一种用于强直性脊柱炎的组合物及其制备方法

摘要

本发明提出了一种用于强直性脊柱炎的组合物及其制备方法，属于医药技术领域，将狗脊、杜仲、续断、虎杖、秦艽、地龙、防己、黄柏、苍术、怀牛膝、生薏苡仁、土茯苓、连翘、土鳖虫粉碎得到中药粉后水煎得到中药提取物，固体残渣加入培养基中，接种长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌进行发酵处理，得到的发酵产物和得到的中药提取物、益生元组合物、丁酸酯淀粉、丹皮酚、淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物。本发明制得的组合物能强筋劲骨、健脾化湿、通络止痛、温肾强督、补肾助阳，起到很好的治疗和预防AS的效果。

权利要求

1.一种用于强直性脊柱炎的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.中药粉的混合：将狗脊、杜仲、续断、虎杖、秦艽、地龙、防己、黄柏、苍术、怀牛膝、生薏苡仁、土茯苓、连翘、土鳖虫按比例混合，粉碎，过筛，得到中药粉；

所述中药粉由以下原料按重量份制备而成：狗脊5‑15份、杜仲5‑15份、续断5‑15份、虎杖5‑15份、秦艽5‑15份、地龙5‑15份、防己5‑15份、黄柏5‑15份、苍术10‑15份、怀牛膝10‑15份、生薏苡仁15‑25份、土茯苓10‑20份、连翘10‑20份、土鳖虫5‑10份；

S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入水煎煮，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

S3.培养基的制备：将碳源、氮源和步骤S2中的滤渣加入水中混匀，PBS调节pH值，紫外线灭菌备用；

所述碳源、氮源、滤渣和水的质量比为5‑12:5‑10:25‑50:1000；所述pH值调节至7‑7.2；

S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划线，培养成菌种种子液；

8 9

所述菌种种子液中含菌量为10‑10 cfu/mL；所述培养条件为35‑38℃，微缺氧条件下，培养12‑18h；

所述微缺氧条件为氧含量为7‑12％，二氧化碳含量为3‑7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比；

S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，发酵培养，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

所述发酵培养条件为35‑38℃，微缺氧条件下，培养36‑48h；所述长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为3‑5％、2‑4％、2‑5％；

所述微缺氧条件为氧含量为7‑12％，二氧化碳含量为3‑7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比；

S6.益生元组合物的制备：将低聚果糖、水苏四糖、棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将步骤S2制得的中药提取物、步骤S5制得的发酵产物、步骤S6制得的益生元组合物、丁酸酯淀粉、丹皮酚、淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

所述低聚果糖、水苏四糖、棉子糖的质量比为5‑10:2‑4:1‑2；步骤S7中所述中药提取物、发酵产物、益生元组合物、丁酸酯淀粉、丹皮酚、淫羊藿苷的质量比为100‑200:50‑120:

10‑20:5‑20:3‑5:2‑3。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述过筛的筛网目数为150‑

200目。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述中药粉和水的质量比为

1：3‑5；所述煎煮次数为2‑3次。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述碳源选自琼脂、阿拉伯糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉中的至少一种；所述氮源选自鱼粉、酵母膏、蛋白胨、氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、氨基酸中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1.中药粉的混合：将5‑15重量份狗脊、5‑15重量份杜仲、5‑15重量份续断、5‑15重量份虎杖、5‑15重量份秦艽、5‑15重量份地龙、5‑15重量份防己、5‑15重量份黄柏、10‑15重量份苍术、10‑15重量份怀牛膝、15‑25重量份生薏苡仁、10‑20重量份土茯苓、10‑20重量份连翘、

5‑10重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过150‑200目筛，得到中药粉；

S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入3‑5倍质量的水煎煮2‑3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

S3.培养基的制备：将5‑12重量份碳源、5‑10重量份氮源和25‑50重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7‑7.2，紫外线灭菌备用；

S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划线，8

培养成菌种种子液，培养条件为35‑38℃，在微缺氧条件下，培养12‑18h，含菌量为10 ‑9

10cfu/mL；

S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为3‑5％、2‑4％、2‑5％，发酵培养，培养条件为35‑38℃，微缺氧条件下，培养36‑48h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

S6.益生元组合物的制备：将5‑10重量份低聚果糖、2‑4重量份水苏四糖、1‑2重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将100‑200重量份步骤S2制得的中药提取物、

50‑120重量份步骤S5制得的发酵产物、10‑20重量份步骤S6制得的益生元组合物、5‑20重量份丁酸酯淀粉、3‑5重量份丹皮酚、2‑3重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

微缺氧条件为氧含量为7‑12％，二氧化碳含量为3‑7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

说明书

一种用于强直性脊柱炎的组合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于强直性脊柱炎的组合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 强直性脊柱炎(ankylosingsporidylitis，AS)是风湿科、骨科常见疾病，以骶髂关节和脊柱附着点炎症为主要症状，以椎间盘纤维环及其附近结缔组织纤维化和骨化，以及关节强直为病变特点，属自身免疫性疾病。早期病变处关节有炎性疼痛，伴有关节周围肌肉痉挛，有僵硬感，晨起明显。也可表现为夜间疼，经活动或服止痛剂缓解。随着病情发展，关节疼痛减轻，而各脊柱段及关节活动受限和畸形，晚期整个脊柱和下肢变成僵硬的弓形，向前屈曲。

[0003] 目前控制AS治疗目的在于控制炎症，减轻或缓解症状，维持正常姿势和最佳功能位置，防止畸形。药物治疗多采用非甾体类抗炎药配合柳氮磺胺吡啶(SSZ)，有消炎止痛、减轻僵硬和肌肉痉挛作用，但副作用为胃肠反应、肾脏损害、延长出血时间、皮疹、血象及肝功改变等，并且副作用与剂量和使用时间明确相关。中药治疗代表药物为雷公藤多甙，副作用有胃肠反应、白细胞减少、月经紊乱及精子活力降低等。组方治疗辩证多从风寒湿痹和热痹入手，从寒者使用川乌、草乌、附子、全蝎，从热者黄柏、山栀、雷公藤、金刚藤，但上述药物均有一定毒性，副作用大，不利于长久服用，且口服，胃肠刺激更大。

[0004] 有研究发现，AS患者肠道菌群结构较正常人群发生了显著改变，其回肠末端与健康对照者相比，毛螺菌科、普雷沃氏菌科、理研菌科、紫单胞菌科、拟杆菌科这5个细菌家族的丰度较高(CostelloMe，等.Briefreport：intestinal dysbiosis in ankylosing spondylitis)。Wen等(Wen C，等.Quantitative metagenomics reveals unique gut microbiome biomarkers in ankylosing spondylitis)通过研究发现，拟杆菌、厚壁菌门、变形菌和放线菌是AS患者和健康对照者肠道菌群中的4个主要微生物群，但AS患者放线菌的丰度明显高于对照组，特别是双歧杆菌属，而梭菌和疣微菌门的丰度较低，同时革兰阴性肠杆菌和柠檬酸杆菌也相对较少。其中，AS患者体内放线菌富集，推测放线菌可能调节IκB‑α的泛素化。这将促使AS患者肠上皮中NF‑κB信号的激活和促炎因子的增加，从而促进AS的进展。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提出一种用于强直性脊柱炎的组合物及其制备方法，制得的组合物能强筋劲骨、健脾化湿、通络止痛、温肾强督、补肾助阳，起到很好的治疗和预防AS的效果。

[0006] 本发明的技术方案是这样实现的：

[0007] 本发明提供一种用于强直性脊柱炎的组合物的制备方法，将狗脊、杜仲、续断、虎杖、秦艽、地龙、防己、黄柏、苍术、怀牛膝、生薏苡仁、土茯苓、连翘、土鳖虫粉碎得到中药粉后水煎得到中药提取物，固体残渣加入培养基中，接种长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌进行发酵处理，得到的发酵产物和得到的中药提取物、益生元组合物、丁酸酯淀粉、丹皮酚、淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物。

[0008] 作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：

[0009] S1.中药粉的混合：将狗脊、杜仲、续断、虎杖、秦艽、地龙、防己、黄柏、苍术、怀牛膝、生薏苡仁、土茯苓、连翘、土鳖虫按比例混合，粉碎，过筛，得到中药粉；

[0010] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入水煎煮，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0011] S3.培养基的制备：将碳源、氮源和步骤S2中的滤渣加入水中混匀，PBS调节pH值，紫外线灭菌备用；

[0012] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划线，培养成菌种种子液；

[0013] S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，发酵培养，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0014] S6.益生元组合物的制备：将低聚果糖、水苏四糖、棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0015] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将步骤S2制得的中药提取物、步骤S5制得的发酵产物、步骤S6制得的益生元组合物、丁酸酯淀粉、丹皮酚、淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物。

[0016] 作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述中药粉由以下原料按重量份制备而成：狗脊5‑15份、杜仲5‑15份、续断5‑15份、虎杖5‑15份、秦艽5‑15份、地龙5‑15份、防己5‑15份、黄柏5‑15份、苍术10‑15份、怀牛膝10‑15份、生薏苡仁15‑25份、土茯苓10‑20份、连翘10‑20份、土鳖虫5‑10份；所述过筛的筛网目数为150‑200目。

[0017] 作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述中药粉和水的质量比为1：3‑5；所述煎煮次数为2‑3次。

[0018] 作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述碳源、氮源、滤渣和水的质量比为5‑12:5‑10:25‑50:1000；所述pH值调节至7‑7.2；所述碳源选自琼脂、阿拉伯糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉中的至少一种；所述氮源选自鱼粉、酵母膏、蛋白胨、氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、氨基酸中的至少一种。

[0019] 优选地，所述氨基酸选自苯丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲氨酸、异亮氨酸中的一种或几种混合。

[0020] 优选地，所述氨水浓度为25‑35wt％。

[0021] 优选地，所述铵盐选自氯化铵、硫酸铵、硝酸铵中的至少一种。

[0022] 优选地，所述硝酸盐选自硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、硝酸镁、硝酸铁、硝酸铜、硝酸锰中的至少一种。

[0023] 作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述菌种种子液中含菌量为108‑109cfu/mL；所述培养条件为35‑38℃，微缺氧条件下，培养12‑18h。

[0024] 作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述发酵培养条件为35‑38℃，微缺氧条件下，培养36‑48h；所述长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为3‑5％、2‑4％、2‑5％。

[0025] 作为本发明的进一步改进，所述微缺氧条件为氧含量为7‑12％，二氧化碳含量为3‑7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0026] 作为本发明的进一步改进，步骤S6中所述低聚果糖、水苏四糖、棉子糖的质量比为5‑10:2‑4:1‑2；步骤S7中所述中药提取物、发酵产物、益生元组合物、丁酸酯淀粉、丹皮酚、淫羊藿苷的质量比为100‑200:50‑120:10‑20:5‑20:3‑5:2‑3。

[0027] 作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：

[0028] S1.中药粉的混合：将5‑15重量份狗脊、5‑15重量份杜仲、5‑15重量份续断、5‑15重量份虎杖、5‑15重量份秦艽、5‑15重量份地龙、5‑15重量份防己、5‑15重量份黄柏、10‑15重量份苍术、10‑15重量份怀牛膝、15‑25重量份生薏苡仁、10‑20重量份土茯苓、10‑20重量份连翘、5‑10重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过150‑200目筛，得到中药粉；

[0029] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入3‑5倍质量的水煎煮2‑3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0030] S3.培养基的制备：将5‑12重量份碳源、5‑10重量份氮源和25‑50重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7‑7.2，紫外线灭菌备用；

[0031] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划8
线，培养成菌种种子液，培养条件为35‑38℃，在微缺氧条件下，培养12‑18h，含菌量为10 ‑
9
10cfu/mL；

[0032] S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为3‑5％、2‑4％、2‑5％，发酵培养，培养条件为35‑38℃，微缺氧条件下，培养36‑48h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0033] S6.益生元组合物的制备：将5‑10重量份低聚果糖、2‑4重量份水苏四糖、1‑2重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0034] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将100‑200重量份步骤S2制得的中药提取物、50‑120重量份步骤S5制得的发酵产物、10‑20重量份步骤S6制得的益生元组合物、5‑20重量份丁酸酯淀粉、3‑5重量份丹皮酚、2‑3重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0035] 微缺氧条件为氧含量为7‑12％，二氧化碳含量为3‑7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0036] 本发明具有如下有益效果：生薏苡仁，味甘、淡，性凉，归脾、胃、肺经，健脾渗湿，除痹止泻，清热排浓。土茯苓，味甘、淡，性平，归肝、胃经，除湿，解毒，通利关节。连翘，味苦，性微寒，归肺、心、小肠经，清热解毒，消肿散结。怀牛膝，味苦、酸，性平，归肝、肾经，补肝肾，强筋骨，逐瘀通经，引血下行。苍术，味辛、苦，性温，归脾、胃、肝经，燥湿健脾，祛风散寒。狗脊，味苦、甘，性温，归肝、肾经，补肝肾，强腰脊，祛风湿。杜仲，味甘，性温，归肝、肾经，补肝肾，强筋骨。续断，味苦、辛，性微温，归肝、肾经，补肝肾，强筋骨，续折伤，止崩漏。虎杖，味微苦，性微寒，归肝、胆、肺经，祛风利湿，散瘀定痛，止咳化痰。秦艽，味辛、苦，性平，归胃、肝、胆经，祛风湿，清湿热，止痹痛。地龙，味咸，性寒，归肝、脾、膀胱经，清热定惊，通络，平喘，利尿。防己，味苦，性寒，归膀胱、肺经，利水消肿，祛风止痛。黄柏，味苦，性寒，归肾、膀胱经，清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮。土鳖虫，味咸、性寒，有毒，心、肝、脾三经，治症瘕积聚，血滞经闭，跌打损伤。全方共奏强筋劲骨、健脾化湿、通络止痛、温肾强督之效，发挥协同作用，效果更佳。

[0037] 本发明通过首先煎煮中药粉得到水提取物，然后得到的固体废渣进一步加入发酵培养基中在益生菌存在的条件下进行发酵处理，使得中药粉中的非水溶性营养物质能通过益生菌发酵转化为小分子的活性物质存在于发酵产物中，能起到很好消除炎症因子，补肾助阳，强壮筋骨，起到很好的治疗和预防AS的效果。

[0038] 本发明组合物通过调节肠道微生物，使得AS患者的肠道菌群发生改变，这种改变可以通过调节固有免疫系统和适应性免疫系统发挥作用。益生菌有助于分解食物，合成维生素和肠道中的许多其他物质，有助于防止致病菌定植，维持尿液和肠道pH值，还能减少促炎物质的产生，促进B细胞和T细胞增殖，降低其对凝集素氮的反应，并影响促炎和抑炎细胞因子的分泌，提高基体免疫力。其中，长双歧杆菌和短双歧杆菌可以诱导Th2驱动免疫反应，提高脂多糖LPS和鞭毛蛋白调节免疫应答，提高细菌趋化性，调节肌动蛋白细胞骨架，建设抗菌肽RegⅢγ的分泌，从而平衡肠道菌群，预防及治疗AS的发生。干酪乳杆菌能降低关节炎评分，降低促炎因子的水平，甚至比抗菌药物作用更大。另外，益生菌的存在可以抑制拟杆菌、厚壁菌门、变形菌等有害菌分泌产生多糖A，促进T细胞向Treg分化，提高Treg分泌抗炎因子，预防和治疗AS的发生。

[0039] 本发明通过添加益生元，包括低聚果糖、水苏四糖、棉子糖，其中，低聚果糖和水苏四糖能明显促进长双歧杆菌和短双歧杆菌的生长和分泌物的产生；水苏四糖和棉子糖能更快速的促进干酪乳杆菌的增殖和生长，从而，通过添加组合益生元，不仅能明显促进本发明组合物中含有的益生菌的增殖和生长，另外，还能促进肠道菌群中同类的益生菌的定植、生长，从而抑制有害益生菌包括拟杆菌、厚壁菌门、变形菌和放线菌的定植和生长，起到减少有害菌丰度的作用，从而通过免疫调节，对AS的预防和治疗有很好的辅助作用。

[0040] 另外，本发明添加的丁酸酯淀粉能明显促进肠道益生菌分泌免疫有益因子短链脂肪酸，包括醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐等，促进Treg数量的增加，改善肠壁完整性，结肠紧密连接蛋白表达增加，从而改变了自身反应性T细胞和Treg，从而起到预防和治疗自身免疫性疾病如AS的发生。

[0041] 通常AS患者体内p38MAPK通路被激活，MKK3/6和p38蛋白磷酸化水平显著升高，丹皮酚抗炎显著抑制可以显著抑制MKK3/6和p38蛋白磷酸化水平，通过调节JNK/ERK/p38MAPK途径减弱异氟烷麻醉引起的海马神经毒性，从而能明显改善AS患者症状，起到很好的治疗效果。淫羊藿苷具有免疫调节、抗肿瘤、影响心脑血管系统和生殖等多种重要的生物活性，通过调节Wnt/β‑catenin信号通路Wnt3a、β‑catenin蛋白表达，抑制炎症因子TNF‑α、TGF‑β1水平有关，同时，还可以防止骨质疏松，还可以抑制在体外抑制AS成纤维细胞发生病理性成骨。丹皮酚和淫羊藿苷两者协同作用下，能防止骶髂关节进一步融合，防止骨密度丢失，能明显改善AS的症状。

具体实施方式

[0042] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0043] 长双歧杆菌为中科嘉亿的长双歧杆菌BLG‑19，100亿cfu/g；短双歧杆菌为中科嘉亿的短双歧杆菌BBR‑15，产品编号A0014，100亿cfu/g；干酪乳杆菌为中科嘉亿的干酪乳杆菌JYLC‑374，100亿cfu/g。

[0044] 丹皮酚CAS号552‑41‑0，购于上海源叶生物科技有限公司；淫羊藿苷，货号B21576，纯度：HPLC>98％，购于上海源叶生物科技有限公司。低聚果糖，货号S11133，纯度：BR，95％，购于上海源叶生物科技有限公司；水苏四糖，货号S40153，纯度98％，购于上海源叶生物科技有限公司；棉子糖，货号B27802，纯度：HPLC>98％，购于上海源叶生物科技有限公司。

[0045] 丁酸酯淀粉的制备方法如下：将玉米淀粉加入2mol/L的盐酸溶液中，35℃酸解3d，调节溶液pH为中性，过滤，洗涤，得到微晶玉米淀粉，将40重量份微晶玉米淀粉加入100重量份去离子水中，45℃加入24重量份丁酸酐，调节溶液pH值为8.2，反应2h，反应结束后调节溶液pH为中性，洗涤，干燥，粉碎，得到丁酸酯淀粉。

[0046] 其中，玉米淀粉，含量>99％，密度为1.48g/cm3，购于苏州奥荣化工科技有限公司。

[0047] 实施例1

[0048] 本实施例提供一种用于强直性脊柱炎的组合物的制备方法，具体包括以下步骤：

[0049] S1.中药粉的混合：将5重量份狗脊、5重量份杜仲、5重量份续断、5重量份虎杖、5重量份秦艽、5重量份地龙、5重量份防己、5重量份黄柏、10重量份苍术、10重量份怀牛膝、15重量份生薏苡仁、10重量份土茯苓、10重量份连翘、5重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过150目筛，得到中药粉；

[0050] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入3倍质量的水煎煮2次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0051] S3.培养基的制备：将4重量份琼脂、1份阿拉伯糖、3重量份蛋白胨、2份尿素和25重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7，紫外线灭菌备用；

[0052] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划8
线，培养成菌种种子液，培养条件为35℃，在微缺氧条件下，培养12h，含菌量为10cfu/mL；

[0053] S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为3％、2％、2％，发酵培养，培养条件为35℃，微缺氧条件下，培养36h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0054] S6.益生元组合物的制备：将5重量份低聚果糖、2重量份水苏四糖、1重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0055] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将100重量份步骤S2制得的中药提取物、50重量份步骤S5制得的发酵产物、10重量份步骤S6制得的益生元组合物、5重量份丁酸酯淀粉、3重量份丹皮酚、2重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0056] 微缺氧条件为氧含量为7％，二氧化碳含量为3％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0057] 实施例2

[0058] 本实施例提供一种用于强直性脊柱炎的组合物的制备方法，具体包括以下步骤：

[0059] S1.中药粉的混合：将15重量份狗脊、15重量份杜仲、15重量份续断、15重量份虎杖、15重量份秦艽、15重量份地龙、15重量份防己、15重量份黄柏、15重量份苍术、15重量份怀牛膝、25重量份生薏苡仁、20重量份土茯苓、20重量份连翘、10重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0060] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入5倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0061] S3.培养基的制备：将10重量份葡萄糖、2重量份琼脂、4重量份鱼粉、1重量份35wt％氨水、硝酸铵1重量份、4重量份蛋白胨和50重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7.2，紫外线灭菌备用；

[0062] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划9
线，培养成菌种种子液，培养条件为38℃，在微缺氧条件下，培养18h，含菌量为10cfu/mL；

[0063] S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为5％、4％、5％，发酵培养，培养条件为38℃，微缺氧条件下，培养48h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0064] S6.益生元组合物的制备：将10重量份低聚果糖、4重量份水苏四糖、2重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0065] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将200重量份步骤S2制得的中药提取物、120重量份步骤S5制得的发酵产物、20重量份步骤S6制得的益生元组合物、20重量份丁酸酯淀粉、5重量份丹皮酚、3重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0066] 微缺氧条件为氧含量为12％，二氧化碳含量为7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0067] 实施例3

[0068] 本实施例提供一种用于强直性脊柱炎的组合物的制备方法，具体包括以下步骤：

[0069] S1.中药粉的混合：将10重量份狗脊、10重量份杜仲、10重量份续断、10重量份虎杖、10重量份秦艽、10重量份地龙、10重量份防己、10重量份黄柏、12重量份苍术、12重量份怀牛膝、20重量份生薏苡仁、15重量份土茯苓、15重量份连翘、7重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0070] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入4倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0071] S3.培养基的制备：将6重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、4重量份蛋白胨、2重量份硝酸铵、0.5重量份甘氨酸、0.5重量份苯丙氨酸和35重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7.1，紫外线灭菌备用；

[0072] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划9
线，培养成菌种种子液，培养条件为37℃，在微缺氧条件下，培养15h，含菌量为10cfu/mL；

[0073] S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为4％、3％、3.5％，发酵培养，培养条件为37℃，微缺氧条件下，培养42h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0074] S6.益生元组合物的制备：将7重量份低聚果糖、3重量份水苏四糖、1.5重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0075] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将150重量份步骤S2制得的中药提取物、80重量份步骤S5制得的发酵产物、15重量份步骤S6制得的益生元组合物、15重量份丁酸酯淀粉、4重量份丹皮酚、2.5重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0076] 微缺氧条件为氧含量为10％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0077] 实施例4

[0078] 与实施例3相比，步骤S6中未添加低聚果糖，其他条件均不改变。

[0079] 具体包括以下步骤：

[0080] S1.中药粉的混合：将10重量份狗脊、10重量份杜仲、10重量份续断、10重量份虎杖、10重量份秦艽、10重量份地龙、10重量份防己、10重量份黄柏、12重量份苍术、12重量份怀牛膝、20重量份生薏苡仁、15重量份土茯苓、15重量份连翘、7重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0081] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入4倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0082] S3.培养基的制备：将6重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、4重量份蛋白胨、2重量份硝酸铵、0.5重量份甘氨酸、0.5重量份苯丙氨酸和35重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7.1，紫外线灭菌备用；

[0083] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划9
线，培养成菌种种子液，培养条件为37℃，在微缺氧条件下，培养15h，含菌量为10cfu/mL；

[0084] S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为4％、3％、3.5％，发酵培养，培养条件为37℃，微缺氧条件下，培养42h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0085] S6.益生元组合物的制备：将3重量份水苏四糖、8.5重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0086] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将150重量份步骤S2制得的中药提取物、80重量份步骤S5制得的发酵产物、15重量份步骤S6制得的益生元组合物、15重量份丁酸酯淀粉、4重量份丹皮酚、2.5重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0087] 微缺氧条件为氧含量为10％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0088] 实施例5

[0089] 与实施例3相比，步骤S6中未添加棉子糖，其他条件均不改变。

[0090] 具体包括以下步骤：

[0091] S1.中药粉的混合：将10重量份狗脊、10重量份杜仲、10重量份续断、10重量份虎杖、10重量份秦艽、10重量份地龙、10重量份防己、10重量份黄柏、12重量份苍术、12重量份怀牛膝、20重量份生薏苡仁、15重量份土茯苓、15重量份连翘、7重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0092] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入4倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0093] S3.培养基的制备：将6重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、4重量份蛋白胨、2重量份硝酸铵、0.5重量份甘氨酸、0.5重量份苯丙氨酸和35重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7.1，紫外线灭菌备用；

[0094] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划9
线，培养成菌种种子液，培养条件为37℃，在微缺氧条件下，培养15h，含菌量为10cfu/mL；

[0095] S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为4％、3％、3.5％，发酵培养，培养条件为37℃，微缺氧条件下，培养42h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0096] S6.益生元组合物的制备：将8.5重量份低聚果糖、3重量份水苏四糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0097] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将150重量份步骤S2制得的中药提取物、80重量份步骤S5制得的发酵产物、15重量份步骤S6制得的益生元组合物、15重量份丁酸酯淀粉、4重量份丹皮酚、2.5重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0098] 微缺氧条件为氧含量为10％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0099] 对比例1

[0100] 与实施例3相比，步骤S3中未添加S2中的滤渣，其他条件均不改变。

[0101] 具体包括以下步骤：

[0102] S1.中药粉的混合：将10重量份狗脊、10重量份杜仲、10重量份续断、10重量份虎杖、10重量份秦艽、10重量份地龙、10重量份防己、10重量份黄柏、12重量份苍术、12重量份怀牛膝、20重量份生薏苡仁、15重量份土茯苓、15重量份连翘、7重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0103] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入4倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物；

[0104] S3.培养基的制备：将6重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、4重量份蛋白胨、2重量份硝酸铵、0.5重量份甘氨酸、0.5重量份苯丙氨酸加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7.1，紫外线灭菌备用；

[0105] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划9
线，培养成菌种种子液，培养条件为37℃，在微缺氧条件下，培养15h，含菌量为10cfu/mL；

[0106] S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为4％、3％、3.5％，发酵培养，培养条件为37℃，微缺氧条件下，培养42h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0107] S6.益生元组合物的制备：将7重量份低聚果糖、3重量份水苏四糖、1.5重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0108] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将150重量份步骤S2制得的中药提取物、80重量份步骤S5制得的发酵产物、15重量份步骤S6制得的益生元组合物、15重量份丁酸酯淀粉、4重量份丹皮酚、2.5重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0109] 微缺氧条件为氧含量为10％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0110] 对比例2

[0111] 与实施例3相比，步骤5中未添加长双歧杆菌，其他条件均不改变。

[0112] 具体包括以下步骤：

[0113] S1.中药粉的混合：将10重量份狗脊、10重量份杜仲、10重量份续断、10重量份虎杖、10重量份秦艽、10重量份地龙、10重量份防己、10重量份黄柏、12重量份苍术、12重量份怀牛膝、20重量份生薏苡仁、15重量份土茯苓、15重量份连翘、7重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0114] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入4倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0115] S3.培养基的制备：将6重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、4重量份蛋白胨、2重量份硝酸铵、0.5重量份甘氨酸、0.5重量份苯丙氨酸和35重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7.1，紫外线灭菌备用；

[0116] S4.菌种的活化：将短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划线，培养成菌9
种种子液，培养条件为37℃，在微缺氧条件下，培养15h，含菌量为10cfu/mL；

[0117] S5.发酵：将步骤S4中的两种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为4％、3％、3.5％，发酵培养，培养条件为37℃，微缺氧条件下，培养42h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0118] S6.益生元组合物的制备：将7重量份低聚果糖、3重量份水苏四糖、1.5重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0119] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将150重量份步骤S2制得的中药提取物、80重量份步骤S5制得的发酵产物、15重量份步骤S6制得的益生元组合物、15重量份丁酸酯淀粉、4重量份丹皮酚、2.5重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0120] 微缺氧条件为氧含量为10％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0121] 对比例3

[0122] 与实施例3相比，步骤S5中未添加短双歧杆菌，其他条件均不改变。

[0123] 具体包括以下步骤：

[0124] S1.中药粉的混合：将10重量份狗脊、10重量份杜仲、10重量份续断、10重量份虎杖、10重量份秦艽、10重量份地龙、10重量份防己、10重量份黄柏、12重量份苍术、12重量份怀牛膝、20重量份生薏苡仁、15重量份土茯苓、15重量份连翘、7重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0125] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入4倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0126] S3.培养基的制备：将6重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、4重量份蛋白胨、2重量份硝酸铵、0.5重量份甘氨酸、0.5重量份苯丙氨酸和35重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7.1，紫外线灭菌备用；

[0127] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划线，培养成菌9
种种子液，培养条件为37℃，在微缺氧条件下，培养15h，含菌量为10cfu/mL；

[0128] S5.发酵：将步骤S4中的两种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为4％、3.5％，发酵培养，培养条件为37℃，微缺氧条件下，培养42h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0129] S6.益生元组合物的制备：将7重量份低聚果糖、3重量份水苏四糖、1.5重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0130] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将150重量份步骤S2制得的中药提取物、80重量份步骤S5制得的发酵产物、15重量份步骤S6制得的益生元组合物、15重量份丁酸酯淀粉、4重量份丹皮酚、2.5重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0131] 微缺氧条件为氧含量为10％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0132] 对比例4

[0133] 与实施例3相比，步骤S5中未添加干酪乳杆菌，其他条件均不改变。

[0134] 具体包括以下步骤：

[0135] S1.中药粉的混合：将10重量份狗脊、10重量份杜仲、10重量份续断、10重量份虎杖、10重量份秦艽、10重量份地龙、10重量份防己、10重量份黄柏、12重量份苍术、12重量份怀牛膝、20重量份生薏苡仁、15重量份土茯苓、15重量份连翘、7重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0136] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入4倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0137] S3.培养基的制备：将6重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、4重量份蛋白胨、2重量份硝酸铵、0.5重量份甘氨酸、0.5重量份苯丙氨酸和35重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7.1，紫外线灭菌备用；

[0138] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌分别在高氏培养基中划线，培养成菌9
种种子液，培养条件为37℃，在微缺氧条件下，培养15h，含菌量为10cfu/mL；

[0139] S5.发酵：将步骤S4中的两种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌菌种种子液的接种量依次为4％、3％，发酵培养，培养条件为37℃，微缺氧条件下，培养42h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0140] S6.益生元组合物的制备：将7重量份低聚果糖、3重量份水苏四糖、1.5重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0141] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将150重量份步骤S2制得的中药提取物、80重量份步骤S5制得的发酵产物、15重量份步骤S6制得的益生元组合物、15重量份丁酸酯淀粉、4重量份丹皮酚、2.5重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0142] 微缺氧条件为氧含量为10％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0143] 对比例5

[0144] 与实施例3相比，步骤S7中未添加中药提取物，其他条件均不改变。

[0145] 具体包括以下步骤：

[0146] S1.中药粉的混合：将10重量份狗脊、10重量份杜仲、10重量份续断、10重量份虎杖、10重量份秦艽、10重量份地龙、10重量份防己、10重量份黄柏、12重量份苍术、12重量份怀牛膝、20重量份生薏苡仁、15重量份土茯苓、15重量份连翘、7重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0147] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入4倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0148] S3.培养基的制备：将6重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、4重量份蛋白胨、2重量份硝酸铵、0.5重量份甘氨酸、0.5重量份苯丙氨酸和35重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7.1，紫外线灭菌备用；

[0149] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划9
线，培养成菌种种子液，培养条件为37℃，在微缺氧条件下，培养15h，含菌量为10cfu/mL；

[0150] S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为4％、3％、3.5％，发酵培养，培养条件为37℃，微缺氧条件下，培养42h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0151] S6.益生元组合物的制备：将7重量份低聚果糖、3重量份水苏四糖、1.5重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0152] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将230重量份步骤S5制得的发酵产物、15重量份步骤S6制得的益生元组合物、15重量份丁酸酯淀粉、4重量份丹皮酚、2.5重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0153] 微缺氧条件为氧含量为10％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0154] 对比例6

[0155] 与实施例3相比，步骤S7中未添加发酵产物，其他条件均不改变。

[0156] 具体包括以下步骤：

[0157] S1.中药粉的混合：将10重量份狗脊、10重量份杜仲、10重量份续断、10重量份虎杖、10重量份秦艽、10重量份地龙、10重量份防己、10重量份黄柏、12重量份苍术、12重量份怀牛膝、20重量份生薏苡仁、15重量份土茯苓、15重量份连翘、7重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0158] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入4倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0159] S3.益生元组合物的制备：将7重量份低聚果糖、3重量份水苏四糖、1.5重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0160] S4.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将230重量份步骤S2制得的中药提取物、15重量份步骤S3制得的益生元组合物、15重量份丁酸酯淀粉、4重量份丹皮酚、2.5重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0161] 微缺氧条件为氧含量为10％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0162] 对比例7

[0163] 与实施例3相比，步骤S7中未添加益生元组合物，其他条件均不改变。

[0164] 具体包括以下步骤：

[0165] S1.中药粉的混合：将10重量份狗脊、10重量份杜仲、10重量份续断、10重量份虎杖、10重量份秦艽、10重量份地龙、10重量份防己、10重量份黄柏、12重量份苍术、12重量份怀牛膝、20重量份生薏苡仁、15重量份土茯苓、15重量份连翘、7重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0166] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入4倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0167] S3.培养基的制备：将6重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、4重量份蛋白胨、2重量份硝酸铵、0.5重量份甘氨酸、0.5重量份苯丙氨酸和35重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7.1，紫外线灭菌备用；

[0168] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划9
线，培养成菌种种子液，培养条件为37℃，在微缺氧条件下，培养15h，含菌量为10cfu/mL；

[0169] S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为4％、3％、3.5％，发酵培养，培养条件为37℃，微缺氧条件下，培养42h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0170] S6.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将150重量份步骤S2制得的中药提取物、80重量份步骤S5制得的发酵产物、15重量份丁酸酯淀粉、4重量份丹皮酚、2.5重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0171] 微缺氧条件为氧含量为10％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0172] 对比例8

[0173] 与实施例3相比，步骤S7中未添加丁酸酯淀粉，其他条件均不改变。

[0174] 具体包括以下步骤：

[0175] S1.中药粉的混合：将10重量份狗脊、10重量份杜仲、10重量份续断、10重量份虎杖、10重量份秦艽、10重量份地龙、10重量份防己、10重量份黄柏、12重量份苍术、12重量份怀牛膝、20重量份生薏苡仁、15重量份土茯苓、15重量份连翘、7重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0176] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入4倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0177] S3.培养基的制备：将6重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、4重量份蛋白胨、2重量份硝酸铵、0.5重量份甘氨酸、0.5重量份苯丙氨酸和35重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7.1，紫外线灭菌备用；

[0178] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划9
线，培养成菌种种子液，培养条件为37℃，在微缺氧条件下，培养15h，含菌量为10cfu/mL；

[0179] S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为4％、3％、3.5％，发酵培养，培养条件为37℃，微缺氧条件下，培养42h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0180] S6.益生元组合物的制备：将7重量份低聚果糖、3重量份水苏四糖、1.5重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0181] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将150重量份步骤S2制得的中药提取物、80重量份步骤S5制得的发酵产物、15重量份步骤S6制得的益生元组合物、4重量份丹皮酚、
2.5重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0182] 微缺氧条件为氧含量为10％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0183] 对比例9

[0184] 与实施例3相比，步骤S7中未添加丹皮酚，其他条件均不改变。

[0185] 具体包括以下步骤：

[0186] S1.中药粉的混合：将10重量份狗脊、10重量份杜仲、10重量份续断、10重量份虎杖、10重量份秦艽、10重量份地龙、10重量份防己、10重量份黄柏、12重量份苍术、12重量份怀牛膝、20重量份生薏苡仁、15重量份土茯苓、15重量份连翘、7重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0187] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入4倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0188] S3.培养基的制备：将6重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、4重量份蛋白胨、2重量份硝酸铵、0.5重量份甘氨酸、0.5重量份苯丙氨酸和35重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7.1，紫外线灭菌备用；

[0189] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划9
线，培养成菌种种子液，培养条件为37℃，在微缺氧条件下，培养15h，含菌量为10cfu/mL；

[0190] S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为4％、3％、3.5％，发酵培养，培养条件为37℃，微缺氧条件下，培养42h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0191] S6.益生元组合物的制备：将7重量份低聚果糖、3重量份水苏四糖、1.5重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0192] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将150重量份步骤S2制得的中药提取物、80重量份步骤S5制得的发酵产物、15重量份步骤S6制得的益生元组合物、15重量份丁酸酯淀粉、6.5重量份淫羊藿苷混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0193] 微缺氧条件为氧含量为10％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0194] 对比例10

[0195] 与实施例3相比，步骤S7中未添加淫羊藿苷，其他条件均不改变。

[0196] 具体包括以下步骤：

[0197] S1.中药粉的混合：将10重量份狗脊、10重量份杜仲、10重量份续断、10重量份虎杖、10重量份秦艽、10重量份地龙、10重量份防己、10重量份黄柏、12重量份苍术、12重量份怀牛膝、20重量份生薏苡仁、15重量份土茯苓、15重量份连翘、7重量份土鳖虫按比例混合，粉碎，过200目筛，得到中药粉；

[0198] S2.中药提取物的制备：将步骤S1制得的中药粉加入4倍质量的水煎煮3次，过滤，合并煎液，浓缩，喷雾干燥，得到中药提取物，滤渣留用；

[0199] S3.培养基的制备：将6重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、4重量份蛋白胨、2重量份硝酸铵、0.5重量份甘氨酸、0.5重量份苯丙氨酸和35重量份步骤S2中的滤渣加入1000重量份无菌水中混匀，PBS调节pH值至7.1，紫外线灭菌备用；

[0200] S4.菌种的活化：将长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌分别在高氏培养基中划9
线，培养成菌种种子液，培养条件为37℃，在微缺氧条件下，培养15h，含菌量为10cfu/mL；

[0201] S5.发酵：将步骤S4中的三种菌种种子液依次接种至步骤S3制得的培养基中，长双歧杆菌、短双歧杆菌和干酪乳杆菌菌种种子液的接种量依次为4％、3％、3.5％，发酵培养，培养条件为37℃，微缺氧条件下，培养42h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物；

[0202] S6.益生元组合物的制备：将7重量份低聚果糖、3重量份水苏四糖、1.5重量份棉子糖混合均匀，制得益生元组合物；

[0203] S7.用于强直性脊柱炎的组合物的制备：将150重量份步骤S2制得的中药提取物、80重量份步骤S5制得的发酵产物、15重量份步骤S6制得的益生元组合物、15重量份丁酸酯淀粉、6.5重量份丹皮酚混合均匀，得到用于强直性脊柱炎的组合物；

[0204] 微缺氧条件为氧含量为10％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。

[0205] 测试例1小鼠试验

[0206] 1、分组

[0207] 将144只清洁级雄性BALB/c小鼠，(17.1±2.6)周龄，体重(21.2±2.2)g。随机分为18组，每组8只，分别为正常组、AS组、阳性药组、实施例1‑5组和对比例1‑10组。

[0208] 2、AS模型建立

[0209] 将AS组、阳性药组、实施例1‑5组和对比例1‑10组分别腹腔注射100μL的完全弗氏佐剂(CFA)和100μL的丙二醇混合液，各组小鼠在实验开始第0、3、6周进行注射，正常组腹腔注射等量的丙二醇溶剂。

[0210] 3、药物干预

[0211] 在第7周对实施例1‑5组和对比例1‑10组分别灌胃相应制备的用于强直性脊柱炎的组合物，浓度为1mg/mL，剂量为10mg/(kg·d)；阳性药组使用柳氮磺吡啶灌胃，浓度为1mg/mL，剂量为10mg/(kg·d)，正常组和AS组使用等量无菌水灌胃，每日1次，连续干预4周。

[0212] 4、对血清炎症因子的影响

[0213] 通过尾静脉采集血液样本，将血液样本3000r/min下离心20min，收集上层血清，采用ELISA法测试血清中TNF‑α、IL‑6、IL‑17、IL‑21的含量。结果见表1。

[0214] 表1

[0215]

[0216]

[0217] 注释：*为与空白组相比，P<0.05；#为与模型组相比，P<0.05。

[0218] 由上表可知，本发明实施例1‑3制得的用于强直性脊柱炎的组合物能明显降低小鼠体内血清中炎症因子的含量。

[0219] 5、对小鼠股骨以及椎体骨密度的影响

[0220] 将各组小鼠麻醉后，骨密度测量仪测量股骨以及椎体骨密度。结果见表2。

[0221] 表2

[0222]

[0223]

[0224] 注释：*为与空白组相比，P<0.05；#为与模型组相比，P<0.05。

[0225] 由上表可知，本发明实施例1‑3制得的用于强直性脊柱炎的组合物能明显提高股骨以及椎体骨密度。

[0226] 6、测定滑膜组织Wnt3a、β‑catenin蛋白表达

[0227] 采用Western Blot法测定蛋白表达，取各组小鼠的滑膜组织，在RIPA裂解液冰上裂解后匀浆离心，考马斯亮蓝法测定各样品蛋白浓度，然后将处理后的蛋白进行SDS‑PAGE电泳，转印于NC膜，封闭，加一抗25℃孵育90min，洗膜，二抗25℃孵育90min，洗膜，ECL化学发光液显色曝光。进行底片扫描，以β‑actin为内参，将Wnt3a、β‑catenin蛋白条带与其进行比较，目标蛋白(Wnt3a、β‑catenin蛋白条带)的灰度值与内参的灰度值的比值即为目标蛋白的相对表达量。结果见表3。

[0228] 表3

[0229]

[0230]

[0231] 注释：*为与空白组相比，P<0.05；#为与模型组相比，P<0.05。

[0232] Wnt信号通路在AS的病理性骨形成过程中起到重要作用，特别是Wnt/β‑catenin信号的激活可能是导致AS患者脊柱和关节破坏、强直进展的重要因素之一。其中，miR‑29a可以通过下调DKK‑1表达并激活Wnt/β‑catenin信号通路，从而促进成骨细胞增殖，进而参与AS病理性新骨形成。由上表可知，本发明实施例1‑3制得的用于强直性脊柱炎的组合物能明显降低Wnt3a、β‑catenin蛋白的表达。

[0233] 实施例4、5与实施例3相比，步骤S6中未添加低聚果糖或棉子糖，其血清中炎症因子水平提高。对比例7与实施例3相比，步骤S7中未添加益生元组合物，其血清中炎症因子水平明显提高，Wnt3a、β‑catenin蛋白表达提高。本发明通过添加益生元，包括低聚果糖、水苏糖、棉子糖，其中，低聚果糖和水苏糖能明显促进长双歧杆菌和假链状双歧杆菌的生长和分泌物的产生；水苏糖和棉子糖能更快速的促进干酪乳杆菌的增殖和生长，从而，通过添加组合益生元，不仅能明显促进本发明组合物中含有的益生菌的增殖和生长，另外，还能促进肠道菌群中同类的益生菌的定植、生长，从而抑制有害益生菌包括拟杆菌、厚壁菌门、变形菌和放线菌的定植和生长，起到减少有害菌丰度的作用，从而通过免疫调节，降低体内炎症因子水平，一定程度影响Wnt/β‑catenin信号通路，对AS的预防和治疗有很好的辅助作用。可见，低聚果糖、水苏糖、棉子糖三者具有极好的协同增效的作用。

[0234] 对比例1与实施例3相比，步骤S3中未添加S2中的滤渣，其血清中炎症因子水平明显提高，骨密度明显下降。本发明中药粉水提后得到的固体废渣进一步加入发酵培养基中在益生菌存在的条件下进行发酵处理，使得中药粉中的非水溶性营养物质能通过益生菌发酵转化为小分子的活性物质存在于发酵产物中，能起到很好消除炎症因子，补肾助阳，强壮筋骨，起到很好的治疗和预防AS的效果。

[0235] 对比例2、3、4与实施例3相比，步骤5中未添加长双歧杆菌、短双歧杆菌或干酪乳杆菌，其血清中炎症因子水平提高，Wnt3a、β‑catenin蛋白表达提高。对比例6与实施例3相比，步骤S7中未添加发酵产物，其血清中炎症因子水平明显提高，骨密度明显下降，Wnt3a、β‑catenin蛋白表达明显提高。另外，本发明组合物通过调节肠道微生物，使得AS患者的肠道菌群发生改变，这种改变可以通过调节固有免疫系统和适应性免疫系统发挥作用。益生菌有助于分解食物，合成维生素和肠道中的许多其他物质，有助于防止致病菌定植，维持尿液和肠道pH值，还能减少促炎物质的产生，促进B细胞和T细胞增殖，降低其对凝集素氮的反应，并影响促炎和抑炎细胞因子的分泌，提高基体免疫力。其中，长双歧杆菌和假链状双歧杆菌可以诱导Th2驱动免疫反应，提高脂多糖LPS和鞭毛蛋白调节免疫应答，提高细菌趋化性，调节肌动蛋白细胞骨架，建设抗菌肽RegⅢγ的分泌，从而平衡肠道菌群，预防及治疗AS的发生。干酪乳杆菌能降低关节炎评分，降低促炎因子的水平，甚至比抗菌药物作用更大。另外，益生菌的存在可以抑制拟杆菌、厚壁菌门、变形菌等有害菌分泌产生多糖A，促进T细胞向Treg分化，提高Treg分泌抗炎因子，同时可以预防AS引起的骨密度丢失，抑制Wnt/β‑catenin信号通路的激活，三者的协同作用下，可以有效预防和治疗AS的发生。

[0236] 对比例5与实施例3相比，步骤S7中未添加中药提取物，其血清中炎症因子水平提高，Wnt3a、β‑catenin蛋白表达提高。本发明通过首先煎煮中药粉得到水提取物，然后得到的固体废渣进一步加入发酵培养基中在益生菌存在的条件下进行发酵处理，使得中药粉中的非水溶性营养物质能通过益生菌发酵转化为小分子的活性物质存在于发酵产物中，能起到很好消除炎症因子，补肾助阳，强壮筋骨，起到很好的治疗和预防AS的效果。

[0237] 对比例8与实施例3相比，步骤S7中未添加丁酸酯淀粉，其血清中炎症因子水平明显提高。本发明添加的丁酸酯淀粉能明显促进肠道益生菌分泌免疫有益因子短链脂肪酸，包括醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐等，促进Treg数量的增加，改善肠壁完整性，结肠紧密连接蛋白表达增加，从而改变了自身反应性T细胞和Treg，从而起到预防和治疗自身免疫性疾病如AS的发生。

[0238] 对比例9、10与实施例3相比，步骤S7中未添加丹皮酚或淫羊藿苷，对比例9中血清中炎症因子水平提高，对比例10中Wnt3a、β‑catenin蛋白表达明显提高。丹皮酚抗炎显著抑制可以显著抑制MKK3/6和p38蛋白磷酸化水平，通过调节JNK/ERK/p38MAPK途径减弱异氟烷麻醉引起的海马神经毒性，从而能明显改善AS患者症状，起到很好的治疗效果。淫羊藿苷具有免疫调节、抗肿瘤、影响心脑血管系统和生殖等多种重要的生物活性，通过调节Wnt/β‑catenin信号通路Wnt3a、β‑catenin蛋白表达，抑制炎症因子TNF‑α、TGF‑β1水平有关，同时，还可以防止骨质疏松，还可以抑制在体外抑制AS成纤维细胞发生病理性成骨。丹皮酚和淫羊藿苷两者协同作用下，能防止骶髂关节进一步融合，防止骨密度丢失，能明显改善AS的症状。

[0239] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。