棘孢木霉10564菌株及在番茄枯萎病生防中的应用

摘要

本发明提供了棘孢木霉10564菌株及在番茄枯萎病生防中的应用，具体涉及植物病害生物防治技术领域。本发明所述生防作用的棘孢木霉10564菌株，表现出棘孢木霉10564菌株对尖孢镰刀菌的抑制作用；经过10564菌株与尖孢镰刀菌混合孢子液处理的番茄幼苗表现出对尖孢镰刀菌较显著地抗病效果，同时测量叶片中叶绿素荧光相关参数以及激素含量发现，10564菌株能够保护番茄幼苗中光合系统II并可以诱导植株激素含量变化，以提高抗病性，可应用制备相应的生防菌剂。

权利要求

1.一种保护番茄幼苗光合系统II并提高抗性相关激素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：在番茄幼苗移栽后，利用棘孢木霉(Trichoderma asperellum)564菌株的分生孢子悬浮液进行灌根；

棘孢木霉564菌株的分生孢子悬浮液的制备方法，包括以下步骤：将棘孢木霉564菌株接种在PDA平板上培养，得到单菌落；所述棘孢木霉564菌株的保藏编号为CGMCCNo.40090；

挑取所述单菌落边缘的菌丝块接种至PDB培养液中培养3～7d，得到培养物；

将所述培养物离心，对离心上清液进行过滤，收集滤液得所述分生孢子悬浮液。

说明书

棘孢木霉10564菌株及在番茄枯萎病生防中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及棘孢木霉10564菌株及在番茄枯萎病生防中的应用。

背景技术

[0002] 木霉菌(Trichoderma spp.)属于半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科。木霉菌能够诱导植物系统抗性、对病原菌有竞争作用、抗性作用和重寄生作用，是一类具有巨大生防潜力的真菌。

[0003] 目前对于木霉菌的研究主要集中在哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、深绿木霉(Trichoderma atroviride)、绿色木霉(Trichoderma virens)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和长枝木霉(Trichoderma longbrachiatum)，对于棘孢木霉菌种的研究略少，已知中国专利CN107142213A中公开了棘孢木霉(Trichoderma asperellum)木‑8菌株具有明显的促生作用，但是对于番茄枯萎病上的研究较少。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供棘孢木霉10564菌株及在番茄枯萎病生防中的应用，所述棘孢木霉10564菌株对尖孢镰刀菌具有抑制作用，可保护番茄幼苗中光合系统II并可以诱导植株激素含量变化，以提高抗病性。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种具有生防作用的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)10564菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.40090。

[0007] 优选的，所述生防作用包括抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。

[0008] 本发明还提供了上述10564菌株在制备生防菌剂中的应用。

[0009] 优选的，所述生防菌剂的类型包括分生孢子洗脱液和分生孢子悬浮液。

[0010] 本发明提供了一种棘孢木霉10564菌株的分生孢子洗脱液的制备方法，包括以下步骤：将棘孢木霉10564菌株接种在PDA平板于25℃、光照条件下培养3d，得到单菌落；

[0011] 挑取所述单菌落的边缘菌丝接种到PDA平板培养7d，添加无菌水后刮洗菌落表面的分生孢子，得所述分生孢子洗脱液。

[0012] 本发明还提供了一种棘孢木霉10564菌株的分生孢子悬浮液的制备方法，包括以下步骤：将棘孢木霉10564菌株接种在PDA平板上培养，得到单菌落；

[0013] 挑取所述单菌落边缘的菌丝块接种至PDB培养液中培养3～7d，得到培养物；

[0014] 将所述培养物离心，对离心上清液进行过滤，收集滤液得所述分生孢子悬浮液。

[0015] 本发明还提供了上述10564菌株或利用上述制备方法得到的分生孢子洗脱液或利用上所述制备方法得到的分生孢子悬浮液在防治番茄枯萎病中的应用。

[0016] 优选的，包括在番茄幼苗移栽前利用所述分生孢子洗脱液进行蘸根；

[0017] 和/或在番茄幼苗移栽后，利用所述分生孢子悬浮液进行灌根。

[0018] 本发明还提供了一种防治番茄叶片枯萎病的方法，包括以下步骤：在番茄幼苗移栽前，利用上述制备方法得到的分生孢子洗脱液对幼苗根系进行蘸根。

[0019] 本发明还提供了一种保护番茄幼苗光合系统II并提高抗性相关激素含量的方法，包括以下步骤：在番茄幼苗移栽后，利用上所述制备方法得到的分生孢子悬浮液进行灌根。

[0020] 有益效果：本发明提供了一种具有生防作用的棘孢木霉10564菌株，利用所述棘孢木霉10564菌株与尖孢镰刀菌进行平板对峙实验，表现出棘孢木霉10564菌株对尖孢镰刀菌的抑制作用；经过10564菌株与尖孢镰刀菌混合孢子液处理的番茄幼苗表现出对尖孢镰刀菌较显著地抗病效果，同时测量叶片中叶绿素荧光相关参数以及激素含量发现，10564菌株能够保护番茄幼苗中光合系统II并可以诱导植株激素含量变化，以提高抗病性。

[0021] 生物保藏信息

[0022] 棘孢木霉(Trichoderma asperellum)10564已保存至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2022年03月04日，保藏编号CGMCCNo.40090。

附图说明

[0023] 图1为棘孢木霉10564菌株与尖孢镰刀菌在PDA培养基上共同培养7天对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制作用；

[0024] 图2为棘孢木霉10564菌株孢子洗脱液对番茄幼苗浸根后，植株表型，图中control表示清水处理，F.oxy表示尖孢镰刀菌处理，564&F.oxy表示尖孢镰刀菌和10564混合处理，564表示利用菌株10564处理，下同；

[0025] 图3为棘孢木霉10564菌株孢子洗脱液对番茄幼苗浸根后，植株病情指数；

[0026] 图4为棘孢木霉10564菌株孢子洗脱液对番茄幼苗浸根后，植株发病率；

[0027] 图5为棘孢木霉10564菌株孢子悬浮液对番茄幼苗浸根后，番茄叶片中叶绿素荧光相关参数发生变化，使番茄抗逆性增强；

[0028] 图6为棘孢木霉10564菌株孢子悬浮液对番茄幼苗灌根后，番茄植株内茉莉酸含量变化。

具体实施方式

[0029] 本发明提供了一种具有生防作用的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)10564菌株，所述10564菌株已进行保藏，保藏编号为CTCCSJ‑W‑AW10564。本发明所述10564菌株分离自滩涂湿地中，菌株通过分子水平鉴定，结果为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。

[0030] 本发明所述棘孢木霉10564在PDA培养基上培养一周，能够产生大量气生菌丝并产生深绿色的分生孢子簇，在25～28℃、光照下培养有利于其快速生长和产孢。

[0031] 本发明所述生防作用优选包括抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，实施例中利用平板对峙实验验证了棘孢木霉10564菌株能够抑制尖孢镰刀菌生长，具体表现为：棘孢木霉10564菌株相同时间内能占取平板更多生长空间和营养、并能够产生抗性物质显著抑制尖孢镰刀菌菌丝生长，在两者之间形成抑菌圈，因此可将所述10564菌株应用于生防菌剂的制备。

[0032] 本发明还提供了上述10564菌株在制备生防菌剂中的应用。

[0033] 本发明所述生防菌剂的类型优选包括分生孢子洗脱液和分生孢子悬浮液。

[0034] 本发明提供了一种棘孢木霉10564菌株的分生孢子洗脱液的制备方法，包括以下步骤：将棘孢木霉10564菌株接种在PDA平板于25℃、光照条件下上培养3d，得到单菌落；

[0035] 挑取所述单菌落的边缘菌丝接种到PDA平板培养7d，添加无菌水后刮洗菌落表面的分生孢子，得所述分生孢子洗脱液。

[0036] 本发明将棘孢木霉10564菌株接种在PDA平板上培养，得到单菌落，所述培养的温度优选为25℃，时间优选为3d。本发明对所述PDA平板的组成并没有特殊限定，优选利用本领域的常规平板培养基即可。实施例中所用的PDA平板的配方，优选包括：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉10g，补充蒸馏水至1000ml。在制备所述PDA平板时，本发明优选将洗净后去皮的马铃薯切片，加水煮沸约半小时，用纱布滤去马铃薯，然后加入葡萄糖，将琼脂粉加水搅拌均匀，加入上述溶液中，再加水定容，搅拌溶解后分装灭菌。

[0037] 得单菌落后，本发明挑取所述单菌落的边缘菌丝接种到PDA平板并于25℃、光照条件下培养7d，添加无菌水后刮洗菌落表面的分生孢子，得所述分生孢子洗脱液。本发明优选挑取所述单菌落的边缘菌丝接种到新的PDA平板上，进行培养，所述培养的温度优选为25℃，时间优选为7d，而后向含有所述PDA平板的培养皿中加水，并刮洗菌落表面的分生孢子，混匀，得所述分生孢子洗脱液。本发明在得到所述分生孢子洗脱液后，优选还包括计数，如7
利用血球计数板在显微镜下计数，并调整分生孢子洗脱液浓度为1x10个/ml，作为工作液使用。

[0038] 本发明还提供了一种棘孢木霉10564菌株的分生孢子悬浮液的制备方法，包括以下步骤：将棘孢木霉10564菌株接种在PDA平板上培养，得到单菌落；

[0039] 挑取所述单菌落边缘的菌丝块接种至PDB培养液中培养3～7d，得到培养物；

[0040] 将所述培养物离心，对离心上清液进行过滤，收集滤液得所述分生孢子悬浮液。

[0041] 本发明将棘孢木霉10564菌株接种在PDA平板上培养，得到单菌落。本发明所述培养优选包括在光照条件下，于25℃培养3天，可产生单菌落。

[0042] 得单菌落后，本发明挑取所述单菌落边缘的菌丝块接种至PDB培养液中培养3～7d，得到培养物。本发明所述PDB培养液的配方与PDA平板的配方，除不含有琼脂外，其余成分完全不同。本发明所述培养，优选包括在温度为25℃、150r/min的条件下振荡培养7天。

[0043] 得培养物后，本发明将所述培养物离心，对离心上清液进行过滤，收集滤液得所述分生孢子悬浮液。本发明所述离心8000rpm。本发明对离心后的上清液进行过滤，所述过滤优选包括两级过滤，首先进行滤纸过滤，得到的初级滤液经细菌过滤器再次过滤，得到分生孢子悬浮液。

[0044] 本发明还提供了上述10564菌株或利用上述制备方法得到的分生孢子洗脱液或利用上所述制备方法得到的分生孢子悬浮液在防治番茄枯萎病中的应用。

[0045] 本发明所述应用，优选包括在番茄幼苗移栽前利用所述分生孢子洗脱液进行蘸根；和/或在番茄幼苗移栽后，利用所述分生孢子悬浮液进行灌根。

[0046] 本发明还提供了一种防治番茄叶片枯萎病的方法，包括以下步骤：在番茄幼苗移栽前，利用上述制备方法得到的分生孢子洗脱液对幼苗根系进行蘸根。

[0047] 本发明在进行所述蘸根时，优选利用分生孢子洗脱液的工作液进行蘸根，所述蘸根的时间优选为15～20min。本发明在所述蘸根前，优选还包括将生长3周的番茄幼苗从穴盘里取出来，清水冲洗干净根部，而后进行所述蘸根。本发明所述蘸根，可抑制寄生在番茄根部和番茄根际土壤中的尖孢镰刀菌，有效防治番茄叶片枯萎病。

[0048] 本发明还提供了一种保护番茄幼苗光合系统II并提高抗性相关激素含量的方法，包括以下步骤：在番茄幼苗移栽后，利用上所述制备方法得到的分生孢子悬浮液将浓度调7
整为1x10个/ml进行灌根。本发明所述灌根优选在移栽3周进行3次灌根，每次间隔3d，每次灌根20ml。

[0049] 本发明利用所述灌根，可通过保护番茄幼苗光合系统II免受破坏，从而提高番茄植株抗枯萎，具体表现在：经棘孢木霉10564菌株孢子液处理的番茄幼苗叶片中叶绿素荧光相关参数均表现出促进番茄光合作用的趋势；并且所述灌根还能提高番茄抗性相关激素含量，具体表现在番茄幼苗茉莉酸含量显著提高。

[0050] 下面结合实施例对本发明提供的棘孢木霉10564菌株及在番茄枯萎病生防中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0051] 实施例1

[0052] 棘孢木霉10564的分离纯化

[0053] 从田间取回含有木霉的土壤，把采集的土样自然晾干后辗碎，过筛。称取10g土样置于盛有90mL无菌水的烧瓶中，用涡旋仪充分振荡.吸取10mL悬浮液于90mL无菌水中稀释，‑3再从稀释的悬浮液中吸取10mL于90mL无菌水中稀释，如此类推，稀释至体积分数为10 、10‑4 ‑5
、10 。用微量移液枪从各含量的土壤悬浮液中吸取0.1mL悬浮液分散滴于马丁氏——孟加拉红平板上，再用灭菌的三角玻璃棒涂匀，静置20min后于25℃的恒温培养箱中倒置培养，菌落形成后立即纯化。

[0054] 木霉种类鉴定

[0055] 将木霉菌在PDA平板上培养3d，用直径为0.5cm的打孔器打取菌饼，置于PDA平板上，于25℃、光照条件下培养5d，观察菌落形状和颜色等。在显微镜下观察木霉菌分生孢子梗的分枝情况和分生孢子的形态，结合培养性状并参考Rifai和Bissett的木霉菌种群分类系统进行种类鉴定。

[0056] 其中：

[0057] 1、棘孢木霉10564孢子洗脱液制备：

[0058] 1)将棘孢木霉10564菌株接种在PDA培养基上培养，得到棘孢木霉10564菌株菌落；

[0059] 2)将步骤1)得到的棘孢木霉10564菌株菌落边缘菌丝接种到PDA培养皿上培养；

[0060] 3)在步骤2)的培养皿中加入无菌水，刮洗菌落表面的分生孢子，混匀，即得到棘孢木霉10564菌株分生孢子洗脱液。

[0061] 4)将步骤3)的分生孢子洗脱液利用血球计数板在显微镜下计数，调整分生孢子洗7
脱液浓度为1x10个/ml。

[0062] 2、棘孢木霉10564菌株分生孢子悬浮液制备：

[0063] 1)将棘孢木霉10564菌株接种在PDA培养基上培养，得到棘孢木霉10564菌株菌落；

[0064] 2)将步骤1)得到棘孢木霉10564菌落边缘的菌丝块接种至PDB培养液中培养，得到培养物；

[0065] 3)将步骤2)得到的培养物离心，取离心上清液经滤纸过滤，得到的初级滤液经细菌过滤器再次过滤，得到滤液。

[0066] 实施例2

[0067] 棘孢木霉10564菌株对尖孢镰刀菌的抑制作用

[0068] 将保存的10564菌株和尖孢镰刀菌分别在PDA平板上活化，在超净工作台里用打孔器在PDA培养基平板上打孔，得到5×5mm的菌饼，将两种菌转接到新的PDA平板，室温培养7天。

[0069] 结果如图1所示，棘孢木霉10564菌株相同时间内能占取平板更多生长空间和营养、并能够产生抗性物质显著抑制尖孢镰刀菌菌丝生长，在两者之间形成抑菌圈。

[0070] 实施例3

[0071] 棘孢木霉10564菌株对番茄枯萎病的防治作用

[0072] 将生长3周的番茄幼苗从穴盘里取出来，清水冲洗干净根部，分别浸泡在清水、实7
施例1制备得到的棘孢木霉10564菌株孢子洗脱液(1x10 个/ml)、尖孢镰刀菌孢子洗脱液
7 7
(1x10 个/ml)、棘孢木霉10564菌株与尖孢镰刀菌孢子混合洗脱液(1x10个/ml)中，15～
20min，定植于穴盘中，每一处理24株。处理后，番茄在苗期出现表型差异，如图2所示，混合孢子液处理组和单独木霉处理组番茄幼苗生长健壮，显著增强植株抗病性。

[0073] 尖孢镰刀菌孢子洗脱液制备方法：

[0074] 将尖孢镰刀菌接种在PDA培养基上25℃下培养3d，得到尖孢镰刀菌菌落；

[0075] 将尖孢镰刀菌边缘菌丝接种到PDA培养皿上培养7d；

[0076] 向培养皿中加入无菌水，刮洗菌落表面的分生孢子，混匀，即得到尖孢镰刀菌分生孢子洗脱液。

[0077] 将所得分生孢子洗脱液利用血球计数板在显微镜下计数，调整分生孢子洗脱液浓7
度为1x10个/ml。

[0078] 棘孢木霉10564和尖孢镰刀菌混合洗脱液制备步骤同上，使得两菌株浓度均为7
1x10个/ml。

[0079] 根据番茄植株发病状态划分为4级：

[0080] 0级：植株生长健壮，叶片自然舒展、绿色明亮，茎部粗壮；

[0081] 1级：植株挺立，叶片黄化萎蔫面积小于叶总面积50％，茎基部褐化；

[0082] 2级：植株叶片黄化萎蔫面积大于总叶面积50％，顶部叶片发黄且皱缩，茎部枯黄皱缩；

[0083] 3级：植株矮小枯萎，叶片枯黄卷曲皱缩，仅生长点存活，茎部萎蔫；

[0084] 4级：植株枯萎至死。

[0085] 根据发病等级计算病情指数：病情指数＝∑(各级病株数×相应病级)/(总株数×最高病级)×100。以病情指数作为棘孢木霉10564菌株分生孢子洗脱液对尖孢镰刀菌孢子洗脱液的抑制效果。如图3和表1所示。

[0086] 表1不同处理组对尖孢镰刀菌孢子洗脱液的抑制效果

[0087]

[0088] 计算发病率(处于2～4级即判定为枯萎病番茄植株)：发病率％＝该处理发病植株数/该处理发病植株总数×100。以发病率作为棘孢木霉10564菌株分生孢子洗脱液对尖孢镰刀菌导致番茄枯萎病的防治效果。如图4和表2所示。

[0089] 表2不同处理组对番茄枯萎病的防治效果

[0090]

[0091]

[0092] 实施例4

[0093] 棘孢木霉10564菌株提高番茄叶片叶绿素荧光含量，以提高番茄植株抗逆性的作用

[0094] 将生长3周的番茄幼苗定植于田间，分别向每株幼苗根部灌溉清水、实施例1制备得到的棘孢木霉10564孢子悬浮液、尖孢镰刀菌悬浮液、棘孢木霉10564与尖孢镰刀菌孢子混合悬浮液。每隔3天灌根一次，连续3次。四种处理出现表型差异后取样，摘取番茄同一部位叶片，暗处理15min，利用荧光仪PAM系列测量样品中叶绿素荧光相关参数Fv/Fm、ETR＝[(Fm’‑F)Fm’]×PFD、qP＝(Fm’‑Fs)/Fv’和NPQ＝(Fm‑Fm’)/Fm’＝Fm/Fm’‑1。

[0095] Fv/Fm反映了植物的潜在最大光合能力(即光合效率)；

[0096] ETR是表观光合电子传递速率；

[0097] qP是由光合作用引起的荧光淬灭，反映了光合活性的高低；

[0098] NPQ反映了植物耗散过剩光能为热的能力，即光保护能力。

[0099] 尖孢镰刀菌孢子悬浮液的制备方法：

[0100] 将尖孢镰刀菌接种在PDA培养基于25℃，黑暗条件下培养3d，得到尖孢镰刀菌菌落；

[0101] 将尖孢镰刀菌边缘的菌丝块接种至PDB培养液中培养，得到培养物，培养条件为在温度为25℃、150r/min的条件下振荡培养5d；

[0102] 得到的培养物离心，取离心上清液经滤纸过滤，得到孢子悬浮液，并利用血球计数7
板将浓度调整为1x10个/ml。

[0103] 混合孢子悬浮液的方法，包括以下步骤：

[0104] 将棘孢木霉10564菌株接种在PDA培养基于25℃、光照下培养3天，得到棘孢木霉10564菌株菌落；

[0105] 得到棘孢木霉10564菌落边缘的菌丝块接种至PDB培养液中培养，得到培养物，培养条件为在温度为25℃、150r/min的条件下振荡培养5天；

[0106] 得到的培养物离心，取离心上清液经滤纸过滤，得到孢子悬浮液，并利用血球计数7
板将浓度调整为1x10个/ml。

[0107] 将2x107个/ml的尖孢镰刀菌孢子悬浮液与2x107个/ml的棘孢木霉10564孢子悬浮液等体积混匀，即得到两者的混合孢子悬浮液。

[0108] 结果如图5和表3所示，木霉抑制尖孢镰刀菌的活性，防止番茄幼苗感病，保护了植株光合系统II免遭破坏，提高叶片光合效率。

[0109] 表3不同处理组对光合作用的影响

[0110]

[0111] 实施例5

[0112] 棘孢木霉10564菌株诱导番茄植株抗性相关激素茉莉酸含量发生变化，提高番茄抗病性

[0113] 将生长3周的番茄幼苗定植于田间，分别向每株幼苗根部灌溉清水、实施例1制备得到的棘孢木霉10564孢子悬浮液、尖孢镰刀菌悬浮液、棘孢木霉10564与尖孢镰刀菌孢子混合悬浮液。每隔3天灌根一次，连续3次。四种处理出现表型差异后取样，摘取番茄同一部位叶片测定其茉莉酸含量。

[0114] 结果如图6和表4所示，木霉调节植株体内抗性激素变化，诱导番茄幼苗防御反应，提高抗病性。

[0115] 表4不同处理组对番茄抗病性的作用

[0116]CK F.oxy 564&F.oxy 564
14.94 14.96 31.34 34.64
19.44 12.34 32.43 33.60
14.03 12.49 31.05 30.41
16.28 11.62 32.12 29.75

[0117] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。