UPLC-MS/MS法同时检测血液中16种药物及其代谢物的方法

摘要

本发明涉及一种UPLC‑MS/MS法同时检测血液中16种药物及其代谢物的方法，所述16种药物及其代谢物包括甲氨蝶呤、奥氮平、利培酮、9‑羟基利培酮、氨磺必利、齐拉西酮、奋乃静、琉利达嗪、舍吲哚、氯普噻吨、瑞舒伐他汀、茶碱、艾斯西酞普兰或西酞普兰、马普替林、安非他酮、羟基安非他酮和阿奇霉素。所述方法包括：确定标准曲线、处理待测血样以及利用UPLC‑MS/MS法检测待测样本。本发明提供的检测方法能够快速准确的同时检测血液中16种药物及其代谢物的含量。样本前处理采用蛋白沉淀的方法，所用血量较少且处理方法简单易行。检测方法线性范围宽，分析时间短，1小时能够分析10组样本，灵敏度高，重现性好。

权利要求

1.一种UPLC‑MS/MS法同时检测血液中16种药物及其代谢物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）制备至少三种不同浓度的标准溶液，并分别建立下述16种药物及其代谢物的标准曲线；

其中，所述16种药物及其代谢物包括甲氨蝶呤、奥氮平、利培酮、9‑羟基利培酮、氨磺必利、齐拉西酮、奋乃静、琉利达嗪、舍吲哚、氯普噻吨、瑞舒伐他汀、茶碱、艾斯西酞普兰或西酞普兰、马普替林、安非他酮、羟基安非他酮和阿奇霉素；

（2）对待测血样进行前处理，得到待测样品；

所述前处理的方法包括：取待测血样的血清或血浆，与内标工作液和蛋白沉淀剂混合并离心，取上清液与超纯水混合，得到所述待测样品；

（3）利用UPLC‑MS/MS对待测样品进行检测，利用步骤（1）建立的标准曲线对待测样品中

16种药物及其代谢物进行定量；

在UPLC‑MS/MS检测中，使用的分析色谱柱为SHIMADZU Shim‑pack Velox C18 2.1*100 mm 2.7 μm；

在UPLC‑MS/MS检测中，液相色谱条件包括：

柱温：35‑50℃；

流动相：A为含有0.1%甲酸、1‑10 mmol/L甲酸铵或乙酸铵的水，B为含有0.1%甲酸、1‑10 mmol/L甲酸铵或乙酸铵的甲醇；

梯度洗脱：

0.00 min：A 80%，B 20%；

0.01‑0.50 min：A 60%，B 40%；

0.51‑2.00 min：A 40%，B 60%；

3.50‑4.00 min：A 0%，B 100%；

4.01 min：A 80%，B20%；

分析时间：5.50 min；

流速：0.2‑0.4 mL/min；

在UPLC‑MS/MS检测中，质谱条件包括：

离子源温度：350‑600℃；碰撞气：8‑9 L/min；干燥气1：50‑80 L/min；干燥气2：50‑80 L/min；气帘气：10‑20 L/min；离子源高压：5000‑5500V；

在所述前处理方法中，所述血清或血浆、蛋白沉淀剂的体积比为1:3‑10，所述上清液和超纯水的体积比为1:0.5‑5；

所述蛋白沉淀剂为甲醇或乙腈；

所述16种药物及其代谢物使用的内标物包括甲氨蝶呤‑d3、瑞舒伐他汀‑d6、利培酮‑d4、9‑羟基利培酮‑d4、奥氮平‑d8、奋乃静‑d4、安非他酮‑d9、羟基安非他酮‑d6、氯普噻吨‑d6、舍吲哚‑d4、阿奇霉素‑d3、西酞普兰‑d6、马普替林‑d5、齐拉西酮‑d8和茶碱‑d6。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲氨蝶呤的内标为甲氨蝶呤‑d3，奥氮平的内标为奥氮平‑d8，利培酮的内标为利培酮‑d4，9‑羟基利培酮的内标为9‑羟基利培酮‑d4，氨磺必利和茶碱的内标为茶碱‑d6，齐拉西酮的内标为齐拉西酮‑d8，奋乃静和琉利达嗪的内标为奋乃静‑d4，舍吲哚的内标为舍吲哚‑d4，氯普噻吨的内标为氯普噻吨‑d6，瑞舒伐他汀的内标为瑞舒伐他汀‑d6，艾斯西酞普兰或西酞普兰的内标为西酞普兰‑d6，马普替林的内标为马普替林‑d5，安非他酮的内标为安非他酮‑d9，羟基安非他酮的内标为羟基安非他酮‑d6，阿奇霉素的内标为阿奇霉素‑d3。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述质谱条件中：甲氨蝶呤使用的离子对为455.2，308.2；奥氮平使用的离子对为313.1，256.2；利培酮使用的离子对为411.1，191.1；9‑羟基利培酮使用的离子对为427.1，207.0；氨磺必利使用的离子对为370.1，242.0；齐拉西酮使用的离子对为413.2，194.1；奋乃静使用的离子对为

404.1，171.1；琉利达嗪使用的离子对为371.0，126.0；舍吲哚使用的离子对为441.5，

113.3；氯普噻吨使用的离子对为316.1，271.0；瑞舒伐他汀使用的离子对为482.1，258.1；

茶碱使用的离子对为181.1，124.0；艾斯西酞普兰或西酞普兰使用的离子对为325.2，

109.0；马普替林使用的离子对为278.2，250.2；安非他酮使用的离子对为240.1，183.9；羟基安非他酮使用的离子对为256.1，238.1；阿奇霉素使用的离子对为749.4，591.3；

甲氨蝶呤‑d3使用的离子对为458.2，311.2；瑞舒伐他汀‑d6使用的离子对为488.1，

264.2；利培酮‑d4使用的离子对为415.3，195.1；9‑羟基利培酮‑d4使用的离子对为431.1，

211.0；奥氮平‑d8使用的离子对为321.1，261.2；奋乃静‑d4使用的离子对为408.1，171.1；

安非他酮‑d9使用的离子对为249.1，184.9；羟基安非他酮‑d6使用的离子对为262.1，

244.1；氯普噻吨‑d6使用的离子对为322.1，271.0；舍吲哚‑d4使用的离子对为445.5，

117.3；阿奇霉素‑d3使用的离子对为752.4，594.3；西酞普兰‑d6使用的离子对为331.2，

262.1；马普替林‑d5使用的离子对为283.1，255.2；齐拉西酮‑d8使用的离子对为421.2，

194.1；茶碱‑d6使用的离子对为187.1，127.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述前处理方法包括：待测血样进行离心，取血清或血浆与内标工作液和蛋白沉淀剂进行漩涡混合并离心取上清液，上清液与超纯水旋涡混合后，取上清液作为待测样品。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准溶液的制备方法包括：将内标工作液与含有16种药物及其代谢物的标准工作液混合后，依次与甲醇、超纯水混合，得到所述标准溶液，所述标准工作液包括至少三个级别浓度；

各所述级别浓度的标准工作液均利用稀释剂由标准中间液稀释得到，所述标准中间液利用稀释剂由标准品储备液稀释得到，所述标准品储备液是利用溶剂溶解所述16种药物及其代谢物各自的标准品得到。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述稀释剂为浓度为50‑100%的甲醇水溶液或乙腈水溶液。

说明书

UPLC‑MS/MS法同时检测血液中16种药物及其代谢物的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及药物检测技术领域，尤其涉及一种UPLC‑MS/MS法同时检测血液中16种药物及其代谢物的方法。

背景技术

[0002] 治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，简称TDM）是一门研究个体化药物治疗机制、技术、方法和临床标准，并将研究结果转化应用于临床治疗以达到最大化合理用药的药学临床学科。在药代动力学（pharmacokinetics，PK）原理指导下，应用现代分析技术定量测定患者治疗用药后体液中的药物及其代谢产物的浓度，分析其与疗效的关系，调整个体用药方案，从而提高药物疗效、降低毒副作用，同时通过合理用药最大化节省药物治疗费用。现有技术进行TDM检测中，首先必须有测定生物样本中药物浓度的方法，目前常用的TDM的方法主要有光谱分析、色谱分析、免疫学检测技术法及液相质谱联用技术。然而由于生物样品中成分复杂，从药物专属性上推荐使用液相质谱联用技术。LC‑MS/MS法灵敏度高，选择性强，且能同时定量多种药物。而进行TDM的药物种类有很多，包括抗菌药、抗癫痫药、抗肿瘤药物、心血管药物、平喘药、抗精神病药物。

[0003] 为了提高检测效率，临床开展了使用LC‑MS/MS法对多种药物进行一法多测。但考虑到药物极性等理化性质，一般都以治疗同一种疾病的药物如免疫抑制剂或同一类药物如氨基糖苷类药物进行一法多测。

[0004] 在实际应用中，每天可能需要进行TDM的药物种类很多，且临床要求结果的时效性，不同方法间需要时间来进行切换。当前报道的使用质谱法来监测血药浓度时每个样本的平均时长为5‑7分钟，而不同方法间进行切换的时间通常需要30分钟。另一方面在需要多种方法检测时前处理和标准曲线配制上也需成倍的时间进行，且会占用多台仪器而需要更大的场地。同时对于某些患者而言会同时服用不同种类药物，若需要检测不同种类的血药浓度，则需要多种方法来进行测定会增加检测时长，并且需要更多的采血量。

[0005] 因此，目前需要提供一种能够同时高效且准确的检测上述多种药物的分析方法。

发明内容

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种UPLC‑MS/MS法同时检测血液中16种药物及其代谢物的方法。

[0007] 第一方面，本发明提供了一种UPLC‑MS/MS法同时检测血液中16种药物及其代谢物的方法，所述方法包括如下步骤：

[0008] （1）制备至少三种不同浓度的标准溶液，并分别建立下述16种药物及其代谢物的标准曲线；

[0009] 其中，所述16种药物及其代谢物包括甲氨蝶呤、奥氮平、利培酮、9‑羟基利培酮、氨磺必利、齐拉西酮、奋乃静、琉利达嗪、舍吲哚、氯普噻吨、瑞舒伐他汀、茶碱、艾斯西酞普兰或西酞普兰、马普替林、安非他酮、羟基安非他酮和阿奇霉素；

[0010] （2）对待测血样进行前处理，得到待测样品；

[0011] 所述前处理的方法包括：取待测血样的血清或血浆、内标工作液和甲醇混合并离心，取上清液与超纯水混合，得到所述待测样品；

[0012] （3）利用UPLC‑MS/MS对待测样品进行检测，利用步骤（1）建立的标准曲线对待测样品中16种药物及其代谢物进行定量。

[0013] 在本发明中，9‑羟基利培酮和羟基安非他酮分别为利培酮和安非他酮在体内代谢时产生的同样具有治疗效果的活性代谢产物；同时，艾斯西酞普兰与西酞普兰互为立体异构体，在临床上一般不会同时服用，无需进行色谱分离，可按医嘱进行西酞普兰或艾斯西酞普兰的检测。因此，二者的检测共用同一离子通道。

[0014] 本发明提供的前处理方法无需萃取、氮气吹干等步骤，仅需要利用蛋白沉淀剂与待测样本进行混合并离心后与超纯水混合后就能够制备得到用于后续检测的待测样品，本发明提供的待测样品的前处理方法能够将前处理时间控制在17 min以内，极大地缩短了由待测血样到检测结果的检测时间。

[0015] 在本发明中，在UPLC‑MS/MS检测中，使用的分析色谱柱为SHIMADZU Shim‑pack Velox C18。

[0016] 在本发明中，在UPLC‑MS/MS检测中，液相色谱条件包括：

[0017] 流动相：A为含有0.1%甲酸、1‑10 mmol/L甲酸铵或乙酸铵的水，B为含有0.1%甲酸、1‑10 mmol/L甲酸铵或乙酸铵的甲醇；

[0018] 其余条件见表1：

[0019] 表1

[0020]

[0021] 在UPLC‑MS/MS检测中，质谱条件见表2：

[0022] 表2

[0023] 参数 设定值 参数 设定值CUR 10‑20 L/min TEM 350‑600℃
CAD 8‑9 L/min GS1 50‑80 L/min
IS 5000‑5500 V GS2 50‑80 L/min

[0024] 考虑到不同种类的药物极性存在较大差异，若采用一针多测，极容易出现部分待测物在色谱柱上无保留或不易被洗脱，或出现药物与药物、药物与基质干扰无法成功分离的现象，即药物对应的色谱峰间或色谱峰与基质互相干扰，导致无法实现药物浓度的准确定量，因此，目前采用的一针多测的检测方法通常是检测同一类药物。本发明通过选用特定的分析色谱柱，同时配合特定的检测条件，能够实现16种药物及其代谢物的成功检测，相互不存在干扰，且检测时间短，分析时间短，准确度和精密度较高。

[0025] 作为本发明的一种优选技术方案，在所述前处理方法中，所述血清或血浆、蛋白沉淀剂的体积比为1:(3‑10)，例如1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9等，所述上清液和超纯水的体积比为1:(0.5‑5)，例如1:1、1:2、1:3、1:4等。

[0026] 作为本发明的一种优选技术方案，所述蛋白沉淀剂为甲醇或乙腈。

[0027] 作为本发明的一种优选技术方案，所述前处理方法包括：待测血样进行离心，取血清或血浆与内标工作液和蛋白沉淀剂进行漩涡混合并离心取上清液，上清液与超纯水旋涡混合后，取上清液作为待测样品。

[0028] 作为本发明的一种具体实施方式，所述前处理方法包括：

[0029] 用移液枪移取内标工作液10 μL于1.5 mL离心管中，然后加入血清或血浆100 μL，加入400 µL甲醇，在2500 r/min的转速下涡旋震荡混合5 min，14000 r/min高速离心10 min，移取50 µL上清液至1.5 mL塑料离心管，加入100 µL超纯水，2500 r/min涡旋混匀1 min，取150 µL上清液，得到待测样品。

[0030] 作为本发明的一种优选技术方案，所述16种药物及其代谢物使用的内标物具体见表3：

[0031] 表3

[0032]

[0033] 在本发明中，部分药物及其代谢物能够共用内标，共用内标能够减少内标的使用量，降低检测成本的同时，内标物的减少同样也可以简化检测方法，提高检测效率。

[0034] 作为本发明的一种优选技术方案，所述标准溶液的制备方法包括：将内标工作液与含有16种药物及其代谢物的标准工作液混合后，依次与甲醇、超纯水混合，得到所述标准溶液，所述标准工作液包括至少三个级别浓度；

[0035] 各所述级别浓度的标准工作液均利用稀释剂由标准品中间液稀释得到，所述中间液利用稀释剂由标准品储备液稀释得到，所述标准品储备液是利用溶剂溶解所述16种药物及其代谢物各自的标准品得到。

[0036] 作为本发明的一种具体实施方式，所述标准溶液的制备方法包括：

[0037] 用移液器将至少三种不同浓度的标准工作液10 μL、10 μL内标工作液、90 μL超纯水及400 µL甲醇，置于1.5 mL离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为2500 r/min震荡混匀1 min，移取50 µL混匀后液体至1.5 mL离心管，加入100 µL纯水，2500 r/min涡旋混匀1 min，得到至少三种不同浓度的标准溶液。

[0038] 作为本发明的一种优选技术方案，所述内标工作液的制备方法包括：将16种药物及其代谢物使用的15种内标储备液利用稀释剂稀释、混合，得到所述内标工作液。

[0039] 作为本发明的一种优选技术方案，所述稀释剂为甲醇水溶液或乙腈水溶液，优选为浓度为50‑100%的甲醇水溶液或乙腈水溶液，优选为浓度为50%的甲醇水溶液或者浓度为50%的乙腈水溶液。

[0040] 本发明所述50‑100%的甲醇水溶液或乙腈水溶液指的是甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为1:(0‑1)，或者在乙腈水溶液中，乙腈和水的体积比为1:(0‑1)。

[0041] 本发明特异性的选用上述稀释剂，一方面上述稀释剂对16种药物及其代谢物的标准品及使用的15种内标都有良好的溶解度，另一方面，利用本发明提供的特定的稀释剂制备标准中间液，能够使标准中间液长期冷冻保存或被反复使用多次后仍然基本保持浓度不变，不影响后续标曲的确定进而不影响检测结果，因此，本发明选用的稀释剂能够避免每次检测前均需要现场制备标准中间液，简化了检测方法且进一步缩短了检测时间。

[0042] 在本发明中，通过选择特定的内标同时配合特定的样品前处理条件，能够最大程度的降低基质的干扰，并且结合本发明选用的色谱柱和检测条件等能够进一步规避血液样品中的其他杂质的干扰，因此，本发明在建立标曲时，能够不添加空白基质，简化了制备标准溶液的方法且能够保证检测准确性。

[0043] 作为本发明的一种优选技术方案，所述待测血样为血清采血管、EDTA血浆采血管、肝素锂采血管血液，经离心后取上清得到血浆样品或血清样品。

[0044] 本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

[0045] （1）本发明提供的前处理方法能够缩短样本前处理时间，其前处理时间在17 分钟以内，且标准曲线的建立无需添加空白血基质进行前处理，能够大幅度降低从血样到出具检测结果的检测时长；

[0046] （2）本发明提供的检测方法所使用的血浆或血清的量较少，仅需100 μL就可满足16种药物及代谢物的检测需求；

[0047] （3）本发明提供的检测方法能够同时检测血液中16种不同极性、不同类型的药物及其代谢物，检测时间短，方法分析时长仅5.5分钟，1个小时能够分析10组样本。同时通过部分内标共用减少了内标的使用，降低了检测成本；

[0048] （4）本发明提供的检测方法的标曲范围宽，能够完全覆盖16种血药及其代谢物的参考治疗区间浓度和警戒浓度，尽可能的避免了实际临床样本可能超出检测线性范围的问题；

[0049] （5）本发明提供的检测方法检测准确性较高，灵敏度高，同时重现性（稳定性）较好。

具体实施方式

[0050] 为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

[0051] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

[0052] 实施例1

[0053] 本实施例提供了一种标准溶液的制备方法，包括制备标准储备液、制备标准工作液、制备内标储备液、制备内标工作液和制备标准溶液，具体步骤如下：

[0054] （1）制备标准工作液

[0055] A、16种药物及其代谢物分别对应的标准品储备液利用稀释剂进行稀释，得到标准品中间液，标准品储备液及标准品中间液浓度见表4；

[0056] 表4

[0057]物质名称 标准品储备液浓度(μg/mL) 标准品中间液浓度(μg/mL)
甲氨蝶呤 1943 1080
瑞舒伐他汀 2274 41
利培酮 3719 54
9‑羟基利培酮 1800 54
奥氮平 4811 65
奋乃静 1479 7
安非他酮 1055 8
羟基安非他酮 5003 675
氯普噻吨 1237 203
舍吲哚 2078 68
阿奇霉素 10000 1350
艾斯西酞普兰 2495 81
西酞普兰 1640 81
马普替林 5603 97
硫利达嗪 2277 432
氨磺必利 4035 270
奇拉西酮 905 216
茶碱 5220 3375

[0058] B、标准品中间液进行混合，并利用稀释剂进行稀释，得到标准工作液（L7）；

[0059] C、将标准工作液利用稀释剂进行稀释，得到至少三种不同浓度的标准工作液；

[0060] 本实施例使用的稀释剂为甲醇:水（V:V）=1:1的甲醇水溶液；

[0061] 本实施例提供了7种不同的浓度的标准工作液，标准工作液中的16种药物及其代谢物（包括9‑羟基利培酮和羟基安非他酮）的浓度范围见表5：

[0062] 表5

[0063] 物质名称 浓度范围(ng/mL)甲氨蝶呤 320‑40000
瑞舒伐他汀 12‑1500
利培酮 16‑2000
9‑羟基利培酮 16‑2000
奥氮平 19.2‑2400
奋乃静 4‑500
安非他酮 10‑1250
羟基安非他酮 400‑50000
氯普噻吨 60‑7500
舍吲哚 20‑2500
阿奇霉素 400‑50000
西酞普兰/艾斯西酞普兰 24‑3000
马普替林 28.8‑3600
琉利达嗪 128‑16000
氨磺必利 80‑10000
齐拉西酮 64‑8000
茶碱 4000‑500000

[0064] （2）制备内标工作液

[0065] 内标物储备液部分为市售品，部分购买对应的标准品利用稀释剂进行稀释，各内标均配制浓度为100 μg/mL的内标物储备液。

[0066] 内标储备液利用稀释剂甲醇:水（V:V）=1:1稀释，得到内标工作液，制备得到的内标工作液的浓度见表6。

[0067] 表6

[0068]内标物 浓度(μg/mL) 内标物 浓度(μg/mL)
甲氨蝶呤‑d3 5.56 氯普噻吨‑d6 0.78
瑞舒伐他汀‑d6 1.11 舍吲哚‑d4 0.56
利培酮‑d4 0.22 阿奇霉素‑d3 5.56
9‑羟基利培酮‑d4 0.22 西酞普兰‑d6 0.06
奥氮平‑d8 0.22 马普替林‑d5 0.33
奋乃静‑d4 0.11 茶碱‑d6 42.51
安非他酮‑d9 0.22 齐拉西酮‑d8 1.11
羟基安非他酮‑d6 0.56 / /

[0069] （3）制备标准溶液

[0070] 用移液器将至少三种不同浓度的标准工作液10 μL、10 μL内标工作液、90 μL超纯水及400 µL甲醇，置于1.5 mL离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为2500 r/min震荡混匀1 min，移取50 µL混匀后液体至1.5 mL塑料离心管，加入100 µL超纯水，2500 r/min涡旋混匀1 min，得到至少三种不同浓度的标准溶液。

[0071] 实施例2

[0072] 本实施例提供了利用仪器AB SCIEX；型号规格为：AB SCIEX Jasper HPLC MS TRIPLE QUAD 4500MD对样品检测的方法；

[0073] 所使用的分析色谱柱流动相为：A相：水（0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸铵），B相：甲醇（0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸铵），分析色谱柱采用梯度洗脱方式，色谱条件参数见表7：

[0074] 表7

[0075]

[0076] 对于质谱条件，参数见表8‑9：

[0077] 表8

[0078]参数 设定值 参数 设定值
CUR 20 L/min TEM 550℃
CAD 9 L/min GS1 50 L/min
IS 5000 V GS2 80 L/min

[0079] 表9

[0080]

[0081]

[0082] 实施例2得到的色谱图中各目标物的保留时间（出峰时间）见表10：

[0083] 表10

[0084] 物质名称 保留时间/min 物质名称 保留时间/min甲氨蝶呤 1.40 舍吲哚 3.00
瑞舒伐他汀 2.73 阿奇霉素 1.96
利培酮 1.98 西酞普兰/艾斯西酞普兰 2.10
9‑羟基利培酮 1.90 马普替林 2.50
奥氮平 1.43 琉利达嗪 3.10
奋乃静 3.20 氨磺必利 1.43
安非他酮 2.00 齐拉西酮 2.08
羟基安非他酮 1.93 茶碱 1.39
氯普噻吨 2.80    

[0085] 由实施例2可知，本发明提供的色谱柱和色谱条件能够将所有的待测物保留在色谱柱中且后续能够全部被洗脱，同时，所有的待测物之间成功分离，相互没有干扰，能够实现待测物浓度的准确测量。

[0086] 实施例3

[0087] 本实施例提供了一种由血清采血管、EDTA采血管、肝素锂采血管血液制备待测样品的方法，如下：

[0088] （1）取待检测血清采血管、EDTA采血管或肝素锂采血管血液至少2 mL，在离心速度为3500 r/min下离心10 min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于‑20℃冷冻下保存至分析前备用；

[0089] （2）用移液枪移取内标工作液10 μL于1.5 mL离心管中，然后加入血清或血浆100 μL，加入400 µL甲醇，在2500 r/min的转速下涡旋震荡混合5 min，14000 r/min高速离心10 min，移取50 µL上清液至1.5 mL塑料离心管，加入100 µL超纯水，2500 r/min涡旋混匀1 min，取150 µL上清液，得到待测样品。

[0090] 实施例4

[0091] 本实施例提供了一种检测待测样品中16种药物及其代谢物含量的方法。

[0092] （1）移取待测样品150 μL参照实施例2对待测样品进行检测，进样量为10 μL，得出待测样品中16种药物及其代谢物的内标色谱图；

[0093] （2）将得到的色谱图中的目标物的色谱峰面积与目标物对应内标物的峰面积的比值带入目标物对应的标准曲线方程中，计算得到目标物的浓度与目标物对应内标物的浓度比，进而计算得到待测样品中目标物的浓度值，以此类推，分别计算得到16种药物及其代谢物的浓度。

[0094] 对比例1

[0095] 本对比例提供了一种检测待测样品中16种药物及其代谢物含量的方法。

[0096] 本对比例提供了利用仪器安捷伦；型号规格为：LC1260‑MS6410对样品检测的方法；

[0097] 所使用的流动相为：A相：水（0.1%甲酸+2 mmol/L乙酸铵），B相：甲醇（0.1%甲酸+2 mmol/L乙酸铵），采用梯度洗脱方式，色谱条件参数见表11：

[0098] 表11

[0099]

[0100] 对于质谱条件，参数见表12‑13：

[0101] 表12

[0102]参数 设定值 参数 设定值
Gas Temp 350℃ Gas Flow 8 L/min
Nebulizer 40 psi Capillary 4000 V

[0103] 表13

[0104] 物质名称 Precursor Ion Product Ion Fragmentor CE Cell Accelerator (Da) (Da) (V) (V) Voltage(V)9‑羟基利培酮 427.1 207 160 30 7
9‑羟基利培酮‑IS 431.1 211 160 30 7
安非他酮 240.1 183.9 95 9 7
安非他酮‑IS 249.1 184.9 100 10 7
氨磺必利 370.1 242 100 20 7
阿奇霉素 749.4 591.3 140 30 7
阿奇霉素‑IS 752.4 594.3 140 30 7
茶碱 181.1 124 100 15 7
茶碱‑IS 187.1 127 100 15 7
奋乃静 404.1 171.1 170 20 5
奋乃静‑IS 408.1 171.1 170 20 5
琉利哒嗪 371 126 160 20 7
氯普噻吨 316.1 271 150 20 7
氯普噻吨‑IS 322.1 271 150 20 7
马普替林 278.2 250.2 100 10 7
马普替林‑IS 283.1 255.2 100 10 7
甲氨蝶呤 455.2 308.2 120 20 7
甲氨蝶呤‑IS 458.2 311.2 120 20 7
羟基安非他酮 256.1 238.1 100 10 7
羟基安非他酮‑IS 262.1 244.1 100 10 7
奥氮平 313.1 256.2 120 22 2
奥氮平‑IS 321.1 261.2 120 22 2
齐拉西酮 413.2 194.1 150 30 7
利培酮 411.1 191.1 160 30 7
利培酮‑IS 415.1 195.1 160 30 7
瑞舒伐他汀 482.1 258.1 140 35 3
瑞舒伐他汀‑IS 488.1 264.2 140 35 3
舍吲哚 441.5 113.3 165 40 3
舍吲哚‑d4 445.5 117.3 165 40 3
西酞普兰/艾斯西 325.2 109 120 30 7
酞普兰
西酞普兰‑IS 331.2 262.1 120 20 7

[0105] 本对比例1所提供的方法，需要更长的分析时间对待测物质进行检测；且本对比例1所提供的检测方法灵敏度较差，对浓度较低的物质，需要在样本前处理过程中进行浓缩才能进行定量检测，增加了样本的前处理时长；部分检测物质精密度较差，在批量样本检测时无法保证所有待测物质的准确度。

[0106] 性能测试：对本发明提供的方法进行评价

[0107] （1）准确性

[0108] 提供一种已知16种药物及其代谢物含量的待测样品，参照实施例4提供的检测方法进行检测，计算得到16种药物及其代谢物的浓度，结果见表14：

[0109] 表14

[0110]物质名称 实际含量(ng/mL) 测试含量(ng/mL) 偏差(%)
甲氨蝶呤 400 387.42 ‑3.2
瑞舒伐他汀 15 14.77 ‑1.58
利培酮 20 18.60 ‑7.25
9‑羟基利培酮 20 19.78 ‑1.12
奥氮平 24 24.69 2.83
奋乃静 5 4.77 ‑4.64
安非他酮 12.5 11.63 ‑7.18
羟基安非他酮 500 504.00 0.80
氯普噻吨 75 72.50 ‑3.39
舍吲哚 25 24.40 ‑2.43
阿奇霉素 500 480.79 ‑3.92
艾斯西酞普兰 30 29.40 ‑2.02
西酞普兰 30 29.40 ‑2.02
马普替林 36 38.00 5.41
琉利达嗪 160 176.78 9.97
氨磺必利 100 94.51 ‑5.65
齐拉西酮 80 77.5 ‑3.71
茶碱 5000 4987.50 ‑0.25

[0111] 由表14可知，本发明提供的方法能够准确检测待测样中16种药物及其代谢物的含量，检测偏差减小，在目前允许的检测偏差范围内，检测方法准确度较高。

[0112] （2）检测限、定量限和线性范围：

[0113] 按实施例1所诉方法配制的标准工作液，按实施例2提供的测定条件浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积‑浓度作图，得到标准曲线，将上述配制的100 μL的含16种药物及其代谢物的血清/血浆，加入10 μL内标工作液，按实施例3进行处理，按实施例2提供的测定条件浓度由低到高进行测定确定检测限和定量限，结果见表15：

[0114] 表15

[0115]

[0116] 由表15可知，本发明提供的检测方法的检出限和定量限均较低，能够在药物及其代谢物含量较低的情况下对药物及其代谢物浓度进行检测，且定量限较低，表明能够在药物及其代谢物含量较低的情况下实现药物及其代谢物浓度的精确检测，同时线性拟合效果较优。

[0117] （3）回收率和精密度

[0118] 取16种药物及其代谢物的标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按实施例2提供的方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如下表16：

[0119] 表16

[0120]

[0121]

[0122]

[0123] 由表16可知，本发明提供的检测方法的检测准确性较高，平均回收率为85%‑115%，且精密度较高，相对标准偏差为0.00% 8.33%。~

[0124] 由实施例和性能测试可知，本发明提供的检测方法的检测限、回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，能够检测血液中16种药物及其代谢物浓度，重现性良好，加样回收率高，检测结果的准确度较高。

[0125] 需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

[0126] 以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。