缓冲溶液先平衡凝胶过滤层析柱，其中，本实施例中的凝胶过滤层析柱为Sephadex G‑75层析柱，再利用pH值为8.5的洗脱液将步骤3得到的肌红蛋白溶液从凝胶过滤层析柱上洗脱出来，合并洗脱液，即得肌红蛋白。

[0045] 其中，平衡缓冲液含有浓度为5mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液以及浓度为1mmol/L的EDTA溶液。

[0046] 洗脱液含有浓度为0.5mol/L的氯化钾溶液、浓度为5mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液以及浓度为1mmol/L的EDTA溶液。

[0047] 在本实施例中，肌红蛋白提取液形成均匀的混合液，不出现分层情况。从马心中得到的肌红蛋白的含量为1.78mg/mL；高铁肌红蛋白的含量为0.22mg/mL。

[0048] 实施例2

[0049] 与实施例1的区别在于：

[0050] 步骤1中，取100g搅碎的马心加入500mL肌红蛋白提取液，并控制静置提取时间为2h。

[0051] 肌红蛋白的制备方法中，混合向日葵籽油、油橄榄果油、聚山梨酯‑80以及葡萄糖，升高温度至65℃，并以1200r/min的转速搅拌5min。最后调节肌红蛋白提取液的pH值为8.5。

[0052] 步骤2中，加入硫酸铵粉末至硫酸铵的饱和度为83%，并静置盐析2h。

[0053] 步骤3中，Tris‑HCl缓冲溶液的添加体积为肌红蛋白沉淀物的质量的4倍。

[0054] 在本实施例中，肌红蛋白提取液形成均匀的混合液，不出现分层情况。从马心中得到的肌红蛋白的含量为1.86mg/mL；高铁肌红蛋白的含量为0.19mg/mL。

[0055] 实施例3

[0056] 与实施例1的区别在于：

[0057] 步骤1中，取100g搅碎的马心加入400mL肌红蛋白提取液，并控制静置提取时间为2.5h。

[0058] 肌红蛋白的制备方法中，混合向日葵籽油、油橄榄果油、聚山梨酯‑80以及葡萄糖，升高温度至63℃，并以1100r/min的转速搅拌8min。最后调节肌红蛋白提取液的pH值为8.0。

[0059] 步骤2中，加入硫酸铵粉末至硫酸铵的饱和度为81%，并静置盐析2.5h。

[0060] 步骤3中，Tris‑HCl缓冲溶液的添加体积为肌红蛋白沉淀物的质量的3倍。

[0061] 在本实施例中，肌红蛋白提取液形成均匀的混合液，不出现分层情况。从马心中得到的肌红蛋白的含量为1.95mg/mL；高铁肌红蛋白的含量为0.15mg/mL。

[0062] 实施例4

[0063] 与实施例3的区别在于：步骤1中，先把肌红蛋白提取液降低温度至1℃，再添加至马心中。

[0064] 在本实施例中，肌红蛋白提取液形成均匀的混合液，不出现分层情况。从马心中得到的肌红蛋白的含量为2.08mg/mL；高铁肌红蛋白的含量为0.08mg/mL。

[0065] 实施例5

[0066] 与实施例3的区别在于：步骤1中，先把肌红蛋白提取液降低温度至3℃，再添加至马心中。

[0067] 在本实施例中，肌红蛋白提取液形成均匀的混合液，不出现分层情况。从马心中得到的肌红蛋白的含量为2.05mg/mL；高铁肌红蛋白的含量为0.10mg/mL。

[0068] 对比例1

[0069] 与实施例3的区别在于：肌红蛋白提取液为浓度为10mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液。

[0070] 在本实施例中，从马心中得到的肌红蛋白的含量为1.35mg/mL；高铁肌红蛋白的含量为0.65mg/mL。

[0071] 对比例2

[0072] 与实施例3的区别在于：肌红蛋白提取液包含浓度为10mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液、浓度为0.22mmol/L的向日葵籽油以及浓度为0.23mmol/L的油橄榄果油。

[0073] 在本实施例中，肌红蛋白提取液明显分层。从马心中得到的肌红蛋白的含量为1.48mg/mL；高铁肌红蛋白的含量为0.54mg/mL。

[0074] 对比例3

[0075] 与实施例3的区别在于：肌红蛋白提取液包含浓度为10mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液、浓度为0.22mmol/L的向日葵籽油、浓度为0.23mmol/L的油橄榄果油以及浓度为0.5mmol/L的聚山梨酯‑80。

[0076] 在本实施例中，肌红蛋白提取液的分层界面模糊，但能看得出分层。从马心中得到的肌红蛋白的含量为1.55mg/mL；高铁肌红蛋白的含量为0.46mg/mL。

[0077] 对比例4

[0078] 与实施例3的区别在于：肌红蛋白提取液包含浓度为10mmol/L的Tris‑HCl缓冲溶液、浓度为0.22mmol/L的向日葵籽油以及浓度为0.23mmol/L的油橄榄果油以及浓度为1mmol/L的葡萄糖。

[0079] 在本实施例中，肌红蛋白提取液明显分层。从马心中得到的肌红蛋白的含量为1.52mg/mL；高铁肌红蛋白的含量为0.48mg/mL。

[0080] 对比例5

[0081] 与实施例3的区别在于：肌红蛋白提取的制备由各组分在常温下直接搅拌混合即得。

[0082] 在本实施例中，肌红蛋白提取液明显分层。从马心中得到的肌红蛋白的含量为1.63mg/mL；高铁肌红蛋白的含量为0.39mg/mL。

[0083] 本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。