治疗炎症性肠病的方法

摘要

本文提供了在需要其的受试者中治疗炎症性肠病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的血红蛋白。

权利要求

1.血红蛋白在制备在需要其的受试者中治疗炎症性肠病的药物中的用途，其中所述血红蛋白是重组血红蛋白，所述重组血红蛋白包含双α链和两条β链，其中所述双α链包含由SEQ ID NO:1组成的多肽序列；并且所述两条β链中的每一条都包含由SEQ ID NO:2组成的多肽序列，并且其中所述血红蛋白具有20至50mm Hg的氧p50值。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述炎症性肠病选自溃疡性结肠炎、未确定型结肠炎、克罗恩病、淋巴细胞性结肠炎、显微镜下结肠炎、胶原性结肠炎、自身免疫性肠病、过敏性胃肠病和嗜酸性胃肠病。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述炎症性肠病选自溃疡性结肠炎、克罗恩病和未确定型结肠炎。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述炎症性肠病是克罗恩病。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述炎症性肠病是溃疡性结肠炎。

6.如权利要求1所述的用途，其中所述受试者具有12‑15g/dl或更高的循环血红蛋白浓度。

7.如权利要求1所述的用途，其中所述药物被配制为经腹膜内施用。

8.如权利要求1所述的用途，其中所述药物被配制为经静脉内施用。

9.如权利要求1所述的用途，其中所述血红蛋白具有大于24且小于50mm Hg的氧p50值。

10.如权利要求1所述的用途，其中所述血红蛋白具有大于30且小于50mm Hg的氧p50值。

11.如权利要求1所述的用途，其中所述药物还包括治疗有效量的至少一种其它药剂，其中所述至少一种其它药剂选自抗炎剂和抗菌剂。

说明书

治疗炎症性肠病的方法

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求于2019年12月6日提交的美国临时申请号62/944,397的优先权，其内容在此为了所有目的通过引用以其整体并入。

技术领域

[0003] 本公开大体上涉及用于治疗炎症性肠病的方法。

背景技术

[0004] 炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，是慢性复发性胃肠道炎症性疾病。传统上，IBD患病率和发病率在北美和西欧很高，这些地区有超过350万人患有IBD。越来越多的流行病学研究表明，在IBD以前不常见的发展中国家和地区，如南美、东欧、亚洲和非洲，IBD的发病率可能正在迅速增加。随着在不同国家的持续高发病率，IBD已成为世界范围的新发疾病。

[0005] 作为特发性疾病，IBD的确切病因仍有待阐明。然而，已知起因(环境、宿主遗传学、免疫系统和微生物组)之间的相互作用很重要。因此，IBD的治疗目标是诱导和维持症状和黏膜炎症的缓解。目前，IBD的主要治疗选择是5‑氨基水杨酸(5‑ASA)和皮质类固醇，然而已报道了包括头痛、呕吐、腹泻以及胰腺和肾脏问题的大量副作用。因此，急需用于治疗IBD的新的高效且低毒的治疗药物。

[0006] 发明概述

[0007] 本文提出了血红蛋白(如，YQ23(交联四聚体牛血红蛋白)和TBM1(包含双α链和两条β链的重组血红蛋白，其中双α链由SEQ ID NO:1组成且两条β链中的每一条都由SEQ ID NO:2组成)在DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型中的体内抗炎作用。结果提供了YQ23和TBM1的疗效数据，证明了血红蛋白作为抗炎药物的用途。

[0008] 第一方面，本文提供的是用于在需要其的受试者中治疗炎症性肠病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的血红蛋白。

[0009] 在第一方面的第一实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中炎症性肠病选自溃疡性结肠炎(UC)、未确定型结肠炎、克罗恩病(CD)、淋巴细胞性结肠炎、显微镜下结肠炎、胶原性结肠炎、自身免疫性肠病、过敏性胃肠病和嗜酸性胃肠病。

[0010] 在第一方面的第二实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中炎症性肠病选自UC、CD和未确定型结肠炎。

[0011] 在第一方面的第三实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中炎症性肠病是CD。

[0012] 在第一方面的第四实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中炎症性肠病是UC。

[0013] 在第一方面的第五实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中受试者具有12‑15g/dl或更高的循环血红蛋白浓度。

[0014] 在第一方面的第六实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中血红蛋白经腹膜内施用。

[0015] 在第一方面的第七实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中血红蛋白经静脉内施用。

[0016] 在第一方面的第八实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中血红蛋白具有大于24mm Hg的p50。

[0017] 在第一方面的第九实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中血红蛋白具有大于30mm Hg的p50。

[0018] 在第一方面的第十实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中血红蛋白是牛、人、犬、猪或马血红蛋白。

[0019] 在第一方面的第十一实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中血红蛋白是天然存在的血红蛋白、经修饰的血红蛋白、重组血红蛋白或经修饰的重组血红蛋白。

[0020] 在第一方面的第十二实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中血红蛋白是交联血红蛋白或重组血红蛋白。

[0021] 在第一方面的第十三实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中血红蛋白是非聚合交联血红蛋白或包含双α链和两条β链的重组血红蛋白。

[0022] 在第一方面的第十四实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中血红蛋白是非聚合富马酰基交联牛血红蛋白。

[0023] 在第一方面的第十五实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中血红蛋白是包含双α链和两条β链的重组血红蛋白，其中双α链包含与SEQ ID NO:1具有至少98.93％序列同源性的多肽序列；并且两条β链中的每一条都包含与SEQ ID NO:2具有至少97.94％序列同源性的多肽序列。

[0024] 在第一方面的第十六实施方案中，本文提供的是第一方面的第十五实施方案的方法，其中炎症性肠病选自UC、CD和未确定型结肠炎；并且血红蛋白具有30‑50mm Hg的p50。

[0025] 在第一方面的第十七实施方案中，本文提供的是第一方面的第十五实施方案的方法，其中炎症性肠病选自UC、CD和未确定型结肠炎；并且血红蛋白具有20‑30mm Hg的p50。

[0026] 在第一方面的第十八实施方案中，本文提供的是第一方面的第十七实施方案的方法，其中重组血红蛋白包含双α链和两条β链，其中双α链包含由SEQ ID NO:1组成的多肽序列；并且两条β链中的每一条都包含由SEQ ID NO:2组成的多肽序列。

[0027] 在第一方面的第十九实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其还包括向受试者共同施用治疗有效量的至少一种药剂，其中至少一种药剂选自抗炎剂和抗菌剂。

[0028] 附图简述

[0029] 应当理解，本文所述的附图仅用于说明目的。附图不一定按比例绘制，重点通常放在阐明本教导的原理上。附图不旨在以任何方式限制本公开的范围。

[0030] 图1A描绘根据本文所述某些实施方案的示例性治疗方案(i.p.注射实验)。

[0031] 图1B描绘显示用于下述实验的YQ23和TBM1的剂量表(i.p.注射实验)。

[0032] 图2A描绘显示7天时间内施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的摄食量图(i.p.注射实验)。

[0033] 图2B描绘显示7天时间内施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的摄水量图(i.p.注射实验)。

[0034] 图2C描绘显示7天时间内施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的体重图(i.p.注射实验)。

[0035] 图2D描绘显示7天时间内施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的疾病活动指数(DAI)图(i.p.注射实验)。

[0036] 图2E描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠IBD模型的结肠长度数据(i.p.注射实验)。

[0037] 图2F描绘显示从7天时间内施用载体、YQ23和TBM1的小鼠IBD模型分离的结肠图片(i.p.注射实验)。

[0038] 图2G描绘显示使用H&E染色取自施用载体、YQ23和TBM1的小鼠IBD模型的结肠组织进行的组织学分析图片(i.p.注射实验)。

[0039] 图2H描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的脾脏系数数据(i.p.注射实验)。

[0040] 图2I描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的胸腺系数数据(i.p.注射实验)。

[0041] 图2J描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的肝脏系数数据(i.p.注射实验)。

[0042] 图2K描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的肾脏系数数据(i.p.注射实验)。

[0043] 图2L描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的心脏系数数据(i.p.注射实验)。

[0044] 图2M描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的肺系数数据(i.p.注射实验)。

[0045] 图3A描绘根据本文所述某些实施方案的示例性治疗方案(i.v.注射实验)。

[0046] 图3B描绘显示用于下述实验的YQ23和TBM1的剂量表(i.v.注射实验)。

[0047] 图4A描绘显示7天时间内施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的体重图(i.v.注射实验)。

[0048] 图4B描绘显示7天时间内施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的疾病活动指数(DAI)图(i.v.注射实验)。

[0049] 图4C描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠IBD模型的结肠长度数据(i.v.注射实验)。

[0050] 图4D描绘显示使用H&E染色取自施用载体、YQ23和TBM1的小鼠IBD模型的结肠组织进行的组织学分析图片(i.v.注射实验)。

[0051] 图4E描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的脾脏系数数据(i.v.注射实验)。

[0052] 图4F描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的胸腺系数数据(i.v.注射实验)。

[0053] 图4G描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的肝脏系数数据(i.v.注射实验)。

[0054] 图4H描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的肾脏系数数据(i.v.注射实验)。

[0055] 图4I描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的心脏系数数据(i.v.注射实验)。

[0056] 图4J描绘施用载体、YQ23和TBM1的小鼠的肺系数数据(i.v.注射实验)。

[0057] 图5描绘TBM1的双α球蛋白链的多肽序列(SEQ ID NO:1)。

[0058] 图6描绘TBM1的β球蛋白链的多肽序列(SEQ ID NO:2)。

[0059] 发明详述

[0060] 定义

[0061] 如本文所用，术语“重组血红蛋白”表示具有至少约65kDa分子大小的血红蛋白分子和/或其变体，并且通过标准分子生物学技术合成，而不是从任何动物或人类来源分离或纯化的。

[0062] 如本文所用，术语“蛋白”或“多肽”表示由两种或更多种氨基酸单体和/或其类似物组成的有机聚合物。术语“多肽”包括任何长度的氨基酸聚合物，包括全长蛋白和肽，以及它们的类似物和片段。三个或更多个氨基酸的多肽又被称为寡肽。如本文所用，术语“氨基酸”、“氨基酸单体”或“氨基酸残基”是指二十种天然存在的氨基酸中的任何一种，包括具有非天然侧链的合成氨基酸，并且包括D和L光学异构体。可互换使用的术语“氨基酸类似物”和“类似物”是指其中一个或多个单个原子已被不同原子、同位素或被不同官能团取代但在其他方面与其天然氨基酸类似物相同，并且具有与其天然氨基酸类似物相似的化学和/或物理性质。

[0063] 如本文所用，术语“变体”是指不同于参考多肽或多核苷酸序列但保留其基本特性的多肽或多核苷酸序列。通常，变体与参考多肽或多核苷酸序列总体非常相似且许多区域相同。

[0064] 例如，变体可包含具有至少一个保守氨基酸取代的亲本多肽序列的氨基酸序列。可选择地或另外地，变体可包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本多肽序列的氨基酸序列。在这种情况下，非保守氨基酸取代优选不干扰或抑制功能变体的生物学活性。非保守氨基酸取代可增强变体的生物活性，使得变体的生物活性与亲本多肽相比增加。

[0065] 如本文所用，术语“氨基酸修饰”表示氨基酸插入、取代或缺失等。所述多肽的氨基酸取代可以是保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是本领域已知的，并且包括这样的氨基酸取代，其中具有某些物理和/或化学特性的一种氨基酸被替换为具有相同或相似化学或物理特性的另一种氨基酸。例如，保守氨基酸取代可以是酸性/带负电荷的极性氨基酸取代另一种酸性/带负电荷的极性氨基酸(如，Asp或Glu)，具有非极性侧链的氨基酸取代另一种具有非极性侧链的氨基酸(如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)，碱性/带正电荷的极性氨基酸取代另一种碱性/带正电荷的极性氨基酸(如，Lys、His、Arg等)，具有极性侧链的不带电荷的氨基酸取代另一种具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(如，Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)，具有β‑支化侧链的氨基酸取代另一种具有β‑支化侧链的氨基酸(如，Ile、Thr和Val)，具有芳香族侧链的氨基酸取代另一种具有芳香族侧链的氨基酸(如，His、Phe、Trp和Tyr)等。

[0066] 如本文所用，术语“核苷酸修饰”是指核苷酸插入、取代、缺失等。

[0067] 术语“百分比序列同源性”，当用于提及多肽或多核苷酸序列时，是指多核苷酸之间和多肽之间的比较，并且通过在比较窗口中比较两条最佳对齐的序列来确定，其中与用于两条序列的最佳对齐的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中多核苷酸或多肽序列的一部分可包含添加或缺失(即，缺口)。百分比通过以下来计算：确定在两条序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中较长序列的位置总数目，并将结果乘以100得到序列同源性百分比。使用本领域已知的各种序列比较算法和程序中的任何一种来评估同源性。这样的算法和程序包括但不限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、以及CLUSTALW(Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8):2444‑2448；Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215(3):403‑410；Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Res.22(2):4673‑4680；Higgins et al.1996,Methods Enzymol.266:383‑402；Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215(3):403‑410；Altschul et al.,1993,Nature Genetics 3:266‑272)。在某些实施方案中，蛋白和核酸序列同源性使用本领域所熟知的基本局部比对搜索工具(“BLAST”)来评估(参见，例如Karlin and Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2267‑2268；Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215:403‑410；Altschul et al.,1993,Nature Genetics 3:266‑
272；Altschul et al.,1997,Nuc.Acids Res.25:3389‑3402)。

[0068] 如本文所用，与本文所述化合物相关的术语“分离的”是指该化合物不在细胞或有机体中，并且该化合物与细胞或有机体中通常伴随它的一些或所有组分分离。

[0069] 如本文所用，与本文所述化合物样品相关的术语“基本上纯”是指样品含有至少60重量％的化合物。在某些实施方案中，样品含有至少70重量％的化合物；至少75重量％的化合物；至少80重量％的化合物；至少85重量％的化合物；至少90重量％的化合物；至少95重量％的化合物；或至少98重量％的化合物。

[0070] 如本文所用，与本文所述化合物样品相关的术语“基本上不含基质”是指样品含有少于5重量％的基质。在某些实施方案中，样品含有少于4重量％的基质；少于3重量％的基质；少于2重量％的基质；少于1％重量的基质；少于0.5重量％的基质；少于0.1重量％的基质；少于0.05重量％的基质；或少于0.01重量％的基质。

[0071] 如本文所用，术语“治疗”(“treat”/“treating”/“treatment”等)是指减轻或改善疾病和/或与其相关的症状。应当理解，尽管不排除，治疗疾病或病症不需要完全消除与其相关的疾病、病症或症状。在某些实施方案中，治疗包括预防疾病或病症和/或与其相关的症状。

[0072] 术语“共同施用”(“co‑administration”/“co‑administering”)是指同时施用(两种或更多种治疗剂在同一时间施用)和不同时施用(一种或多种治疗剂在与施用其他一种或多种治疗剂不同的时间施用)，只要治疗剂在同一时间以一定程度存在于患者体内。

[0073] 如本文所用，术语“治疗有效量”意指由研究人员、兽医、临床医生或内科医生探索的在细胞培养物、组织系统、受试者、动物或人中引起生物、医学或成像反应的治疗剂或药剂的量，包括减轻正在治疗的疾病、病症或障碍的症状。

[0074] 如本文所用，术语“受试者”是指将成为或已经成为治疗、观察和/或实验对象的动物，通常是哺乳动物或人。当该术语与本文所述化合物的施用结合使用时，受试者已成为本文所述化合物的治疗、观察和/或施用的对象。

[0075] 如本文所用，术语“p50值”表示血红蛋白50％饱和时的氧分压。p50值与底物亲和力呈负相关；较低的值对应于较高的亲和力，反之亦然。

[0076] 本文提供了用于在需要其的受试者中治疗炎症性肠病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的血红蛋白的步骤。

[0077] 受试者可能患有选自以下的炎症性肠病：克罗恩病(CD)、胃十二指肠克罗恩病、溃疡性结肠炎(UC)、未确定型结肠炎、胶原性结肠炎、憩室炎、白塞氏(Behcet's)病、微量传播性(microalborne)结肠炎、溃疡性直肠炎、鼻窦炎、左结肠炎、全结肠炎、回肠结肠炎、回肠炎、淋巴细胞性结肠炎、显微镜下结肠炎、自身免疫性肠病、过敏性胃肠病、嗜酸性胃肠病和未定义结肠炎。CD和UC是IBD最常见的两种形式。IBD是消化系统的自身免疫性疾病。CD可存在于胃肠道的任何部分，包括末端回肠，并且会影响胃肠道的所有细胞类型。UC通常限于结肠和直肠，一般仅影响黏膜细胞。

[0078] 任何类型的血红蛋白都可与本文所述方法结合使用。血红蛋白可以是天然存在的血红蛋白、经修饰的血红蛋白、重组血红蛋白或经修饰的重组血红蛋白。在某些实施方案中，血红蛋白来源于牛、人、犬、猪、马血血红蛋白或其亚单位。在某些实施方案中，血红蛋白从血液中分离或经转基因产生。

[0079] 血红蛋白可以是分离的、基本上纯的和/或基本上不含基质的。

[0080] 与本文所述方法结合使用的经修饰的血红蛋白包括具有一种或多种选自以下修饰的血红蛋白：聚乙二醇化和分子内和/或分子间交联(如，具有戊二醛、癸二酰基、富马酰基、琥珀酰基、三甲酰基(trimesyl)等)。

[0081]

[0082] 重组血红蛋白可以是天然存在的血红蛋白或包括一个或多个突变，例如一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，或共价连接球蛋白亚基(如，产生双α球蛋白亚基和/或二β‑球蛋白亚基)。在某些实施方案中，血红蛋白是包含双α链和两条β链的重组血红蛋白。

[0083] 双α链可包含与SEQ ID NO:1具有至少98.93％序列同源性的多肽序列，其中SEQ ID NO:1的第1位和第143位氨基酸必须是甲硫氨酸，SEQ ID NO:1的第29位和第171位氨基酸必须是苯丙氨酸，以及SEQ ID NO:1的第58位和第200位氨基酸必须是谷氨酰胺。

[0084] 双α链可包含与SEQ ID NO:1具有至少98.93％序列同源性的多肽序列。与SEQ ID NO:1具有至少98.93％序列同源性的多肽可指具有至多三个氨基酸修饰的多肽，即相对于SEQ ID NO:1具有0、1、2或3个氨基酸修饰。在某些实施方案中，双α链包含与SEQ ID NO:1具有至少99.29％序列同源性的多肽序列。具有至少99.29％序列同源性的多肽可具有至多两个氨基酸修饰，即相对于SEQ ID NO:1具有0、1或2个氨基酸修饰。在某些实施方案中，双α链包含与SEQ ID NO:1具有至少99.64％序列同源性的多肽序列。具有至少99.64％序列同源性的多肽可具有至多一个氨基酸修饰，即相对于SEQ ID NO:1具有0或1个氨基酸修饰。在某些实施方案中，双α链包含SEQ ID NO:1的多肽序列。在某些实施方案中，双α链由SEQ ID NO:1的多肽序列组成。一个、两个或三个氨基酸修饰可出现于SEQ ID NO:1中存在的任何氨基酸处，除了SEQ ID NO:1的第1位、第29位、第58位、第143位、第171位和第200位，其中SEQ ID NO:1的第1位和第143位氨基酸必须是甲硫氨酸，SEQ ID NO:1的第29位和第171位氨基酸必须是苯丙氨酸，以及SEQ ID NO:1的第58位和第200位氨基酸必须是谷氨酰胺。

[0085] 两条β链中的每一条都可包含与SEQ ID NO:2具有至少97.94％序列同源性的多肽序列。具有至少97.94％序列同源性的多肽可具有至多三个氨基酸修饰，即相对于SEQ ID NO:2具有0、1、2或3个氨基酸修饰。在某些实施方案中，两条β链中的每一条都包含与SEQ ID NO:2具有至少98.63％序列同源性的多肽序列。具有至少98.63％的序列同源性的多肽可具有至多两个氨基酸修饰，即相对于SEQ ID NO:2具有0、1或2个氨基酸修饰。在某些实施方案中，两条β链中的每一条都包含与SEQ ID NO:2具有至少99.31％序列同源性的多肽序列。具有至少99.31％序列同源性的多肽可具有至多一个氨基酸修饰，即相对于SEQ ID NO:2具有0或1个氨基酸修饰。在某些实施方案中，两条β链中的每一条都包含SEQ ID NO:2的多肽序列。在某些实施方案中，一个、两个或三个氨基酸修饰可发生于SEQ ID NO:2中存在的任何氨基酸处，除了SEQ ID NO:2的第1位，它必须是甲硫氨酸。

[0086] 在某些实施方案中，血红蛋白是美国专利号10,752,672中所述的重组血红蛋白，其通过引用以其整体并入本文。

[0087] 在某些实施方案中，血红蛋白是包含双α链和两条β链的重组血红蛋白，其中双α链包含SEQ ID NO:1，并且两条β链中的每一条都包含SEQ ID NO:2。在某些实施方案中，血红蛋白是包含双α链和两条β链的重组血红蛋白，其中双α链由SEQ ID NO:1组成，并且两条β链中的每一条都由SEQ ID NO:2组成。

[0088] 在某些实施方案中，血红蛋白是经修饰的血红蛋白，为富马酰基交联非聚合血红蛋白。在某些实施方案中，富马酰基交联非聚合血红蛋白包含一个或多个富马酰基交联。在某些实施方案中，富马酰基交联非聚合血红蛋白经热处理。

[0089] 在某些实施方案中，经修饰的血红蛋白是美国专利号7,932,356和US8,048,856中所述的α‑α富马酰基交联血红蛋白，其在此通过引用以其整体并入。

[0090] 在某些实施方案中，经修饰的血红蛋白是包含大于10％、大于20％、大于30％、大于40％或大于50％α‑α交联的富马酰基交联血红蛋白。在某些实施方案中，经修饰的血红蛋白是具有10‑60％；10‑70％；10‑50％、10‑40％、10‑30％或10‑20％α‑α交联的富马酰基交联牛血红蛋白。

[0091] 在某些实施方案中，经修饰的血红蛋白是美国专利号8,106,011中所述的β‑β富马酰基交联血红蛋白，其通过引用以其整体并入本文。

[0092] 在某些实施方案中，经修饰的血红蛋白是包含大于10％、大于20％、大于30％、大于40％或大于50％β‑β交联的富马酰基交联牛血红蛋白。在某些实施方案中，经修饰的血红蛋白是具有10‑60％；10‑70％；10‑50％、10‑40％、10‑30％或10‑20％β‑β交联的富马酰基交联牛血红蛋白。

[0093] 血红蛋白可具有任何p50值。在某些实施方案中，p50值为10至50；20至50；30至50；20至45；或20至40；或40至50mmHg。

[0094] 可选择地，红细胞可代替血红蛋白在本文所述方法中施用于受试者。

[0095] 本文中血红蛋白的施用方式可以是将药剂递送于受试者的任何合适途径，例如肠胃外施用，如皮内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下、肺；经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)；使用片剂、胶囊、溶液、悬浮液、粉末、凝胶、颗粒的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、药筒、微型泵中；或本领域技术人员理解的本领域公知的其他方式。特定部位施用可通过例如以下来实现：关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、颊部、舌下、鼻内或经皮递送。在某些实施方案中，将血红蛋白经腹膜内施用于受试者。

[0096] 待施用的最佳剂量和给药方案可由本领域技术人员容易地确定，并且将随着施用方式、制剂的强度和疾病状况的进展而变化。此外，与正在治疗的特定患者相关的因素，包括患者的性别、年龄、体重、饮食、身体活动、施用时间和伴随疾病，将导致需要调整剂量和/或方案。在某些实施方案中，血红蛋白以每天一次、每周一次、每周两次、每周三次、每月一次或每月两次施用于受试者。

[0097] 在某些实施方案中，用于在需要其的受试者中治疗炎症性肠病的方法包括向受试者共同施用治疗有效量的血红蛋白和治疗有效量的抗炎剂的步骤。

[0098] 抗炎剂可以是本领域已知的任何抗炎剂。在某些实施方案中，抗炎剂是可用于治疗IBD或IBS的任何抗炎剂。示例性抗炎剂包括非甾体类抗炎药物(NSAID)、皮质类固醇、抗生素、免疫调节剂和生物学家族。示例性抗炎剂包括但不限于氨基水杨酸盐(aminosalcylate)，如5‑氨基水杨酸，柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，巴柳氮
(balsalazide)，奥沙拉秦(olsalazine)；类固醇，如布地奈德(budesonide)，地塞米松(dexamethasone)(如，21‑醋酸酯)，倍他米松(betamethasone)(如，17‑戊酸酯)，新戊酸替可的松(thixocortol pivalate)，曲安西龙(triamcinolone)，曲安奈德(triamcinolone Acetonide)(21‑棕榈酸酯，双醋酸酯或hexasatonide)，莫米松(mometasone)，安西奈德(amcinonide)，地奈德(desonide)，氟西奈德(fluorocinonide)，哈西奈德(hascinonide)，氟可龙(fluorocortolone)，氢化可的松(hydrocortisone)，丙酸氟替卡松(fluticasone)和甲基强的松龙(methylprednisolone)；免疫抑制剂，如他克莫司(tacrolimus)，硫唑嘌呤(azathioprine)，米托蒽醌(mitoxantrone)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，吗替麦考酚酯(mycophenolate mopetil)或雷帕霉素(rapamycin)；以及TNF拮抗剂，如英夫利昔单抗(infliximab)和阿达木单抗(adalimumab)。

[0099] 在某些实施方案中，用于在需要其的受试者中治疗炎症性肠病的方法还包括向受试者共同施用治疗有效量的抗菌剂。

[0100] 可使用常规用于IBD的任何抗菌剂。合适的抗菌剂的选择完全在本领域普通技术人员的技术范围内。示例性抗菌剂包括但不限于青霉素(penicillin)、头孢菌素(cephalosporin)、polyamicin、利福平(rifampicin)、lipamammine(pidacommaicin)、喹诺酮(quinolone)、磺胺(sulphonamide)、脂肽(Lipopeptides)、甘氨酸酯(glycinates)和羟吲哚(oxindole)。

[0101] 本文所述血红蛋白可根据本领域熟知的治疗方案施用。对于本领域技术人员显而易见的是，本文所述血红蛋白和抗炎剂的施用可根据正在治疗的疾病和抗炎剂对该疾病的已知作用而变化。此外，根据熟练临床医生的知识，治疗方案(如，施用的剂量和次数)可鉴于观察到的所施用治疗剂(即，抗炎剂)对受试者的作用和鉴于观察到的疾病对所施用血红蛋白的反应而变化。

[0102] 此外，血红蛋白和抗炎剂和/或抗菌剂通常不需要在同一药物组合物中施用，并且可能由于不同的物理和化学特性而必须通过不同途径施用。例如，本文所述血红蛋白可经静脉内施用以产生和维持良好的血液水平，而抗炎剂和/或抗菌剂可经口服施用。在可能的情况下，在同一药物组合物中确定施用的方式和施用的适当性完全在熟练临床医生的知识范围内。初始施用可根据本领域已知的既定方案进行，然后熟练临床医生可基于观察到的效果修改剂量、施用方式和施用次数。

[0103] 抗炎剂和/或抗菌剂的具体选择将取决于主治医生的诊断和他们对患者状况和适当治疗方案的判断。

[0104] 血红蛋白和抗炎剂和/或抗菌剂可同时(如，同时地、基本上同时地或在同一治疗方案内)或依次施用，这取决于炎症性肠病的性质、患者的状况、以及待与血红蛋白结合施用的抗炎剂和/或抗菌剂的实际选择(即，在单一治疗方案中)。

[0105] 如果血红蛋白和抗炎剂和/或抗菌剂不是同时或基本上同时施用，那么血红蛋白和抗炎剂和/或抗菌剂的最佳施用顺序可能由于不同疾病或病症而不同。因此，在某些情况下，可先施用血红蛋白，然后施用抗炎剂和/或抗菌剂；并且在其他情况下，可先施用抗炎剂和/或抗菌剂，然后施用血红蛋白。这种交替施用可在单一治疗方案中重复。在评估所治疗的疾病和患者的状况后，治疗方案期间每种治疗剂的施用顺序和重复施用次数的确定完全在熟练医生的知识范围内。例如，可先施用抗炎剂和/或抗菌剂，然后施用血红蛋白继续治疗，在确定有利的情况下，接着施用抗炎剂和/或抗菌剂并依此类推，直到治疗方案完成。

[0106] 因此，根据经验和知识，执业医生可随着治疗进展根据个体患者的需要修改施用治疗的组分(血红蛋白和抗炎剂和/或抗菌剂)的各个方案。

[0107] 在某些实施方案中，受试者是犬科动物、猫科动物、牛科动物、马科动物、非人灵长类动物或人类。在某些实施方案中，受试者是人类。

[0108] 在某些实施方案中，受试者没有遭受或因其他原因需要输血，如由于外伤失血。受试者可具有对于成年女性为12g/dl或更高，或对于成年男性为13g/dl或更高，或高于100g/l或高于70至80g/L的循环血红蛋白浓度。在某些实施方案中，受试者具有11‑15g/dl；12‑15g/dl、12‑14g/dl、13‑14g/dl或更高的循环血红蛋白浓度。

[0109] 材料和方法

[0110] YQ23是稳定的非聚合α‑α富马酰基交联四聚体牛血红蛋白(65kDa)，具有不可检出/低水平的二聚体血红蛋白(32kDa)、磷脂、DNA杂质和蛋白杂质。YQ23的浓度可为约10g/dL，其pH范围为7.4‑8.4的范围。渗透压和粘度(37℃)分别为250‑340mosmol/kg和>0.9厘泊。YQ23的p50值为～40mmHg。YQ23及其制备描述于美国专利号7,932,356和美国专利号8,048,856中。

[0111] TBM1是重组人血红蛋白，包含双α球蛋白亚基(SEQ ID NO:1)和两个β球蛋白亚基(SEQ ID NO:2)。TBM1的p50值为～20‑35mmHg。TBM1及其制备描述于美国专利号10,752,672中。

[0112] 动物研究

[0113] 雄性和雌性野生型C57BL/6J小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor,ME,USA)，使其交配以在动物设施中维持近交系繁殖群。将所有小鼠饲养于屏障动物房中，空调温度为20±2℃，湿度为55±10％，12h光照/黑暗周期。食物和水可随意获得。

[0114] DSS诱导的急性结肠炎和评估

[0115] (1)药物施用‑腹膜内注射

[0116] 如前所述[Wong,W.Y.,et al.,Proteomic profiling of dextran sulfate sodium induced acute ulcerative colitis mice serum exosomes and their immunomodulatory impact on macrophages.Proteomics,2016.16(7):p.1131‑45，具有少量修改]进行急性结肠炎动物研究。将8周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠随机分为6组(每组n＝4‑5)，并通过在饮用水中提供2.5％w/v DSS(试剂级；36 000‑50  000Da；MP Biomedicals，Solon，OH，USA)来诱导小鼠急性结肠炎。小鼠通过每天腹膜内注射载体、YQ23‑LD(800mg/kg)、YQ23‑MD(1000mg/kg)、YQ23‑HD(1000mg/kg)或TBM1(1000mg/kg)连续7天进行治疗。还包括用载体处理的未诱导对照组(n＝3)。每天记录体重、摄食量和摄水量。
如前所述[Wong,W.Y.,et al.,Gynostemma pentaphyllum saponins attenuate 
inflammation in vitro and in vivo by inhibition of NF‑kappaB and STAT3 signaling.Oncotarget,2017.8(50):p.87401‑87414]确定DAI。DAI评分系统是体重减轻、粪便粘稠度和粪便可见血的评分总和(体重减轻：0–无体重减轻，1–1‑5％，2–6‑10％，3–11‑
20％,4‑<20％；粪便粘稠度：0–正常，2–松散，4–腹泻；粪便可见血：0–无，2–轻微出血，4–严重出血)。第7天处死小鼠，取出肠并测量结肠长度。结肠然后用PBS清洗，在福尔马林溶液中固定，并如所述[Tai,W.C.,et al.,Mechanistic study of the anti‑cancer effect of Gynostemma pentaphyllum saponins in the Apc(Min/+)mouse model.Proteomics,
2016.16(10):p.1557‑69]使用H&E染色进行组织学分析。

[0117] (2)药物施用‑静脉内注射

[0118] 将8周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠随机分为5组(每组n＝5)，并通过在饮用水中提供2.5％w/v DSS诱导小鼠急性结肠炎。小鼠每2天通过静脉内注射载体、YQ23‑MD(1000mg/kg)、YQ23‑HD(1500mg/kg)或TBM1(1500mg/kg)进行治疗(7天后结束)。还包括用载体处理的未诱导对照组(n＝5)。每天记录体重和DAI评分。第7天处死小鼠，取出肠并测量结肠长度。结肠然后用PBS清洗，在福尔马林溶液中固定，并使用H&E染色进行组织学分析。

[0119] 统计分析

[0120] 使用学生t检验进行统计分析。统计显著性表示为*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。数据以三个独立实验的平均值±SD(体外实验)或平均值±SEM(体内实验)来表示。

[0121] 结果

[0122] 为了评估YQ23和TBM1在IBD中的作用，我们采用DSS诱导的急性结肠炎动物模型(用于研究IBD的常用动物模型)来评估化合物的抗炎作用。

[0123] (1)药物施用‑腹膜内注射

[0124] 从诱导后第4天开始，观测到小鼠的相对体重显著降低，并且在用YQ23治疗的小鼠中观测到剂量依赖性挽救效应(图2C)。实验结束时，用载体处理的小鼠体重减轻了20％，而用YQ23‑低剂量(LD)(800mg/kg)、YQ23‑中剂量(MD)(1,000mg/kg)和YQ‑23‑高剂量(HD)(1500mg/kg)治疗的小鼠体重分别减轻了17％、15％和14％。TBM1(1,000mg/kg)显示与YQ23‑HD相似的效应。

[0125] 小鼠的整体状况还通过DAI(相对体重、粪便粘稠度和粪血的综合评分)来评估。如图2D所示，用载体处理的小鼠显示DAI评分迅速增加，表明疾病进展迅速。对于用YQ23治疗的小鼠，再次观测到剂量依赖性效应。实验结束时，载体处理的小鼠的平均DAI评分为8.25，相比之下，用YQ23‑LD、YQ23‑MD和YQ‑23‑HD治疗的小鼠的评分分别为7.8、6.6和6.2(图2D)。此外，实验期间，我们未观测到用不同剂量的YQ23或TBM1治疗的小鼠的摄食量和摄水量的显著抑制(图2A‑2B)。

[0126] 由于结肠缩短是用DSS诱导的小鼠的关键特征之一，我们检查了用YQ23治疗的DSS诱导小鼠的结肠长度。与载体处理的小鼠相比，用YQ23‑MD或YQ23‑HD治疗的小鼠的结肠长度分别增加了10％和16％。TBM1仅轻度增加小鼠的结肠长度(图2E‑2F)。组织学分析还显示YQ23的有益作用。来自载体处理的DSS诱导小鼠的结肠切片显示典型的急性结肠炎组织病理学特征，包括隐窝缺失、炎症细胞浸润和上皮细胞结构的破坏。用YQ23或TBM1治疗改善了DSS诱导的损伤，更重要的是，在用YQ23治疗的小鼠中观测到剂量依赖性效应(图2G)。

[0127] 我们还检查了重要器官(脾脏、胸腺、肝脏、肾脏、心脏和肺)的重量及其总体形态。如图2H‑2M所示，在用不同剂量的YQ23和TBM1治疗的小鼠中，未观测到器官重量和器官形态的显著变化(数据未显示)。总之，我们的结果表明YQ23和TBM1可开发为用于治疗IBD的潜在抗炎药物，没有急性毒性。

[0128] (2)药物施用‑静脉内注射

[0129] 从诱导后第5天开始，在用YQ23、TBM1和DSS治疗的小鼠中观测到相对体重显著降低(图4A)。实验结束时，用载体处理的小鼠体重减轻了17％，而用YQ23(1500mg/kg)、TBM1(1500mg)和YQ23(1000mg/kg)治疗的小鼠体重分别减轻了12％、12％和13％，TBM1显示与YQ23相似的效应。

[0130] 小鼠的整体状况还通过DAI进行评估。如图4B所示，用载体处理的小鼠显示DAI评分迅速增加，表明疾病进展迅速。对于用YQ23治疗的小鼠，再次观测到剂量依赖性效应。我们观测到用YQ23和TBM1治疗的小鼠的改善(图4B)。

[0131] 与载体处理的小鼠相比，用YQ23(1000mg/kg)或YQ23(1500mg/kg)或TBM1(1500mg/kg)治疗的小鼠的结肠长度分别增加了7％、13.7％和2.3％(图4C)。组织学分析还显示YQ23和TBM1的有益效应。用YQ23或TBM1治疗改善了DSS诱导的损伤(图4D)。

[0132] 我们还检查了重要器官(脾脏、胸腺、肝脏、肾脏、心脏和肺)的重量及其总体形态。如图4E‑4J所示，用不同剂量的YQ23和TBM1进行i.v.注射治疗的小鼠中，未观测到器官重量和器官形态的显著变化(数据未显示)。

[0133] 讨论

[0134] 作为慢性复发性胃肠炎症性疾病，IBD的治疗目标是诱导和维持症状和粘膜炎症的缓解，最终改善IBD患者的生活质量。目前，5‑ASA和皮质类固醇是IBD的主要治疗选择。然而，来自这些治疗的副作用和不良事件会阻碍它们的治疗选择。在过去几年中，许多新的治疗方案已经开发出来或正在进行临床试验，包括诸如抗‑TNF或抗‑IL‑12/23抗体的免疫疗法。尽管已表明这些药物非常有效和安全，但它们不能治疗疾病的根本原因，并且仅对部分人群有效。随着IBD的发病率和患病率在世界范围内持续上升，对治疗该疾病的强效、无毒和有效疗法的需求也在增加。

[0135] YQ23是稳定的非聚合交联四聚体血红蛋白，它可用作氧载体。我们通过利用DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型评估了YQ23和重组蛋白TBM1的抗炎作用。该模型是公认的IBD研究动物模型，其模拟IBD患者的疾病表现和组织病理学特征，使其优于体内研究的其他动物模型。载体治疗的小鼠显示典型的急性结肠炎表现，包括体重减轻、结肠长度缩短和DAI增加。YQ23和TBM1治疗后，我们观测到相对体重减轻、结肠缩短和DAI的显著改善。对小鼠结肠的显微镜评估表明，YQ23和TBM1治疗改善了DSS诱导的隐窝缺失、炎性细胞浸润和上皮细胞结构的破坏。还观测到YQ23对上述参数的剂量依赖性效应。值得注意地，我们未观测到由YQ23和TBM1治疗引起的任何急性毒性，因为经历YQ23或TBM1治疗的小鼠未显示摄食量和摄水量的减少或重要器官形态和重量的改变。

[0136] 总之，我们为开发YQ23和TBM1作为治疗IBD和其他炎症性疾病的抗炎药物提供了具体的初步数据。