西洋参多肽及其组合物及其在降血压、提高免疫中的应用

摘要

本申请公开了西洋参多肽及其组合物及其在降血压、提高免疫中的应用。该西洋参多肽及其组合物包括如SEQ ID NO.1～8所示的多肽的至少一种。该西洋参肽1～8均有明显的抗氧化性能。通过体内实验证实，该西洋参肽1～8不仅具有与卡托普利相当的降血压作用，而且具体是通过改善RAAS失衡来实现降血压的作用，具有在改善肾性高血压引起的继发性高血压、进展开舒张期伴随腰酸背痛等领域的潜在应用前景。

权利要求

1.一种西洋参多肽及其组合物，包括如SEQ ID NO.1 8所示的多肽的至少一种。

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2.一种包含权利要求1所述的西洋参多肽及其组合物、和药学可接受的载体或稀释剂的药物组合物。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含权利要求1所述的西洋参多肽的药学可接受的盐、缓冲液、张力调节剂、药学上可接受的媒介物和/或稳定剂。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药学可接受的载体或稀释剂用于改善组合物的耐受性，且允许活性成分的更佳溶解度和更佳生物利用度。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药学可接受的载体或稀释剂包括乳化剂、增稠剂、氧化还原组分、淀粉、醇溶液、聚乙二醇或脂质。

6.权利要求1所述的西洋参多肽及其组合物的制备方法，其特征在于，包括：获得西洋参的愈伤组织；

获得西洋参愈伤组织无性系；

于液体培养液中进行悬浮培养，以得到高产蛋白的西洋参细胞；

收集所述西洋参细胞，对其进行采用食品级的碱性蛋白酶进行酶解、凝胶色谱纯化和液相色谱纯化，即可得到所述西洋参多肽及其组合物。

7.权利要求1所述的西洋参多肽及其组合物、或权利要求6所述的制备方法制得的西洋参多肽及其组合物在制备降血压相关药物中的应用。

说明书

西洋参多肽及其组合物及其在降血压、提高免疫中的应用

技术领域

[0001] 本申请涉及西洋参技术领域，尤其涉及西洋参多肽及其组合物及其在降血压、提高免疫中的应用。

背景技术

[0002] 西洋参(American ginseng)系五加科人参属植物，原产于加拿大和美国，我国己引种成功，因其具有广泛的生物活性与独特的药理作用，一直深受世界各国人民喜爱。迄今为止，已从西洋参中分离鉴定出皂苷类成分的苷元有3种:达玛烷型(Dammarane)，齐墩果烷型(Oleanane)，奥克梯隆型(拟人参皂苷元，Ocotillol)，而分离出的人参皂苷近40种。

[0003] 现代临床药理实验证实了西洋参具有保护心血管细胞、增强神经细胞、增强机体免疫力和条件内分泌等方面的功效。然而，进一步深挖西洋参中的活性成分，对其进行二次资源开发和利用，仍然具有十分重要的意义。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本申请的目的在于提供一种有别于现有技术公开的西洋参活性成分，以充分探究和开发西洋参活性成分的利用方法。

[0005] 第一方面，本申请实施例公开了一种西洋参多肽及其组合物，包括如SEQ ID NO.1～8所示的多肽的至少一种。

[0006] 第二方面，本申请实施例公开了一种包含第一方面所述的西洋参多肽及其组合物、和药学可接受的载体或稀释剂的药物组合物。

[0007] 在本申请实施例中，所述药物组合物还包含第一方面所述的西洋参多肽的药学可接受的盐和任选的缓冲液、张力调节剂、药学上可接受的媒介物和/或稳定剂。

[0008] 在本申请实施例中，所述药学可接受的载体或稀释剂用于改善组合物的耐受性，且允许活性成分的更佳溶解度和更佳生物利用度。

[0009] 在本申请实施例中，所述药学可接受的载体或稀释剂包括乳化剂、增稠剂、氧化还原组分、淀粉、醇溶液、聚乙二醇或脂质。

[0010] 第三方面，本申请实施例公开了第一方面所述的西洋参多肽及其组合物的制备方法，包括：

[0011] 获得西洋参的愈伤组织；

[0012] 获得西洋参愈伤组织无性系；

[0013] 于液体培养液中进行悬浮培养，以得到高产蛋白的西洋参细胞；

[0014] 收集所述西洋参细胞，对其进行酶解、凝胶色谱纯化和液相色谱纯化，即可得到所述西洋参多肽及其组合物。

[0015] 在本申请实施例中，所述悬浮培养的步骤具体包括：将所述西洋参愈伤组织无性系先于第一悬浮培养基中暗培养20天后，再添加新鲜的第二悬浮培养基继续培养7天，以得到所述高产细胞；

[0016] 或者

[0017] 将所述西洋参愈伤组织无性系先于第一悬浮培养基中暗培养15天后，再转接至新鲜的第二悬浮培养基培养15天，以得到所述高产细胞；

[0018] 其中，所述第一悬浮培养基为包含0.02～0.4mg/L赤霉素A12、0.02～0.4mg/L赤霉素A13、0.02～0.4mg/L赤霉素A15、0.02～0.4mg/L赤霉素A19和0.02～0.4mg/L赤霉素A23中至少一项的MS培养基；

[0019] 所述第二悬浮培养基为包含0.02～0.4mg/L赤霉素A12、0.02～0.4mg/L赤霉素A13、0.02～0.4mg/L赤霉素A15、0.02～0.4mg/L赤霉素A19、0.02～0.4mg/L赤霉素A23、0.02～0.4mg/L赤霉素A24和0.02～0.4mg/L赤霉素A34中至少一项的MS培养基。

[0020] 在本申请实施例中，所述第一悬浮培养基还包含1.5～5.4wt％蔗糖、0.02～3.4wt％D‑半乳糖；所述第二悬浮培养基还包含1.5～5.4wt％蔗糖、0.02～3.4wt％D‑半乳糖。

[0021] 在本申请实施例中，所述第一悬浮培养基为包含0.1～0.3mg/L赤霉素A12、0.1～0.3mg/L赤霉素A13、0.1～0.3mg/L赤霉素A15、0.1～0.3mg/L赤霉素A19和0.1～0.3mg/L赤霉素A23中至少一项的MS培养基；

[0022] 所述第二悬浮培养基为包含0.1～0.3mg/L赤霉素A12、0.1～0.3mg/L赤霉素A13、0.1～0.3mg/L赤霉素A15、0.1～0.3mg/L赤霉素A19、0.1～0.3mg/L赤霉素A23、0.1～0.3mg/L赤霉素A24和0.1～0.3mg/L赤霉素A34中至少一项的MS培养基。

[0023] 第四方面，本申请实施例公开了第一方面所述的西洋参多肽及其组合物、或第二方面所述的制备方法制得的西洋参多肽及其组合物在制备降血压或提高免疫力相关药物中的应用。

[0024] 与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：

[0025] 本申请利用西洋参苗制备其愈伤组织，通过对愈伤组织进行诱导培养得到其无性系，通过大规模悬浮培养得到其高产细胞株，并对其细胞培养物进行酶解、纯化等步骤，得到了西洋参肽1～8。再经体外实验发现，该西洋参肽1～8均有明显的抗氧化性能。最后，通过体内实验证实，该西洋参肽1～8不仅具有与卡托普利相当的降血压作用，而且具体是通过改善RAAS失衡来实现降血压的作用，具有在改善肾性高血压引起的继发性高血压、进展开舒张期伴随腰酸背痛等领域的潜在应用前景。

附图说明

[0026] 图1为本申请实施例1～6提供的凝胶色谱洗脱曲线。

[0027] 图2为本申请对比例1～7提供的凝胶色谱洗脱曲线。

[0028] 图3为本申请实施例提供的F1～F15的电泳图。

[0029] 图4为本申请实施例提供的F16～F30的电泳图。

[0030] 图5为本申请实施例提供的F3、F4、F8、F9、F10、F11、F13、F14和F15的RP‑HPLC图。

[0031] 图6为本申请实施例提供的F16、F17、F18、F21、F22和F23的RP‑HPLC图。

具体实施方式

[0032] 为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

[0033] 西洋参愈伤组织的诱导、培养及悬浮细胞系的建立

[0034] 一、材料与方法

[0035] 1、材料

[0036] 西洋参苗，陇县兴源药材种植专业合作社。赤霉素A3，深圳振强生物技术有限公司，纯度：98％；赤霉素A9，北京百灵威科技有限公司，CAS:427‑77‑0；赤霉素A12，深圳振强生物技术有限公司，CAS:1164‑45‑0；赤霉素A13，深圳振强生物技术有限公司，CAS:2922‑24‑9；赤霉素A15，深圳振强生物技术有限公司，CAS:13744‑18‑8；赤霉素A19，深圳振强生物技术有限公司，CAS:6980‑44‑5；赤霉素A20，北京百灵威科技有限公司，CAS:19143‑87‑4；赤霉素A23，深圳振强生物技术有限公司，CAS:20134‑29‑6；赤霉素A24，深圳振强生物技术有限公司，CAS:19427‑32‑8；赤霉素A34，深圳振强生物技术有限公司，CAS:32630‑92‑5。

[0037] 2、愈伤组织的诱导及继代培养

[0038] 取西洋参根，用酒精浸泡3～5次，每次30min后用无菌水洗涤5次，取其中段横切成薄片，接种到愈伤组织诱导培养基上，每个培养瓶中接种4～5片，置于生化培养箱中于24±1℃，暗培养，培养28～30天。

[0039] 其中使用的愈伤组织培养基为含有1mg/L 2,4‑D、3g/L蔗糖、2.5mg/L玉米素、700mg/L LH(水解乳蛋白，上海吉至生化科技有限公司，产品编号：L33040；Purity：BR)和lmg/L KT(细胞激动素，Sigma)和0.7％琼脂浓度，pH5.8。

[0040] 培养过程中观察西洋参根外植体愈伤组织的变化，根据外植体愈伤组织的诱导情况，挑选颜色淡黄色或嫩白色、生长速度快、质地疏松、分散性好的愈伤组织转移到新鲜的继代培养基中，继代培养基配方除不含植物激素外其他均与愈伤组织培养基相同，培养条件也相同。

[0041] 3、西洋参悬浮培养得到高产细胞

[0042] 在对西洋参愈伤组织经多次筛选、继代后，选择生长速度快、质地松散、嫩白色透明状的西洋参愈伤组织无性系转移到液体培养基中进行悬浮培养。

[0043] 具体的，一个实施例1的实施过程为：将西洋参愈伤组织无性系接种至第一悬浮培养基中，采用恒温摇床，转速90‑110rpm，100mL三角瓶中装30mL培养液，培养温度(25±1)℃，暗培养培养20天后；添加第二悬浮培养液新鲜10mL，继续培养7天，即可收获细胞。其中，第一悬浮培养基为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.2mg/L赤霉素A3、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15和0.2mg/L赤霉素A19的MS培养基。第二悬浮培养液为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。

[0044] 一个实施例2的实施过程为：将西洋参愈伤组织无性系接种至第一悬浮培养基中，采用恒温摇床，转速90‑110rpm，100mL三角瓶中装30mL培养液，培养温度(25±1)℃，暗培养培养20天后；添加第二悬浮培养液新鲜10mL，继续培养7天，即可收获细胞。其中，第一悬浮培养基为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。第二悬浮培养液为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。

[0045] 一个实施例3的实施过程为：将西洋参愈伤组织无性系接种至第一悬浮培养基中，采用恒温摇床，转速90‑110rpm，100mL三角瓶中装30mL培养液，培养温度(25±1)℃，暗培养培养20天后；添加第二悬浮培养液新鲜10mL，继续培养7天，即可收获细胞。其中，第一悬浮培养基为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。第二悬浮培养液为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19、0.2mg/L赤霉素A23、0.2mg/L赤霉素A24和0.2mg/L赤霉素A34的MS培养基。

[0046] 一个实施例4的实施过程为：将西洋参愈伤组织无性系接种至第一悬浮培养基中，采用恒温摇床，转速90‑110rpm，100mL三角瓶中装30mL培养液，培养温度(25±1)℃，暗培养培养20天后；添加第二悬浮培养液新鲜10mL，继续培养7天，即可收获细胞。其中，第一悬浮培养基为包含2.5wt％蔗糖、0.5wt％D‑半乳糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。第二悬浮培养液为包含2.5wt％蔗糖、0.5wt％D‑半乳糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。

[0047] 一个实施例5的实施过程为：将西洋参愈伤组织无性系接种至第一悬浮培养基中，采用恒温摇床，转速90‑110rpm，100mL三角瓶中装30mL培养液，培养温度(25±1)℃，暗培养培养20天后；添加第二悬浮培养液新鲜10mL，继续培养7天，即可收获细胞。其中，第一悬浮培养基为包含2.5wt％蔗糖、0.5wt％D‑半乳糖、700mg/L LH、0.5mg/L甘露醇、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。第二悬浮培养液为包含2.5wt％蔗糖、0.5wt％D‑半乳糖、700mg/L LH、0.5mg/L甘露醇、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。

[0048] 一个实施例6的实施过程为：将西洋参愈伤组织无性系接种至第一悬浮培养基中，采用恒温摇床，转速90‑110rpm，100mL三角瓶中装30mL培养液，培养温度(25±1)℃，暗培养培养15天后；转接3mL至第二悬浮培养液中100mL三角瓶中装30mL培养液，转接量为10％，继续培养15天，即可收获细胞。其中，第一悬浮培养基为包含2.5wt％蔗糖、0.5wt％D‑半乳糖、700mg/LLH、0.5mg/L甘露醇、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15、
0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。第二悬浮培养液为包含2.5wt％蔗糖、
0.5wt％D‑半乳糖、700mg/L LH、0.5mg/L甘露醇、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、
0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。

[0049] 一个对比例1的实施过程为：将西洋参愈伤组织无性系接种至第一悬浮培养基中，采用恒温摇床，转速90‑110rpm，100mL三角瓶中装30mL培养液，培养温度(25±1)℃，暗培养培养20天后；添加第二悬浮培养液新鲜10mL，继续培养7天，即可收获细胞。其中，第一悬浮培养基为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.5mg/L赤霉素A3和0.5mg/L赤霉素A9的MS培养基。第二悬浮培养液为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.5mg/L赤霉素A3和0.5mg/L赤霉素A9的MS培养基。

[0050] 一个对比例2的实施过程为：将西洋参愈伤组织无性系接种至第一悬浮培养基中，采用恒温摇床，转速90‑110rpm，100mL三角瓶中装30mL培养液，培养温度(25±1)℃，暗培养培养20天后；添加第二悬浮培养液新鲜10mL，继续培养7天，即可收获细胞。其中，第一悬浮培养基为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、1.0mg/L赤霉素A3的MS培养基。第二悬浮培养液为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、1.0mg/L赤霉素A3的MS培养基。

[0051] 一个对比例3的实施过程为：将西洋参愈伤组织无性系接种至第一悬浮培养基中，采用恒温摇床，转速90‑110rpm，100mL三角瓶中装30mL培养液，培养温度(25±1)℃，暗培养培养20天后；添加第二悬浮培养液新鲜10mL，继续培养7天，即可收获细胞。其中，第一悬浮培养基为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、1.0mg/L赤霉素A12的MS培养基。第二悬浮培养液为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、1.0mg/L赤霉素A12的MS培养基。

[0052] 一个对比例4的实施过程为：将西洋参愈伤组织无性系接种至第一悬浮培养基中，采用恒温摇床，转速90‑110rpm，100mL三角瓶中装30mL培养液，培养温度(25±1)℃，暗培养培养20天后；添加第二悬浮培养液新鲜10mL，继续培养7天，即可收获细胞。其中，第一悬浮培养基为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.01mg/L赤霉素A12、0.01mg/L赤霉素A13、0.01mg/L赤霉素A15、0.01mg/L赤霉素A19和0.01mg/L赤霉素A23的MS培养基。第二悬浮培养液为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.01mg/L赤霉素A12、0.01mg/L赤霉素A13、0.01mg/L赤霉素A15、0.01mg/L赤霉素A19和0.01mg/L赤霉素A23的MS培养基。

[0053] 一个对比例5的实施过程为：将西洋参愈伤组织无性系接种至第一悬浮培养基中，采用恒温摇床，转速90‑110rpm，100mL三角瓶中装30mL培养液，培养温度(25±1)℃，暗培养培养20天后；添加第二悬浮培养液新鲜10mL，继续培养7天，即可收获细胞。其中，第一悬浮培养基为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.5mg/L赤霉素A12、0.5mg/L赤霉素A13、0.5mg/L赤霉素A15、0.5mg/L赤霉素A19和0.5mg/L赤霉素A23的MS培养基。第二悬浮培养液为包含3wt％蔗糖、700mg/L LH、0.1mg/L KT、0.5mg/L赤霉素A12、0.5mg/L赤霉素A13、0.5mg/L赤霉素A15、0.5mg/L赤霉素A19和0.5mg/L赤霉素A23的MS培养基。

[0054] 一个对比例6的实施过程为：将西洋参愈伤组织无性系接种至第一悬浮培养基中，采用恒温摇床，转速90‑110rpm，100mL三角瓶中装30mL培养液，培养温度(25±1)℃，暗培养培养20天后；添加第二悬浮培养液新鲜10mL，继续培养7天，即可收获细胞。其中，第一悬浮培养基为包含1.0wt％蔗糖、3.5wt％D‑半乳糖、700mg/L LH、0.02mg/L甘露醇、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。第二悬浮培养液为包含1.0wt％蔗糖、3.5wt％D‑半乳糖、700mg/L LH、0.02mg/L甘露醇、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。

[0055] 一个对比例7的实施过程为：将西洋参愈伤组织无性系接种至第一悬浮培养基中，采用恒温摇床，转速90‑110rpm，100mL三角瓶中装30mL培养液，培养温度(25±1)℃，暗培养培养20天后；添加第二悬浮培养液新鲜10mL，继续培养7天，即可收获细胞。其中，第一悬浮培养基为包含5.5wt％蔗糖、0.01wt％D‑半乳糖、700mg/L LH、1.5mg/L甘露醇、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。第二悬浮培养液为包含5.5wt％蔗糖、0.01wt％D‑半乳糖、700mg/L LH、1.5mg/L甘露醇、0.2mg/L赤霉素A12、0.2mg/L赤霉素A13、0.2mg/L赤霉素A15、0.2mg/L赤霉素A19和0.2mg/L赤霉素A23的MS培养基。

[0056] 3、生物量的测定

[0057] 西洋参悬浮细胞生物量的测定，将培养液经，600r/min离心5min，沉淀即为收集的细胞，冷冻干燥，再称重。

[0058] 4、西洋参细胞活力检测

[0059] 取西洋参悬浮细胞液，600r/min离心5min后，去除上清，加入5mL现配的0.2％氯化三苯四氮唑(TTC，上海源叶生物科技有限公司，CAS:298‑96‑4)的pH7.0 PBS缓冲液，常温下暗处理14h。去除上清溶液，用5mL蒸馏水清洗细胞，待细胞沉淀静止后，吸去上清再次洗涤细胞，共重复3次。用5mL 95％乙醇脱色处理，于60℃水浴30min，每隔5min轻晃倒置试管摇匀。待细胞沉淀后用紫外分光光度计测定上清溶液的OD值，即代表细胞活力。

[0060] 5、西洋参细胞总皂苷含量检测

[0061] 参考《食品中总皂有含量的测定分光光度法》(T/AHFIA004‑2018)检测西洋参细胞中总皂苷含量。

[0062] 标准曲线：准确称取20.00mg的西洋参皂苷标准品(南京泽朗医药科技有限公司)，用70％乙醇溶解，定容至20mL，配得2mg/mL的母液，准确稀释成0.002mg/mL、0.004mg/mL、0.008mg/mL、0.01mg/mL和0.015mg/mL的梯度标准溶液各20mL，并且向其中加入5％香草醛冰醋酸溶液0.20mL，使残渣溶解，再加入0.80mL高氯酸混匀后，于60℃水浴加热20min，冷却后，再加入5.00mL冰醋酸，摇匀后，于560nm波长处测定吸光度。以标准品质量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。

[0063] 供试品：离心收集西洋参悬浮细胞，冷冻干燥后，研磨成粉末状，精确称取1克粉末，用滤纸包好，置沙氏提取器中，加甲醇回流提取24小时，乙醚脱脂，正丁醇萃取，减压回收正丁醇，残留物用去离子水溶解，冷冻干燥，准确称取1mg，配制成20mL溶液，参照梯度标准溶液的处理方法处理后，于560nm波长处测定吸光度，代入回归方程即可计算得到供试品的浓度和含量，并计算按公式计算，总皂苷产率＝皂苷含量×单位体积细胞悬浮培养物干重(mg/L)。

[0064] 6、西洋参根悬浮细胞总蛋白提取

[0065] 收集悬浮细胞，用pH7.4 0.05MTris‑HCl缓冲液超声破碎处理30min后，加入硫酸铵至80％的饱和度，同时持续搅拌。通过透析去除硫酸铵，将沉淀物溶解在水中，应用中空纤维膜上，并将浓缩溶液冻干，得到西洋参悬浮一下吧的蛋白冻干粉，用Bradford法测定的AGP中蛋白含量；并按公式计算，总蛋白产率＝蛋白含量×单位体积细胞悬浮培养物干重(mg/L)。

[0066] 7、西洋参根悬浮细胞的蛋白酶解

[0067] 取上述提取的西洋参根悬浮细胞根蛋白冻干粉50mg，加入500mL pH＝9.0的0.1M的碳酸钠‑碳酸氢钠缓冲液中，同时就加入碱性蛋白酶(合肥盛润生物制品有限公司，食品级)使得其浓度为5000/mL，于55℃处理6h以上，煮沸5min使酶失活，恢复到室温，3500rpm 4℃离心后，取上清，得酶解液。

[0068] 8、凝胶层析纯化

[0069] 将上述制得的酶解液，减压浓缩后上样至Sephadex G‑50(货号S8150，Solarbio)的凝胶层析柱(10mm×600mm)，静置吸附15min后，10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)流速为1mL/min进行洗脱，280nm观察到的吸收峰值，收集峰值洗脱液，每管2mL，然后冻干，即可得到酶解液中纯化的多肽冻干粉。

[0070] 9、SDS‑PAGE

[0071] 将凝胶层析纯化得到的西洋参肽，采用12.0％分离凝胶进行十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)。

[0072] 10、RP‑HPLC分离纯化

[0073] 将上述得到的冻干粗粉，经上述的截留分子量为7000的透析袋MD34(北京索莱宝科技优选公司)透析浓缩和除盐后，0.22μm过滤，以HPLC制备色谱纯化，按峰分别收集足量洗脱液，冷冻干燥，溶解于0.15％的甲酸水溶液中，以作为RP‑HPLC的供试品，上样下述的C18色谱柱，收集色谱峰洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到西洋参肽冻干粉。

[0074] 制备色谱的条件为：液相制备色谱柱Supersil AQ‑C18(5μm,10mm×200mm,大连依利特)，安捷伦HPLC1200系列系统(安捷伦，沃尔德布朗，德国)，二极管阵列探测器(DAD)。流动相为：A相0.1％三氟乙酸，B相含0.1％三氟乙酸的乙腈；梯度程序为：0→65min，线性梯度1→34％B相；65→75min，线性梯度34→45％B；75→80min，47→90％B；80→90min，线性梯度
90％B。流速为0.6ml/min，柱温为25℃，注入量为10μL，DAD波长设置为214nm。

[0075] 11、西洋参肽序列鉴定

[0076] 配制供试品溶液：用配置含乙腈、超纯水、三氟乙酸体积比为200：100：3(V/V)的比例制备酸溶液，加入芥子酸致使终浓度为100mg/mL，即得到溶液B；称取适量1μL西洋参肽冻干粉溶于1μL溶液B中，即可得到供试品溶液，0.45μm滤膜过滤后，即即可进行MALDI‑TOF‑MS检测。

[0077] 色谱条件：HPLC检测模式：紫外；扫描范围50～2000m/z；毛细管出口电压：166.0V，Skimmer联用系统电压：40.0V，Oct 1DC 12.00V，Oct 2DC 2.70V，Ampl分离宽度:4.0m/z，碎裂器电压：1.00Vt；离子极性：正离子；离子源类型：ESI(电喷雾离子化)；干燥温度：325℃，雾化器压力：15.00psi，干燥器流速：5.00L/min。多肽和多肽的碎片的质量电荷比每次全扫描后采集10个碎片图谱。原始文件用Mascot 2.3软件中的de navy算法分析。相关参数为:Enzyme＝none,Variable modifi‑canon：Oxidation(M)，Peptides tolerance:20ppm，MS/MS tolerance：0.1u，Mascot结果过滤参数为FDR≦0.01。

[0078] 二、结果

[0079] 表1

[0080] 实施方式 生物量(g/L) 细胞活力 总皂苷产率(mg/L) 总蛋白产率(g/L)实施例1 10.09±0.24b 0.53±0.064a 367.6±31.5b 1.61±0.22a
实施例2 10.15±0.17b 0.55±0.057a 375.8±29.7ab 1.62±0.17a
实施例3 10.23±0.15b 0.57±0.054a 378.6±32.6ab 1.64±0.16a
实施例4 10.24±0.21b 0.61±0.043a 382.1±26.4ab 1.66±0.22a
实施例5 10.25±0.18b 0.64±0.035a 386.4±19.7a 1.68±0.15a
实施例6 10.28±0.20b 0.67±0.023a 390.3±25.4a 1.67±0.16a
对比例1 8.27±0.24c 0.31±0.016b 323.7±19.4c 1.28±0.14b
对比例2 8.15±0.17c 0.32±0.018b 325.4±22.3c 1.25±0.17b
对比例3 8.32±0.18c 0.34±0.022b 326.9±18.6c 1.24±0.16b
对比例4 7.86±0.11d 0.29±0.021b 321.8±26.4c 1.19±0.19b
对比例5 11.38±0.28a 0.62±0.014a 385.4±24.9a 1.65±0.25a
对比例6 10.04±0.21b 0.54±0.012a 372.5±30.7ab 1.64±0.12a
对比例7 10.07±0.18b 0.55±0.013a 374.8±33.2ab 1.66±0.14a

[0081] 在经过上述各实施例和对比例对西洋参根愈伤组织无性系的悬浮培养过程中，在培养的第0～4天细胞初步延迟，第4天后进行对数生长期，在10～20天细胞进行大量繁殖期，生物量达到最大，其总皂苷产率和总蛋白产率均达到最大。由表1可知，实施例1～6在对西洋参根愈伤组织无性系所得的悬浮细胞的生物量、细胞活力、总皂苷产量和总蛋白产率显著高于对比例1～4，由此说明，本申请实施例提供的对西洋参根愈伤组织无性系的悬浮培养过程更有利于累积其生物量、皂苷和蛋白，并能维持较高的细胞活力。

[0082] 更进一步的，本申请还对各实施例和对比例对西洋参根愈伤组织无性系所得的悬浮细胞中蛋白进行酶解处理，对酶解液进行凝胶纯化，实施例1～6在其洗脱收集管中，第50管以后均纯化得到多个纯化分峰；而对比例1～7的洗脱收集管较多几种在第1～50收集管。并对实施例1～6和对比例1～7收集组分进行命名，具体如表2所示；由于对比例3、4在第1～
20管集中了大量的OD280nm洗脱峰，洗脱分离效果较差，不对其进行单独命名。

[0083] 表2

[0084] 实施方式 洗脱组分实施例1 F1、F2、F3、F4、F5
实施例2 F6、F7、F8、
实施例3 F9、F10、F11
实施例4 F12、F13、F14
实施例5 F15、F16、F17、F18
实施例6 F19、F20、F21、F22、F23
对比例1 F24、F25
对比例2 F26、
对比例3 －
对比例4 －
对比例5 F27、F28
对比例6 F29
对比例7 F30

[0085] 表2中所涉及的洗脱组分的SDS‑PAGE图入如图3和图4所示。结果可知，F3、F4、F8、F9、F10、F11、F13、F14、F15、F16、F17、F18、F21、F22和F23的条带较好，进而采用RP‑HPLC继续分离纯化，如图5、6所示，并对其洗脱峰进行收集和序列鉴定，结果如表3所示。

[0086] 表3

[0087]

[0088] 体外抗氧化性能

[0089] 1、供试品

[0090] 将上述制得的SEQ ID NO.1～8所示的西洋参多肽(分别命名为西洋参肽1～8)，将其制备成冻干粉，配制成0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL和2.5mg/mL。

[0091] 2、对DPPH自由基的清除作用采用

[0092] 取各浓度供试品溶液1ml于试管中，加入0.1mmol/L的DPPH工作液4.5mL，充分摇匀，避光反应30min，测定515nm波长下的吸光度，空白组以蒸馏水代替供试品。按下式计算供试品对DPPH自由基的清除率：清除率(％)＝(A0－A)/A0×100％；其中，A0、A1分别代表空白和供试品的吸光度。

[0093] 3、对羟基自由基的清除作用

[0094] 于试管中加入各浓度供试品溶液(空白用蒸馏水代替)1ml，再加入9mmo1/L的水杨酸‑乙醇溶液、9mmo1/L FeSO4溶液各1ml，最后加入8.8mmo1/L H2O2溶液1m1，37℃条件下反应30min，在510nm下测光度值。按下式计算供试品对羟基自由基的清除率(％)＝(A0－A)/A0×100％；A0、A分别代表空白、供试品反应液吸光度。

[0095] 4、对超氧阴离子的清除作用

[0096] 取各浓度供试品1ml，加入0.05mol/L,pH＝8.2的Tris‑HCl缓冲溶液5ml，置于25℃水浴中预热20min，再加入4.5mmol/L邻苯三酚0.4m1，混合均匀后，测定在320nm波长下初始时和1min后的吸光度值。空白以相同体积蒸馏水代替供试品，按下式计算供试品对超氧阴离子的清除率(％)＝(ΔA0－ΔA)/ΔA0×100％；ΔA0，ΔA分别代表空白和供试品1min的吸光度差。

[0097] 5、统计学分析

[0098] 所有测试数据均以平均值和标准偏差表示。

[0099] 6、结果

[0100] 表4DPPH清除率

[0101]

[0102]

[0103] 表5羟基自由基清除率

[0104]

[0105] 表6超氧阴离子清除率

[0106]

[0107] 由表4、5、6可知，西洋参肽1～8在浓度达到1.0mg/ml时，其对DPPH、羟基自由基和超氧阴离子的清除率均达到80％以上，具有较佳的体外抗氧化性能。

[0108] 体内试验

[0109] 一、实验方法及材料

[0110] 1、实验动物

[0111] Wistar大鼠，江苏艾菱菲；雌雄各半，体质量200±20kg，正常饮食。

[0112] 2、造模

[0113] 45mg/kg戊巴比妥钠溶液腹腔注射到SD大鼠体内，用75％酒精对大鼠腹部左侧皮肤消毒，切口，沿左季肋下1.5～2.0cm，距脊柱约1.0cm，处用玻璃棒小心分离左肾动脉，用缝线对左肾动脉进行结扎手术，手术后对肌肉及皮肤逐层缝合。缝合后腹腔注射青霉素钠25
×10U预防术后伤口感染。空白组10只SD大鼠进行不结扎左肾动脉的假手术操作。术后4周测定手术大鼠尾动脉收缩压，高于160mmHg的大鼠可视为肾性高血压造模成功。

[0114] 3、分组实验

[0115] 将上述造模成功的肾性高血压模型大鼠分别为模型组、给药组和阳性组，另取10只正常的Wistar大鼠作物正常组。给药组按照40mg/kg体重剂量给药上述实施例提供的西洋参肽1～8。阳性组按照同样剂量给药卡托普利(特一药业集团股份有限公司，国药准字H44020939)。均连续给药12周，每天给药1次，空白组与模型组每天灌胃给予等体积的生理盐水。

[0116] 4、观察指标

[0117] 末次给药2h后，对各组大鼠血压进行测量，颈椎脱臼处死大鼠。取血，分离血清，ELISA试剂盒(沪震生物)检测大鼠血浆中血管紧张素I(AngI)、血管紧张素II(AngII)和醛固酮(ALD)(General Aldosterone(ALD)，货号ZY‑ALD‑Ge)含量。切取0.1g胸主动脉组织，匀浆后测定Ang II的含有量。

[0118] 5、统计学分析

[0119] 所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对数据进行多重比较和显著性差异标记。

[0120] 二、结果

[0121] 表7

[0122]

[0123] 表7每一行数据进行显著差异比较，结果由表7可知，相对于正常组，模型组、阳性组和给药组大鼠在术后第4周的血压均显著高于正常组，并且平均收缩血压均超过了160mmHg，说明造模成功。给药组和阳性组大鼠均在术后第4周开始进行干预治疗，给药第6周后，大鼠平均收缩血压均相对于术后第4周显著下降，说明对肾性高血压模型大鼠进行卡托普利或本申请实施例提供的西洋参肽1～8进行干预治疗，均能达到显著降低其血压的作用，说明本申请实施例提供的西洋参肽1～8具有与卡托普利相当的降血压作用。

[0124] 表8

[0125]

[0126]

[0127] 表8中，对每一列数据进行了多重比较和显著性差异标记。由表8可知，相对于正常组，模型组大鼠血清中AngI、AngII和ALD含量均显著高于正常组，说明造模成功。对肾性高血压模型大鼠进行卡托普利干预后，AngII和ALD含量均相对于模型组显著降低，而对AngI无下降作用，干预治疗后的AngI含量甚至高于模型组。在给药组中，西洋参肽1～8对肾性高血压模型大鼠进行干预治疗后，AngII和ALD含量均相对于模型组显著降低；而除肽1外，对AngI含量也具有相对于模型组的下降作用。由此说明，采用本申请实施例提供的西洋参肽1～8能够显著降低对肾性高血压模型大鼠血清中AngI、AngII和ALD含量。

[0128] 在上述造模是通过对大鼠左肾动脉进行结扎，以引起肾动脉血流量减少，依次激活肾素、血管紧张素和醛固酮系统(RAAS)，导致该RAAS失去平衡后，由肝脏产生的血管紧张素原被释入静脉血中的肾素水解为Ang I，再经肺循环中血管紧张素转化酶(ACE)的催化转化为Ang II；Ang II含有量增加，小动脉平滑肌收缩，外周阻力增加。同时刺激肾上腺皮质球状带，使ALD分泌增加，从而使肾小管远端集合管钠再吸收增强，导致体内水与钠潴留，引起血压升高。而经过对大鼠血清中AngI、AngII和ALD含量分析发现，本申请实施例提供的西洋参肽1～8能够显著降低RAAS失衡引起的AngI、AngII和ALD含量升高，推测其可能通过抑制ACE得以调节AngI和AngII含量得以实现；而ALD的生成主要受AngII、促肾上腺皮质激素以及体液中钠离子和钾离子调节，故而，本申请实施例提供的西洋参肽1～8具有改善RAAS失衡，降低血压，具有在改善肾性高血压引起的继发性高血压、进展开舒张期伴随腰酸背痛等领域的潜在应用前景。

[0129] 综上所述，本申请利用西洋参苗制备其愈伤组织，通过对愈伤组织进行诱导培养得到其无性系，通过大规模悬浮培养得到其高产细胞株，并对其细胞培养物进行酶解、纯化等步骤，得到了西洋参肽1～8。再经体外实验发现，该西洋参肽1～8均有明显的抗氧化性能。最后，通过体内实验证实，该西洋参肽1～8不仅具有与卡托普利相当的降血压作用，而且具体是通过改善RAAS失衡来实现降血压的作用，具有在改善肾性高血压引起的继发性高血压、进展开舒张期伴随腰酸背痛等领域的潜在应用前景。

[0130] 以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。