本发明涉及经济海产贝类优良苗种制备技术领域，特别是一种可显著提高雌雄同体型扇贝种间杂交后代比例的墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交苗种制备方法。以连续选育墨西哥湾扇贝和紫扇贝的自交品系作为种贝；通过人工控制培育条件使两种贝性腺趋于同步成熟；催产紫扇贝种贝获得浓度大于106个/ml的高浓度精液；对上述性腺发育成熟的墨西哥湾扇贝种贝进行诱导催产，大量获得未受精或受精率低的卵子，将其与获得的紫扇贝高浓度精液进行种间杂交，规模化制备种间杂交一代苗种。本发明利用收集的大量墨西哥湾扇贝未受精或受精率低的卵，并用紫扇贝高浓度精液授精的方式进行种间杂交，该方法能够显著提高墨西哥湾扇贝和紫扇贝种间杂交效率。
1.一种墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交苗种制备方法，其特征在于：
a.以连续选育墨西哥湾扇贝和紫扇贝的自交品系作为种贝；
b.通过人工控制培育条件使两种贝性腺趋于同步成熟；
c.催产获得紫扇贝浓度大于10个/ml的高浓度精液；
d.对步骤b性腺发育成熟的墨西哥湾扇贝种贝进行诱导催产，大量获得未受精或受精率低的卵子，将其与步骤c获得的紫扇贝高浓度精液进行种间杂交，规模化获得种间杂交一代苗种；
所述墨西哥湾扇贝和紫扇贝的种贝分别为连续自交选育3代以上的高度自交品系；
所述高度自交品系为分别建立多个墨西哥湾扇贝和紫扇贝的自交家系，同种扇贝的家系选优后将幼虫混合培养至成体，并采用同样的方法连续选育、纯化3代以上，即作为种贝；
所述种贝为清洗干净后分别在水温较低的海水中适应1周，随后通过调控养殖水温和养殖条件，使上述两种贝的性腺成熟度趋于同步；所述使墨西哥湾扇贝种贝与紫扇贝种贝性腺成熟度趋于同步为将紫扇贝种贝暂养于15 ℃的海水中适应1周，墨西哥湾扇贝种贝暂养于12 ℃的海水中适应1周，墨西哥湾扇贝种贝暂养后以0.5 ℃/天的升温速率升温，待墨西哥湾扇贝的养殖水温达到紫扇贝的暂养水温后适应2周，随后对两种贝分别以每天升温
0.5 ℃，连续升温2 ℃后稳定2天，以促进扇贝精卵充分成熟，当养殖水温升至21 ℃时，停止升温并保持水温恒定（21 ± 0.5 ℃），使二者性腺成熟度趋于同步；
所述步骤c性腺发育成熟后将紫扇贝种贝阴干刺激30分钟，将其置于加入25 ℃过滤海水的水槽中产卵排精，待水槽中海水呈乳白色时，利用500目筛绢过滤，获得紫扇贝浓度大6
所述步骤d规模化种间杂交生产墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交一代苗种为分别通过集体产卵法或单个产卵法，进行种间杂交，进而获得种间杂交后代比例高、个体大、生长快、成活率高、抗逆性强的杂交一代扇贝苗种；其中，集体产卵法为2000个墨西哥湾扇贝种贝为一组集体诱导催产排出的卵子与步骤c获得的紫扇贝高浓度精液进行种间杂交，即墨西哥湾扇贝种贝集中排精后，在泼有高浓度紫扇贝精液的孵化池中产卵受精；单个产卵法为将每个墨西哥湾扇贝种贝排出的卵子与步骤c获得的紫扇贝高浓度纯精子进行种间杂交，即墨西哥湾扇贝集中排精后，单个放入烧杯中催产，产卵后立即倒入盛有紫扇贝高浓度精液的桶中受精。
2.按权利要求1所述的墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交苗种制备方法，其特征在于：所述集体产卵法：将上述紫扇贝精液加入含有25 ℃过滤海水的孵化池中，使紫扇贝精子密度达到3000～4000个/mL；将步骤b通过人工控制培育条件性腺趋于同步成熟后的墨西哥湾扇贝种贝阴干刺激30分钟后，置于25 ℃过滤海水的孵化池中30分钟集中排精，待墨西哥湾扇贝种贝集中排精后，将种贝浸入淡水池中3秒，然后将2000个墨西哥湾扇贝种贝一组置于含有步骤c所得紫扇贝精液的孵化池中产卵、受精，卵量达到30～40个/mL后迅速将墨西哥湾扇贝种贝移至下一个含有紫扇贝精液的孵化池中继续产卵、受精，待发现墨西哥湾扇贝种贝再次大量排精时抬出孵化池，并将下一组墨西哥湾扇贝种贝置于含有紫扇贝精液的孵化池中产卵、受精。
3.按权利要求1所述的墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交苗种制备方法，其特征在于：所述单个产卵法：取步骤c所得紫扇贝精液置于加有25 ℃过滤海水的100 L塑料桶中稀释5‑
10倍待用；将步骤b通过人工控制培育条件性腺趋于同步成熟的单个墨西哥湾扇贝种贝分别置于加有25 ℃海水的1 L烧杯中催产，直至扇贝产卵，将卵倒入上述含有紫扇贝精液的塑料桶中受精，受精10分钟后倒入孵化池中孵化，密度控制在30～40个/mL，孵化后在选育D型幼虫的时候控制养殖密度8～12个/mL。
4.一种权利要求1所述方法获得墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交苗种的应用，其特征在于：所述权利要求1所得墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交苗种在筏式养殖和底播养殖模式中均可应用，墨紫杂交一代扇贝具有较高的高温耐受性，可快速替代种质严重衰退的墨西哥湾扇贝在我国南方沿海推广养殖，进而提高南方沿海养殖扇贝的品质、产量和产值。
一种墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交苗种制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及经济海产贝类优良苗种制备技术领域，特别是一种可显著提高雌雄同体型扇贝种间杂交后代比例的墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交苗种制备方法。
背景技术
[0002] 墨西哥湾扇贝(Argopecten irradians concentricus)是一种原产于美国大西洋沿岸的雌雄同体型扇贝，于1991年引进中国并成功突破人工繁育，因其具有生长快、适温范围广、养殖周期短、出柱率高等特点，迅速在我国南方沿海推广开来。然而，20多年的全人工养殖，墨西哥湾扇贝种质退化严重，表现为个体小型化、抗逆性下降、成活率降低、出肉柱率低和产量降低等，严重制约了产业的健康、可持续发展。紫扇贝(Argopecten purpuratus)是原产于南太平洋的一种雌雄同体型扇贝，具有壳肌肥大、出肉率高、味道鲜美、壳型优美等优点。此外，墨西哥湾扇贝与紫扇贝均为Argopecten属，拥有相似的核型(5st+11t)和染色体数(32条)，因而二者有可能开展种间杂交育种。
[0003] 近年来，王春德团队将墨西哥湾扇贝与紫扇贝进行杂交，成功培育出经济性状优势极其显著的紫墨杂交一代扇贝。紫墨杂交一代扇贝具有以下特点，(1)杂交一代扇贝比同期同海域养殖的墨西哥湾扇贝体重提高约80％，且达到性成熟后可继续生长，可用于培育大规格扇贝。(2)杂交一代扇贝寿命延长，平均寿命在3龄以上，而墨西哥湾扇贝在第二年产卵后死亡率急剧升高；(3)杂交一代扇贝的耐高温能力提高，可以在我国南方海域推广养殖。(4)杂交一代扇贝表现为“雌性”或“雄性不育”，即性腺没有精区或排出的精子没有活力，杂交一代扇贝更多的能量用于生长和营养积累，味道更加鲜美。综上表明，规模化生产和养殖紫墨杂交一代苗种和商品贝可有效促进扇贝养殖业的快速发展，具有广阔的应用前景。
[0004] 然而，雌雄同体型扇贝催产时可同时产卵排精，且同种扇贝的精卵更容易受精，即容易发生自体受精或种内受精，因而利用常规的产卵方法会导致杂交后代比例不到5％，严重影响紫墨杂交一代扇贝的制种效率和养殖扇贝的总体产量，因此非常有必要开发提高墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交后代比例的技术。发明内容：
[0005] 本发明提出一种墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交苗种制备方法
[0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0007] 一种墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交苗种制备方法：
[0008] a.以连续选育的墨西哥湾扇贝和紫扇贝自交品系作为种贝；
[0009] b.通过人工控制培育条件使两种贝性腺趋于同步成熟；
[0010] c.催产获得紫扇贝浓度大于106个/mL的高浓度精液；
[0011] d.对步骤b性腺发育成熟的墨西哥湾扇贝进行诱导催产，大量获得未受精或受精率低的卵子，将其与步骤c获得的紫扇贝高浓度精液进行种间杂交，规模化制备紫墨种间杂交一代苗种。
[0012] 所述墨西哥湾扇贝和紫扇贝的种贝分别为连续自交选育3代以上的高度自交品系。
[0013] 所述高度自交品系为分别建立多个墨西哥湾扇贝和紫扇贝的自交家系，同种扇贝的家系选优后将幼虫混合培养至成体，并采用同样的方法连续选育、纯化3代以上，即作为种贝。
[0014] 进一步的说，所用墨西哥湾扇贝和紫扇贝为连续选育的自交品系，即每年3月中旬分别在墨西哥湾扇贝自交群体和紫扇贝自交群体中各取500枚性状优良的扇贝作为种贝，分别建立200个以上墨西哥湾扇贝和紫扇贝的自交家系，同种扇贝的所有家系选优后将幼虫混合培养至成体，并采用上述同样的方法连续选育、纯化3代以上，用于后续规模化生产紫墨杂交一代扇贝苗种。
[0015] 所述种贝为清洗干净后分别在水温较低的海水中适应1周，随后通过调控养殖水温和养殖条件，使上述两种贝的性腺成熟度趋于同步。
[0016] 所述使墨西哥湾扇贝种贝与紫扇贝种贝性腺成熟度趋于同步为将紫扇贝种贝暂养于15℃的海水中适应1周，墨西哥湾扇贝种贝暂养于12℃的海水中适应1周，暂养后首先对墨西哥湾扇贝种贝以0.5℃/天的升温速率升温，待墨西哥湾扇贝的养殖水温达到紫扇贝的暂养水温后适应2周，随后对两种贝分别以每天升温0.5℃，连续升温2℃后稳定2天，以促进扇贝精卵充分成熟，当养殖水温升至21℃时，停止升温并保持水温恒定(21±0.5℃)，使二者性腺成熟度趋于同步。
[0017] 进一步的说，每年12月中下旬，将性状优良的墨西哥湾扇贝自交品系和紫扇贝自交品系运回养殖车间，清洗干净后紫扇贝在15℃海水中暂养1周，墨西哥湾扇贝在12℃海水中暂养1周，随后通过调控养殖水温和饵料密度等养殖条件，使上述两种贝的性腺成熟度趋于同步。由于紫扇贝对低温的耐受性比墨西哥湾扇贝差，因而紫扇贝的暂养水温高，升温策略是优先给墨西哥湾扇贝升温，升温速率为0.5℃/天，待墨西哥湾扇贝的养殖水温达到紫扇贝的暂养水温(15℃)后适应2周，随后按照如下升温策略为两种贝升温：每天升温0.5℃，连续升温2℃后稳定2天，以促进扇贝精卵充分成熟，升温过程中持续观察上述两种贝的性腺发育情况，及时挑出少数性早熟的扇贝。当养殖水温升至21℃时，停止升温并保持水温恒定(21±0.5℃)，如果其中一种扇贝的性腺成熟度明显变快，则停止升温并减少微藻饵料和补充饵料(如鸡蛋黄)的投喂量，直至二者性腺趋于同步成熟。
[0018] 所述步骤c性腺发育成熟后将紫扇贝种贝阴干刺激30分钟，将其置于加入25℃过滤海水的水槽中产卵排精，待水槽中海水呈乳白色时，利用500目筛绢过滤除去少量紫扇贝6
的卵，获得紫扇贝浓度大于10个/mL高浓度的精液。
[0019] 所述步骤d规模化种间杂交生产墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交一代苗种为分别通过集体产卵法或单个产卵法，进行种间杂交制种，进而获得种间杂交后代比例高、个体大、生长快、成活率高、抗逆性强的杂交一代扇贝苗种；其中，集体产卵法为2000个墨西哥湾扇贝种贝为一组集体诱导催产排出的卵子与步骤c获得的紫扇贝高浓度精液进行种间杂交，即墨西哥湾扇贝集中排精后，在泼有高浓度紫扇贝精液的孵化池中产卵、受精；单个产卵法为将每个墨西哥湾扇贝种贝排出的卵子分别加入至步骤c获得的紫扇贝高浓度精液进行种间杂交，即墨西哥湾扇贝集中排精后，单个放入烧杯中催产，产卵后立即倒入盛有紫扇贝高浓度精液的桶中受精。
[0020] 所述集体产卵法：将上述紫扇贝精液加入含有25℃过滤海水的孵化池中，使紫扇贝精子密度达到3000～4000个/mL；将步骤b通过人工控制培育条件性腺趋于同步成熟的墨西哥湾扇贝种贝阴干刺激30分钟后，置于25℃过滤海水的孵化池中30分钟集中排精，待墨西哥湾扇贝种贝集中排精后，将种贝浸入淡水池中3秒杀精，然后将墨西哥湾扇贝种贝置于含有步骤c所得紫扇贝精液的孵化池中产卵、受精，卵量达到30～40个/mL后迅速将墨西哥湾扇贝种贝移至下一个含有紫扇贝精液的孵化池中继续产卵、受精，待发现墨西哥湾扇贝种贝再次大量排精时抬出孵化池，并将下一组墨西哥湾扇贝种贝置于含有紫扇贝精液的孵化池中产卵、受精，该方法培育的杂交扇贝所占比例在40％～60％。
[0021] 所述单个产卵法：取步骤c所得紫扇贝精液置于加有25℃过滤海水的100L塑料桶中稀释5～10倍；将步骤b通过人工控制培育条件性腺趋于同步成熟的单个墨西哥湾扇贝种贝分别置于加有25℃过滤海水的1L烧杯中催产，直至扇贝产卵，将卵倒入上述含有紫扇贝精液的塑料桶中受精，受精10分钟后倒入孵化池中孵化，密度控制在30～40个/mL，孵化后在选育D型幼虫的时候控制养殖密度8～12个/mL；较高的紫扇贝精液既能提高紫扇贝与墨西哥湾扇贝种间杂交后代的比例(60％～80％)，又不会导致胚胎畸形率和死亡率的升高。
[0022] 一种所述方法获得墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交苗种的应用，所述墨西哥湾扇贝与紫扇贝种间杂交苗种在筏式养殖和底播养殖模式中均可应用。
[0023] 本领域可知一般墨西哥湾扇贝与紫扇贝杂交后代的杂交率在30％，苗种的价格提高50％～100％，进而采用本发明方法获得苗种具有一定的推广意义。
[0024] 本发明所具有的优点：
[0025] 本发明利用大量墨西哥湾扇贝未受精或受精率低的卵，采用紫扇贝高浓度精液授精的方式进行杂交制种，从而培育生长快、个体大、成活率高、抗逆性强的种间杂交一代扇贝苗种，该方法能够显著提高墨西哥湾扇贝和紫扇贝种间杂交制种效率、规模化制备杂交优势显著的杂交苗种，具体表现为：
[0026] 1.本发明采用的经过自交纯化的墨西哥湾扇贝种贝和紫扇贝种贝进行杂交制种，可显著提高杂交一代扇贝的杂种优势，并显著提高苗种的生长率、变态率、成活率及抗逆性；
[0027] 2.本发明在育苗过程中利用高浓度紫扇贝精液与墨西哥湾扇贝卵子受精，一方面可显著提高后代的杂交率，又不会导致胚胎畸形率和死亡率升高；另一方面由于操作过程中控制了紫扇贝精液浓度，规模化生产过程中无需洗卵；
[0028] 3.紫墨杂交一代扇贝表现为雄性不育且其卵子受精率和孵化率均低，不适合用作种贝繁育后代，有利于保持扇贝的性状优势、防止近交衰退，以及保护扇贝育种企业的利益，促进产业的可持续发展；
[0029] 4.本发明方法获得紫墨杂交一代苗种具有生长快、变态率高、成活率高、抗逆性强等优势，苗种和商品贝价格均显著高于墨西哥湾扇贝，可显著提高扇贝养殖户的产量和经济效益。
具体实施方式
[0030] 以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
[0031] 本发明方法可用于规模化制备杂种优势极其显著的雌雄同体型扇贝种间杂交苗种，所得苗种生长优势显著、成活率高、抗逆性强。
[0032] 实施例1：
[0033] 2021年12月将墨西哥湾扇贝和紫扇贝各3000枚纳入山东烟台莱州育苗场育肥，上述墨西哥湾扇贝和紫扇贝为连续选育的自交品系，即每年3月中旬分别在墨西哥湾扇贝自交群体和紫扇贝自交群体中各取500枚性状优良的扇贝作为种贝，分别建立200个以上墨西哥湾扇贝和紫扇贝的自交家系，同种扇贝的所有家系选优后将幼虫混合培养至成体，并采用同样的方法连续选育、纯化3代以上作为自交品系；墨西哥湾扇贝(12℃的海水)和紫扇贝(15℃的海水)分别在较低水温的海水中暂养1周，然后优先给墨西哥湾扇贝升温，以0.5℃/天的升温速率升温，待墨西哥湾扇贝的养殖水温达到紫扇贝的暂养水温后适应2周，随后按照如下升温策略为两种贝升温：每天升温0.5℃，连续升温2℃后稳定2天，以促进扇贝精卵充分成熟，升温过程中持续观察上述两种贝的性腺发育情况，及时挑出少数性早熟的扇贝。当养殖水温升至21℃时，停止升温并保持水温恒定(21±0.5℃)，如果其中一种扇贝的性腺成熟度明显变快，则停止升温并减少微藻饵料和补充饵料(如鸡蛋黄)的投喂量，使二者性腺成熟度趋于同步。
[0034] 从上述获得的种贝中挑选性腺发育良好的紫扇贝自交品系200枚，阴干刺激30分钟后置于事先加入24℃过滤海水的400L水槽中产卵排精，待海水呈乳白色时用500目筛绢6
过滤获得紫扇贝高浓度(大于10个/mL)的精液；
[0035] 将上述紫扇贝精液加入含有24℃过滤海水的孵化池中，使紫扇贝精子密度达到3000～4000个/mL。
[0036] 同时，以墨西哥湾扇贝自交品系作为种贝，挑选种贝400枚并分成2组，每组分别取100枚置于网箱中，阴干刺激30分钟后，采用不同方式获得培育种间杂交一代扇贝，其中一组采用方法是将装有墨西哥湾扇贝种贝的网箱置于预先加入24℃过滤海水的水泥池中集中排精约30分钟，当发现种贝开始产卵后，将装有种贝的网箱置于淡水池中3秒钟杀死贝体上的精子；然后将墨西哥湾扇贝种贝置于事先加入紫扇贝精液的孵化池中产卵、受精，当发现种贝再次排精时迅速抬出网箱，停止产卵并通过搅动池水使精卵充分受精。利用该方法培育杂交一代扇贝1池，受精卵孵化密度在18～20个/mL。此后，参照墨西哥湾扇贝的培育流程进行紫墨杂交一代扇贝苗种培育。该方法培育的杂交扇贝所占比例在40％～60％，苗种价格可提高50％～100％。
[0037] 另一组采用方法是预先取上述获得的紫扇贝的精液加入24℃过滤海水稀释10倍，并取500mL上述稀释的紫扇贝精液倒入10L塑料桶中备用；将单个墨西哥湾扇贝种贝置于事先加入24℃过滤海水的1L烧杯中，若先排精则将之倒掉，将扇贝和烧杯浸入淡水桶中3秒钟杀精，然后再加入约500mL、24℃过滤海水催产，直到扇贝产卵，将卵倒入上述含有紫扇贝精液的10L塑料桶中受精，卵液倒满桶后倒入100L塑料桶中受精15分钟后将其倒入孵化池中孵化。利用该方法培育杂交一代扇贝1池，受精卵孵化密度控制在18～20个/mL。此后，参照墨西哥湾扇贝的培育流程进行杂交扇贝苗种培育。该方法培育的杂交扇贝所占比例在60％～80％，苗种价格可提高80％～150％。
[0038] 上述两种方式获得墨西哥湾扇贝与紫扇贝杂交一代扇贝在幼虫和稚贝阶段均表现出显著的生长优势和高成活率。在生长方面，杂交一代扇贝浮游幼虫的平均壳长比墨西哥湾扇贝幼虫大1.8μm/天，投放附着基前杂交一代扇贝苗种比墨西哥湾扇贝幼虫大约20μm。2021年12月于山东烟台养马岛海区进行了现场验收，采用方法(1)共获得扇贝400笼(400枚/笼)，其中杂交一代扇贝比例在53％；采用方法(2)共获得扇贝600笼(400枚/笼)，其中杂交一代扇贝比例在67％。此外，紫墨杂交一代商品贝规格和贝柱出肉率(壳高68.29±2.79mm，湿重56.84±5.25g，柱重5.97±0.83g)均显著优于墨西哥湾扇贝(壳高49.36±
2.32mm，湿重27.96±4.78g，柱重2.00±0.87g)，增产效果极其显著。
