一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解和苷元纯化方法

摘要

本发明公开了一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解和苷元纯化方法，属于中药提取领域。本发明方法包括中药糖苷的一步萃取和水解方法以及苷元的纯化方法。利用有机酸、过渡金属盐和季铵盐形成的新型三元低共熔溶剂(简称DES)构建糖苷萃取水解体系对糖苷进行一步萃取和水解，将糖苷转化为苷元；利用长链烷基酸与薄荷醇、麝香草酚形成的非离子疏水DES构建的液液萃取纯化体系对水解后的苷元进行纯化，提高苷元纯度。相比于传统的酸水解提取方法和酶水解提取方法，本方法操作简单、耗时短、绿色环保、效率高、适用性强且适合大规模的生产，适用于中药黄酮糖苷、蒽醌糖苷和三萜糖苷的提取和纯化。

权利要求

1.一种中药糖苷萃取、水解和苷元纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）基于三元DES的中药糖苷一步萃取和苷元水解方法：将三元DES与水混合作为萃取水解溶剂；将中药粉末与萃取水解溶剂混合后，对糖苷进行萃取水解，过滤得中药苷元提取液；

所述的三元DES通过包括如下步骤的方法制备得到：将季铵盐、有机酸和过渡金属盐混合，在80‑120℃、400‑1000rpm条件下加热30‑80min，冷却至室温后所得的液态溶剂即为三元DES；

所述的季铵盐为氯化胆碱、四乙基氯化铵、四丁基氯化铵中的一种，所述的有机酸为草酸、乙酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸中的一种，所述的过渡金属盐为FeCl3、AlCl3、CoCl2、CuCl2、ZnCl2中的一种；季铵盐、有机酸与过渡金属盐的摩尔比为1:1:0.1～1:3:0.2；

（2）基于疏水DES的苷元纯化方法：将烷基醇、薄荷醇与麝香草酚中的一种和长链烷基酸混合加热，得到非离子疏水DES；将非离子疏水DES与中药苷元提取液充分混合，离心，取疏水DES相即得纯化后的中药苷元；

所述的长链烷酸为己酸、正癸酸中的一种，所述的烷基醇为正辛醇；所述的烷基醇、薄荷醇与麝香草酚中的一种和长链烷基酸的摩尔比为3:1～1:3；

所述的中药为地锦草，所述的中药糖苷为芦丁，所述的中药苷元为槲皮素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的萃取水解溶剂中三元DES的体积百分比浓度为40‑80%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的中药粉末与萃取水解溶剂混合时的固液比为1:5～1:40g/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的萃取水解的条件为：50～80℃、500～1000rpm条件下对糖苷萃取水解1～2小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，非离子疏水DES与中药苷元提取液的体积比为1:2～2:1。

6.一种中药糖苷萃取、水解方法，其特征在于：包括权利要求1‑4任一项所述的方法中的步骤（1）。

说明书

一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解和苷元纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及中药提取领域，更具体地说是涉及一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解和苷元纯化方法。

背景技术

[0002] 中药含有多种苷元的有效成分，如槲皮素、白藜芦醇、芦荟大黄素、大黄素、齐墩果酸等，这些苷元成分具有多种对健康有益的功效，且已经被广泛应用于药品、保健品和化妆品等行业。例如：地锦草中的槲皮素具有优异的抗菌、消炎、抗病毒、抗氧化作用；虎杖中的白藜芦醇具有抗氧化、抗肿瘤、降低血小板聚集、预防和治疗动脉粥样硬化及心脑血管疾病等；大黄中的芦荟大黄素、大黄素等游离蒽醌有抗炎抑菌和泻下等功效。但是苷元类活性成分在中药中常以其糖苷的形式存在，如虎杖中的白藜芦醇主要以虎杖苷(白藜芦醇的糖苷)的形式存在；地锦草中的槲皮素则含有芦丁、异槲皮苷等糖苷；沙棘中的异鼠李素包含异鼠李素‑芸香糖‑葡萄糖苷、异鼠李素‑鼠李糖‑葡萄糖苷等糖苷；大黄中的蒽醌糖苷包括大黄酸苷、大黄素葡萄糖苷等糖苷。因此为了提高中药苷元的提取效率，通常需要将其糖苷进行萃取和水解。

[0003] 目前中药苷元提取通常先采用有机溶剂提取，然后采用酶水解或者酸水解的方式对糖苷进行水解。但酶水解存在成本高、底物选择性强、水解条件苛刻、通用性差等不足。尽管酸水解通用性强，但酸水解通常采用回流水解，不适合大规模生产，且酸水解法还使用大量挥发性强、易制毒的盐酸和有机溶剂，不仅易造成环境污染，也会危害操作人员的健康。此外，酸水解和酶水解的样品制备方法均将萃取和水解分两步进行，操作繁琐、耗时长，样品制备效率低。尽管，有专利(CN111909006A)采用绿色的低共熔溶剂(DES)对虎杖苷进行一步萃取和水解，但是该技术仍使用了挥发性盐酸，且水解的糖苷结构简单。也有技术使用有机酸DES对虎杖苷进行一步萃取和水解，但是基于二元的有机酸水解性能不足，难以高效水解中药中结构更为复杂的糖苷。此外，DES萃取水解糖苷后会引入大量的杂质，给苷元的纯化带来艰巨的挑战。因此，开发绿色、高效、高通量的中药糖苷的萃取、水解方法和苷元纯化方法对推动中药中苷元的制备具有重要的意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于解决现有中药苷元提取中存在的操作复杂、耗时长、不绿色环保且通量小等问题，提供了一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解和苷元纯化方法。提供的方法操作简单、效率高、绿色环保且可以大规模生产。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

[0006] 一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解和苷元纯化方法，其包括基于三元DES的中药糖苷一步萃取与水解方法和基于疏水DES液液萃取的纯化方法，具体包括如下步骤：

[0007] (1)基于三元DES的中药糖苷一步萃取和苷元水解方法：将新型三元DES与水混合作为萃取水解溶剂；将中药粉末与萃取水解溶剂混合后，对糖苷进行萃取水解，过滤得中药苷元提取液；

[0008] 所述的新型三元DES由季铵盐、有机酸和过渡金属盐混合加热得到。

[0009] (2)基于疏水DES的苷元纯化方法：将长链烷基酸和烷基醇、薄荷醇与麝香草酚中的一种混合加热，得到非离子疏水DES；将非离子疏水DES与中药苷元提取液充分混合，离心，取疏水DES相即得纯化后的中药苷元。

[0010] 优选的，步骤(1)中，所述的三元DES通过包括如下步骤的方法制备得到：将季铵盐、有机酸和过渡金属盐混合，在80‑120℃、400‑1000rpm条件下加热30‑80min，冷却至室温后所得的液态溶剂即为三元DES。

[0011] 优选的，步骤(1)中，所述的季铵盐为氯化胆碱(ChCl)、四乙基氯化铵(TEAC)、四丁基氯化铵(TBAC)中的一种，所述的有机酸为草酸(OA)、乙酸(AA)、苹果酸(MA)、乳酸(LA)、柠檬酸(CA)中的一种，所述的过渡金属盐为FeCl3、AlCl3、CoCl2、CuCl2、ZnCl2中的一种；季铵盐、有机酸与过渡金属盐的摩尔比为1:1:0.1～1:3:0.2。

[0012] 优选的，步骤(1)中，所述的萃取水解溶剂中三元DES的体积百分比浓度为40～80％。

[0013] 优选的，步骤(1)中，所述的中药为地锦草、大黄、虎杖、沙棘中的一种。

[0014] 优选的，步骤(1)中，所述的糖苷为黄酮糖苷、蒽醌糖苷、三萜糖苷中的一种。

[0015] 优选的，步骤(1)中，所述的中药粉末与萃取水解溶剂混合时的固液比为1:5～1:40g/mL。

[0016] 优选的，步骤(1)中，所述的萃取水解的条件为：50～80℃、500～1000rpm条件下对糖苷萃取水解1～2小时。

[0017] 优选的，步骤(2)中，所述的长链烷酸为己酸、正癸酸中的一种，所述的烷基醇为正辛醇。

[0018] 优选的，步骤(2)中，所述的长链烷基酸和烷基醇、薄荷醇与麝香草酚中的一种的摩尔比为1:3～3:1，所制备的非离子疏水DES密度低于水且粘度低于100mPa·s。

[0019] 优选的，步骤(2)中，非离子疏水DES与中药苷元提取液的体积比为1:2～2:1。

[0020] 优选的，步骤(2)纯化后三元DES萃取水解溶剂可重复用于糖苷的萃取和水解。

[0021] 一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解方法，包括上述方法中的步骤(1)。

[0022] 与现有技术相比，本发明所述的一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解和苷元纯化方法具有以下有益效果：本发明创造性地采用过渡金属盐与有机酸构建了三元DES糖苷水解体系，实现了中药糖苷的一步萃取和水解，方法耗时短，20分钟内对糖苷的水解效率可到94％；本发明还创造性地采用了非离子疏水DES对苷元进行了纯化，疏水DES对苷元的萃取效率均在80％以上且具有良好的除杂效果；本发明采用的方法避免了回流萃取和水解的操作，同时简化糖苷的工艺流程，具有大规模生产的潜力；本发明还创造性地发现利用过渡金属三元DES的糖苷水解体系比二元DES对糖苷的水解效率更高；本发明采用的工艺操作简单，绿色环保，适合工业放大生产。

附图说明

[0023] 图1是基于过渡金属三元DES的宏观图。

[0024] 图2是氯化胆碱‑草酸‑AlCl3三元DES的红外图。

[0025] 图3是氯化胆碱‑草酸‑FeCl3三元DES的红外图。

[0026] 图4是不同萃取水解体系对芦丁的转化效率。

[0027] 图5是三元DES以及二元DES对芦丁水解前后的色谱图。

[0028] 图6是非离子疏水DES‑三元DES液‑液纯化体系的宏观图；图中，ChCl：氯化胆碱；TBAC：四丁基氯化铵；AA：乙酸；LA：乳酸；Men：薄荷醇；n‑oct：正辛醇；Cap：己酸；n‑dec：正癸酸；Thy：麝香草酚。图中，A部分含有CuCl2，B部分含有CoCl2。

[0029] 图7是疏水DES对ChCl‑OA‑AlCl3三元DES中槲皮素萃取前后的色谱图。

[0030] 图8是疏水DES对ChCl‑LA‑CoCl2三元DES中槲皮素萃取前后的色谱图。

[0031] 图9是疏水DES对三元DES中的槲皮素的萃取效率。

[0032] 图10是三种萃取体系对地锦草中芦丁萃取水解后的色谱图。

具体实施方式

[0033] 下面将结合实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，但不应理解为对本发明的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

[0034] 实施例1：过渡金属盐三元DES的制备

[0035] 将氯化胆碱(ChCl)和乳酸(LA)分别与FeCl3、AlCl3、CoCl2、CuCl2、ZnCl2按1:2:0.1的摩尔比混合，在85℃、500rpm的水浴条件下加热60min至澄清透明均一状态，即得ChCl‑LA‑FeCl3、ChCl‑LA‑AlCl3、ChCl‑LA‑CoCl2、ChCl‑LA‑CuCl2和ChCl‑LA‑ZnCl2亲水三元DES。将氯化胆碱(ChCl)和草酸(OA)分别与FeCl3、AlCl3、CoCl2、CuCl2、ZnCl2按1:1.5:0.1的摩尔比混合，在90℃、500rpm的水浴条件下加热60min至澄清透明均一状态，即得ChCl‑OA‑FeCl3、ChCl‑OA‑AlCl3、ChCl‑OA‑CoCl2、ChCl‑OA‑CuCl2和ChCl‑OA‑ZnCl2亲水三元DES。

[0036] 上述三元DES的宏观图如图1所示，从图中可以看出这10种三元DES的室温下均为液态，表明三元DES可以作为中药活性成分萃取溶剂的潜力。

[0037] 以ChCl‑OA‑AlCl3和ChCl‑OA‑FeCl3作为三元DES的代表，采用红外光谱进行表征。ChCl‑OA‑FeCl3三元DES的红外图谱显示其特征峰均来自于ChCl‑OA二元DES和FeCl3(图2)。
ChCl‑OA‑AlCl3中的特征峰也均来自于ChCl‑OA二元DES和AlCl3(图3)。该结果表明，在三元‑1
DES中金属氯化盐与其组分并未发生化学反应。此外，三元DES中的羟基吸收峰(3381.6cm‑1
和3403.8cm )均出现了展宽和偏移，表明三元DES中仍存在大量的氢键作用。

[0038] 实施例2：基于三元DES糖苷水解体系对芦丁的水解效率

[0039] (1)基于ChCl‑OA‑AlCl3三元DES糖苷水解体系对芦丁的水解效率

[0040] 取50μL 10mg/mL芦丁标液于5mL EP管中，加入2mL体积含水率为40％的ChCl‑OA‑AlCl3(ChCl、OA与AlCl3的摩尔比为1:2:0.1)三元DES水溶液，混合均匀，在温度75℃条件下，水解10、20、30、40、50min，用高效液相色谱仪测定芦丁、槲皮素峰面积。

[0041] (2)基于ChCl‑OA二元DES水解体系对芦丁的水解效率

[0042] 取50μL 10mg/mL芦丁标液于5mL EP管中，加入2mL体积含水率为40％的ChCl‑OA(ChCl与OA的摩尔比为1:2)二元DES水溶液，混合均匀，在温度75℃条件下，水解10、20、30、40、50min，用高效液相色谱仪测定芦丁、槲皮素面积。

[0043] 依据转化率公式计算转化率：

[0044] 其中，C0和Ct分别表示水解前和水解不同时间后芦丁的浓度。

[0045] 如表1和图4、5所示，基于ChCl‑OA‑AlCl3三元DES对芦丁具有良好的水解效率。相比于二元DES，三元DES水解20min，94％以上的芦丁可被水解转化为槲皮素，而二元DES水解50min仅能转化73％的芦丁。结果表明基于ChCl‑OA‑AlCl3三元DES三元DES比二元DES具有更优异的糖苷水解性能。

[0046] 表1不同DES水解体系在不同时间条件下对芦丁的水解效率

[0047]

[0048]

[0049] 实施例3：疏水DES与三元DES的液‑液分相行为研究

[0050] 以己酸和正癸酸作为氢键供体，以薄荷醇和麝香草酚、正辛醇作为氢键受体，将其按1:2的摩尔比混合、加热制备了薄荷醇‑正辛酸(Men‑n‑oct)、薄荷醇‑己酸(Men‑Cap)、正2+
癸酸‑麝香草酚(n‑dec‑Thy)和正癸酸‑正辛醇(n‑dec‑n‑oct)非离子型疏水DES。以基于Cu
2+
和Co 有色金属盐形成三元DES(ChCl‑AA‑CuCl2、ChCl‑LA‑CuCl2、ChCl‑AA‑CoCl2、ChCl‑LA‑CoCl2、TBAC‑AA‑CuCl2、TBAC‑LA‑CuCl2，这些三元DES中季铵盐、有机酸和过渡金属盐的摩尔比为1:2:0.1，制备方法参见实施例1)，将疏水DES分别与三元DES按1:1的体积比混合，涡旋混匀，离心观察是否可以形成液‑液两相。

[0051] 如图6A所示，ChCl‑AA‑CuCl2、ChCl‑LA‑CuCl2三元DES与四种非离子型疏水DES(Men‑n‑oct、Men‑Cap、n‑dec‑Thy、n‑dec‑n‑oct)均可以形成液‑液两相。ChCl‑AA‑CoCl2、ChCl‑LA‑CoCl2、TBAC‑AA‑CuCl2、TBAC‑LA‑CuCl2四种三元DES与Men‑n‑oct、Men‑Cap非离子型疏水DES形成液‑液两相(6B)。在液‑液两相体系中非离子型疏水DES密度小，分配在液‑液两相中的上相。当疏水性DES与有色金属三元DES混合后，在疏水性DES相(上相)，图6未出现有色金属的颜色，表明金属离子未进入到疏水性DES相，结果显示了疏水DES液‑液萃取具有金属离子除杂的潜力。

[0052] 实施例4：疏水DES对苷元的纯化效果

[0053] (1)疏水DES对苷元的纯化效果

[0054] 将槲皮素分别溶于体积含水率为40％的ChCl‑OA‑AlCl3(ChCl、OA与AlCl3的摩尔比为1:2:0.1)或者ChCl‑LA‑CoCl2(ChCl、LA与AlCl3的摩尔比为1:2:0.1)三元DES水溶液中，得20μg/mL的槲皮素三元DES水溶液；向该液中加入等体积的非离子疏水DES(薄荷醇‑己酸、薄荷醇‑正辛酸、正癸醇‑正辛酸，其制备见实施例3)，涡旋离心，溶液分层，上相为疏水DES，下相为亲水DES，分别取上相、下相，用高效液相色谱仪测定两相中槲皮素的含量。

[0055] (2)传统溶剂对苷元的纯化效果

[0056] 将槲皮素溶于体积含水率为40％的ChCl‑OA‑AlCl3或者ChCl‑LA‑CoCl2三元DES水溶液中，得20μg/mL的槲皮素三元DES水溶液；向该液中加入等体积的氯仿、乙酸乙酯或正己烷，涡旋离心，溶液分层，上相为有机溶剂相，下相为亲水DES，分别取上相、下相，用高效液相色谱仪测定两相中槲皮素的含量。

[0057] 依据萃取率公式计算疏水DES对槲皮素的萃取效率：

[0058] 其中，C0和CHDES分别表示槲皮素在三元DES中的初始浓度以及萃取后在疏水DES或有机溶剂中的浓度

[0059] 如图7‑8所示，在槲皮素的三元DES溶液中(ChCl‑OA‑AlCl3未反萃和ChCl‑LA‑CoCl2未反萃)有大量的杂质峰(3min前的峰为金属离子杂质峰)，且槲皮素的峰较矮。经过非离子疏水DES萃取后，大量的槲皮素进入到疏水DES相中。相比于三元DES的色谱图，在疏水DES中出现金属离子的色谱峰明显更少，表明非离子疏水DES具有良好的纯化效果。萃取效率的结算结果显示(表2、图9)，基于对三元DES中的苷元(槲皮素)具有良好的萃取效果，萃取效率均在80％以上。然而传统的有机溶剂乙酸乙酯和氯仿无法与三元DES形成液‑液两相体系，进而无法对苷元进行纯化。而正己烷对苷元的纯化效果差，对槲皮素的萃取效率仅为20％。结果显示，非离子疏水DES对于三元DES水解后的苷元具有良好的萃取和纯化效果。

[0060] 表2不同疏水DES和有机溶剂对槲皮素的萃取效率

[0061]

[0062]

[0063] 实施例5：基于过渡金属盐的三元DES对地锦草中芦丁萃取水解效率

[0064] (1)基于ChCl‑OA‑AlCl3的三元DES对地锦草中芦丁萃取水解效率

[0065] 将干燥的地锦草粉碎，过60目筛备用，将1.8g ChCl‑OA‑AlCl3(ChCl、OA与AlCl3的摩尔比为1:1.5:0.1)三元DES、3.2g水和0.1g过筛地锦草粉末混合，在75℃条件下水浴加热，搅拌速度为500rpm，加热50min，对地锦草中的黄酮苷进行萃取和水解，离心，取上清夜，用高效液相色谱仪测量上清液中芦丁和槲皮素的含量。

[0066] (2)基于二元DES对地锦草中芦丁萃取水解效率

[0067] 将干燥的地锦草粉碎，过60目筛备用，将1.8g ChCl‑OA(ChCl与OA的摩尔比为1:1.5)二元DES、3.2g水和0.1g过筛地锦草粉末混合，在75℃条件下水浴加热，搅拌速度为
500rpm，加热50min，对地锦草中的黄酮苷进行萃取和水解，离心，取上清夜，用高效液相色谱仪测量上清液中芦丁和槲皮素的含量。

[0068] (3)传统有机溶剂对地锦草中芦丁萃取水解效率

[0069] 将干燥的地锦草粉碎，过60目筛备用，将1.8g甲醇、3.2g水和0.1g过筛地锦草粉末混合，在75℃条件下水浴加热，搅拌速度为500rpm，加热50min，对地锦草中的黄酮苷进行萃取和水解，离心，取上清夜，用高效液相色谱仪测量上清液中芦丁和槲皮素的含量。

[0070] 依据萃取产率公式计算不同萃取水解体系对槲皮素的萃取产率：

[0071] 其中，C0和V0分别表示槲皮素的萃取水解溶剂中的含量以及萃取溶剂的体积；M0表示中药粉末的质量。

[0072] 如表3和图10所示，相比于传统溶剂，基于三元DES和二元有机酸DES的萃取溶剂，均可以将地锦草中的糖苷(芦丁)萃取并转化为槲皮素，而传统的有机溶剂则无法将其转化(图10)。此外，相比于现有技术报道的二元DES，本发明的三元DES萃取水解体系芦丁的萃取和水解效率更高，其槲皮素的产率是二元DES的2倍之多(三元DES萃取体系对槲皮素的萃取产量是2.78mg/g，二元DES对槲皮素的萃取产量是1.2mg/g)。

[0073] 表3不同萃取体系对地锦草中槲皮素的萃取产率

[0074]