天麻均一多糖及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及天麻均一多糖及其制备方法和应用，本发明制备的天麻均一多糖对Akk菌具有显著的促生长作用，对多种与Akk菌相关的疾病，具有潜在的改善和治疗作用，且天麻均一多糖从药食同源的中药天麻中分离得到，制备来源丰富，安全性较好。

权利要求

1.一种天麻均一多糖，其特征在于，主要由端基连接葡萄糖、1,4‑连接葡萄糖、1,6‑连接葡萄糖、1,3,4‑连接葡萄糖和1,4,6‑连接葡萄糖以摩尔比5.14:6.91:4.10:1.00:3.84组成。

2.根据权利要求1所述的天麻均一多糖，其特征在于，所述天麻均一多糖的总糖含量大于或等于90％；和/或所述天麻均一多糖的分子量为24kDa‑26kDa。

3.一种天麻均一多糖，其特征在于，主要由端基连接葡萄糖、1,4‑连接葡萄糖、1,6‑连接葡萄糖、1,3,6‑连接葡萄糖和1,4,6‑连接葡萄糖以摩尔比4.87:10.13:10.87:1.00:5.03组成；其中，所述1,3,6‑连接葡萄糖上连接有对羟基苯甲醇的柠檬酸酯。

4.根据权利要求3所述的天麻均一多糖，其特征在于，所述1,3,6‑连接葡萄糖的1位上连有‑(A)n‑B单元，其中，A为对羟基苯甲醇，B为柠檬酸，n为1、2、3、4、5、6或7，A的酚羟基与相邻A的苯甲醇的羟基之间形成醚键，A的酚羟基和B的羧基之间形成酯键。

5.根据权利要求3或4所述的天麻均一多糖，其特征在于，所述天麻均一多糖的总糖含量大于或等于90％；和/或所述天麻均一多糖的分子量为19kDa‑21kDa。

6.权利要求1‑5任一项所述的天麻均一多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用水提醇沉法，得到沉淀物；

将所述沉淀物溶于水中，除去蛋白质，并浓缩、透析，干燥，制得天麻粗多糖；

将所述天麻粗多糖加水溶解，并进行柱分离，制得所述天麻均一多糖。

7.权利要求1‑5任一项所述的天麻均一多糖在制备促嗜粘蛋白‑阿克曼氏菌生长的药物或食物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物或所述食物用于提高肠道内的嗜粘蛋白‑阿克曼氏菌的丰度 。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物用于治疗或预防肥胖、糖尿病、炎症、代谢紊乱、癌症、早衰症、渐冻症、IBD、高血压、或孤独症。

10.权利要求1‑5任一项所述的天麻均一多糖在制备治疗或预防肥胖、糖尿病、炎症、代谢紊乱、癌症、早衰症、渐冻症、IBD、高血压、或孤独症的药物中的应用。

说明书

天麻均一多糖及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及药物技术领域，特别涉及天麻均一多糖及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 2004年，荷兰瓦赫宁根大学微生物学的研究者们鉴定出了一种新的粘液降解菌，称为嗜粘蛋白‑阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila,Akk菌)。Akk菌是一种椭圆形的革兰阴性菌，占人体微生物群落的3‑5％，它主要寄生在肠道粘液层中，利用宿主分泌的粘蛋白“为食”，并通过竞争性排斥的方式在肠道内定居并保护肠道免受病原体的侵害。虽然Akk菌以粘蛋白作为能量来源，但大量观察证实，Akk对肠道粘液层厚度和肠屏障完整性存在正向调节作用。

[0003] Akk菌因其在许多疾病中被发现的“益生”作用，而受到人们的广泛关注。目前，Akk菌的体内丰度已被广泛认为与肥胖、糖尿病、炎症和代谢紊乱显著负相关。另外，研究还表明Akk菌还与癌症、早衰症、渐冻症、IBD、高血压、孤独症等都有相关性。因此，如果提高Akk菌在肠道的丰度，对上述疾病就有一定的改善作用，如：文献指出Akk菌，可逆转高脂饮食引起的代谢紊乱，预防肥胖和相关并发症【Everard,A.；Belzer,C.；Geurts,L.；et al.,Cross‑talk between Akkermansia muciniphilaand intestinal epithelium controls diet‑induced obesity,PANS,2013,110,9066‑9071.】；Akk菌改善脂肪沉积、葡萄糖耐受性和低度炎症[Zhao,S.；Liu,W.；Wang,J.；et al.,Akkermansia muciniphila improves metabolic profiles by reducing inflammation in chow diet‑fed mice,J Mol Endocrinol.2017,58(1),1‑14.]；Akk菌对于早衰症中加速的老化也具备防护作用[Bárcena,C.；Valdés‑Mas,R.；Mayoral,P.；et al.,Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progressed mice,Nat.Med.2019,25,1234‑1242.]。由此可见，如果能够找到一类物质，能够促进Akk菌的生长，提高它在肠道中的丰度，就有可能对上述疾病起到改善和治疗的作用。

发明内容

[0004] 基于此，有必要提供一种天麻均一多糖及其制备方法和应用，该天麻均一多糖能够促进Akk菌的生长，提高Akk菌在肠道中的丰度。

[0005] 本发明第一方面提供了一种天麻均一多糖，主要由端基连接葡萄糖、1,4‑连接葡萄糖、1,6‑连接葡萄糖、1,3,4‑连接葡萄糖和1,4,6‑连接葡萄糖以摩尔比5.14:6.91:4.10:1.00:3.84组成。

[0006] 本发明第二方面提供了一种天麻均一多糖，主要由端基连接葡萄糖、1,4‑连接葡萄糖、1,6‑连接葡萄糖、1,3,6‑连接葡萄糖和1,4,6‑连接葡萄糖以摩尔比4.87:10.13:10.87:1.00:5.03组成；其中，所述1,3,6‑连接葡萄糖上连接有对羟基苯甲醇的柠檬酸酯。

[0007] 本发明第三方面提供了第一方面和第二方面的天麻均一多糖的制备方法，包括以下步骤：

[0008] 采用水提醇沉法，得到沉淀物；

[0009] 将沉淀溶于水中，除去蛋白质，并浓缩、透析，干燥，制得天麻粗多糖；

[0010] 将天麻粗多糖加水溶解，并进行柱分离，制得天麻均一多糖。

[0011] 本发明第四方面提供了一种药物，包括

[0012] 1)活性组分，活性组分为本发明第一方面和第二方面的天麻均一多糖中的至少一种；

[0013] 2)药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、辅料和稀释剂中至少一种。

[0014] 本发明第五方面提供了第一方面和第二方面所述的天麻均一多糖在制备促嗜粘蛋白‑阿克曼氏菌(Akk)生长的药物或食物中的应用。

[0015] 本发明第六方面提供了第一方面和第二方面所述的天麻均一多糖在制备治疗或预防肥胖、糖尿病、炎症、代谢紊乱、癌症、早衰症、渐冻症、IBD、高血压、或孤独症的药物中的应用。

[0016] 有益效果

[0017] 本发明制备的天麻均一多糖对Akk菌具有显著的促生长作用，对多种与Akk菌相关的疾病，具有潜在的改善和治疗作用，且天麻均一多糖从药食同源的中药天麻中分离得到，制备来源丰富，安全性较好。

附图说明

[0018] 图1为GEP‑3的SEM测试图，图中可见GEP‑3为片状结构，表面树皮状，片状直径大小在50‑200μm；

[0019] 图2为GEP‑3的SEM测试图，图中可见GEP‑4为薄片状结构，表面不光滑，有突起，片状直径大小在200‑1200μm；

[0020] 图3为GEP‑3的HPGPC图，表明GEP‑3为均一多糖；

[0021] 图4为GEP‑4的HPGPC图，表明GEP‑4为均一多糖；

[0022] 图5为GEP‑2、GEP‑3和GEP‑4促进Akk菌的生长。

[0023] 图6为在1mg/mL剂量下，GEP‑3和GEP‑4显著促进高脂小鼠粪便混合菌中Akk菌的生长。

具体实施方式

[0024] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

[0025] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

[0026] 术语解释

[0027] 本发明中的“均一多糖”指单糖分子缩合而成的多糖，应理解的，组成均一多糖的单糖分子的结构可以相同，也可以不相同。

[0028] 使用方法

[0029] 本发明的多糖、组合物或药物的剂型和施用方式没有特别限制。代表性的施用方式包括但并不限于：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)注射、和局部给药。

[0030] 用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

[0031] 用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，具体例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3‑丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。如悬浮液可包含悬浮剂，具体例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物。

[0032] 用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

[0033] 用于局部给药的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。由活性成分在无菌条件下与药学上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合而成。

[0034] 本发明的活性组分、组合物、药物等可以单独施加，也可以和其他药物一起施加，仅需不予本发明的发明目的相悖即可，不应理解为对本发明的限制。

[0035] 详细解释

[0036] 本发明第一方面提供了一种天麻均一多糖(以下简称GEP‑3)，主要由端基连接葡萄糖、1,4‑连接葡萄糖、1,6‑连接葡萄糖、1,3,4‑连接葡萄糖和1,4,6‑连接葡萄糖以摩尔比5.14:6.91:4.10:1.00:3.84组成。

[0037] 在一实施例中，天麻均一多糖由端基连接葡萄糖、1,4‑连接葡萄糖、1,6‑连接葡萄糖、1,3,4‑连接葡萄糖和1,4,6‑连接葡萄糖以摩尔比5.14:6.91:4.10:1.00:3.84组成。

[0038] 在一实施例中，天麻均一多糖的总糖含量大于或等于90％；进一步地，麻均一多糖的总糖含量为90％‑91％；进一步地为90.65％。

[0039] 在一实施例中，天麻均一多糖的分子量为24kDa‑26kDa；进一步地，天麻均一多糖的分子量为25kDa。

[0040] 本发明第二方面提供了一种天麻均一多糖(以下简称GEP‑4)，主要由端基连接葡萄糖、1,4‑连接葡萄糖、1,6‑连接葡萄糖、1,3,6‑连接葡萄糖和1,4,6‑连接葡萄糖以摩尔比4.87:10.13:10.87:1.00:5.03组成；其中，1,3,6‑连接葡萄糖上连接有对羟基苯甲醇的柠檬酸酯。

[0041] 在一实施例中，1,3,6‑连接葡萄糖上连有‑(A)n‑B单元，其中，A为对羟基苯甲醇，B为柠檬酸，n为大于或等于2的整数，相邻A之间形成醚键，A和B之间形成酯键；在一实施例中，n为1、2、3、4、5、6或7。

[0042] 可理解的，‑(A)n‑B单元中，A与A之间，A与B之间以化学键相连，故在分子结构中A并非以对羟基苯甲醇的形式存在，B并非以柠檬酸的形式存在，而是相应的官能团如羟基与其相邻的A或B的相应的官能团(如A的羟基，B的羧基)之间形成对应的化学键(例如醚键或酯键)，例如形成以下任一结构：

[0043]

[0044] 在一实施例中，‑(A)n‑B单元中，A的酚羟基与相邻A的苯甲醇的羟基之间形成醚键，A的酚羟基和B的羧基之间形成酯键。

[0045] 在一实施例中，天麻均一多糖的总糖含量大于或等于90％；进一步地，天麻均一多糖的总糖含量为91.57％。

[0046] 在一实施例中，天麻均一多糖的分子量为19kDa‑21kDa；进一步地，天麻均一多糖的分子量为20kDa。

[0047] 本发明第三方面提供了第一方面和第二方面的天麻均一多糖的制备方法，包括以下步骤：

[0048] S100：采用水提醇沉法，得到沉淀物；

[0049] S200：将沉淀物溶于水中，除去蛋白质，并浓缩、透析，干燥，制得天麻粗多糖；

[0050] S300：将天麻粗多糖加水溶解，并进行柱分离，制得天麻均一多糖。

[0051] 进一步地，步骤S100中，先将天麻用热水进行提取，得到提取液，将提取液进行过滤，收集滤液，将滤液进行浓缩；然后加入适量乙醇得到50％醇沉部位和90％醇沉部位，静置，离心去上清，收集90％沉淀部位。

[0052] 进一步地，步骤S200中，采用sevage法去除蛋白。

[0053] 进一步地，步骤S300中，先采用DEAE‑cellulose柱色谱初步分离，以蒸馏水、0.1、0.2、0.4和0.8mol/L的NaCl溶液洗脱，收集各流份，浓缩，透析及冻干得5个次级组分：
Water‑GEP、0.1M‑GEP、0.2M‑GEP、0.4M‑GEP及0.8M‑GEP。

[0054] Water‑GEP组分加入适量流动相溶解，离心，上清液用凝胶色谱Sephacryl S‑200进行分离，收集各流份。隔管检测490nm(硫酸‑苯酚法显色后)下的吸光度值，并根据HPGPC结果合并流份，浓缩及冷冻干燥得到均一多糖。

[0055] Water‑GEP组分加入适量流动相溶解，离心，上清液用膜分离仪(5kDa膜)进行分离，收集各流份。隔管检测490nm(硫酸‑苯酚法显色后)下的吸光度值，并根据HPGPC结果合并流份，浓缩及冷冻干燥得到所需的天麻均一多糖。

[0056] 本发明第四方面提供了一种药物，包括

[0057] 1)活性组分，活性组分为本发明第一方面和第二方面的天麻均一多糖中的至少一种；

[0058] 2)药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、辅料和稀释剂中至少一种。

[0059] 进一步地，上述组合物中，活性组分的质量百分含量为大于或等于1％；更进一步地，活性组分含量为1％‑80％；更进一步地，活性组分含量为10％‑50％。

[0060] 进一步地，药物的剂型可以为注射剂、片剂、粉末剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂或药膏。

[0061] 本发明第五方面提供了第一方面和第二方面的天麻均一多糖在制备促嗜粘蛋白‑阿克曼氏菌(Akk)生长的药物或食物中的应用。

[0062] 进一步地，药物或食物用于促进肠道内的嗜粘蛋白‑阿克曼氏菌生长。

[0063] 天麻为兰科植物天麻(Gastrodia elata Bl.)的干燥块茎，为我国传统名贵中药材，在中医临床应用广泛，具有息风止痉，平抑肝阳，祛风通络之功效。现代药理研究表明，天麻拥有良好的抗脑缺血，抗AD，神经保护，抗氧化，抗衰老和免疫增强等药理活性。天麻中的多糖类成分，是天麻重要的活性成分之一，但是天麻多糖成分复杂，表征困难，分子量范围分布较广，因此简单地将天麻粗多糖进行药效实验，很难得到有效且稳定的实验结果。

[0064] 研究发现天麻粗多糖促进Akk菌的活性并不好，但通过将天麻粗多糖进行分离纯化，得到了多个均一多糖，通过对促进Akk菌生长的活性评价，发现本发明第一方面和第二方面的天麻均一多糖，具有显著促进Akk菌生长的作用，故本发明第一方面和第二方面的天麻均一多糖对于与Akk菌相关的疾病，例如:肥胖、糖尿病、炎症、代谢紊乱、癌症、早衰症、渐冻症、IBD、高血压、或孤独症，具有潜在的改善和治疗作用。

[0065] 具体地：代谢紊乱导致的肥胖及其相关并发症【Everard,A.；Belzer,C.；Geurts,L.；et al.,Cross‑talk between Akkermansia muciniphilaand intestinal epithelium controls diet‑induced obesity,PANS,2013,110,9066‑9071.】，降低胆固醇提高胰岛素敏感性【Depommier,C.；Everard,A.；Druart,C.；et al.,Supplementation with Akkermansia muciniphila in overweight and obese human volunteers:a proof‑of‑concept exploratory study,Nat.Med.,2019,25,1096‑1103.】，抗肿瘤【Routy,B.；Chatelier,E.L.；Derosa,L.；et al.,Gut microbiome influences efficacy of PD‑1–based immunotherapy against epithelial tumors,Science,2018,359,91‑97.】早衰症【Bárcena,C.；Valdés‑Mas,R.；Mayoral,P.；et al.,Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progressed mice,Nat.Med.2019,25,
1234‑1242.】，渐冻症【Blacher,E.；Bashiardes,S.；Shapiro,H.；et al.,Potential roles of gut microbiome and metabolites in modulation of murine ALS,Nature,2019,
572,474‑480.】，IBD【Png,C.W.；Lindén,S.K.；Gilshenan,K.S.；et al.,Mucolytic bacteria with increased prevalence in IBD mucosa augment in vitro utilization of mucin by other bacteria,Am.J.Gastroenterol.,2010,105,2420‑2428.】，孤独症【Wang,L.；Christophersen,C.T.；Sorich,M.J.；et al.,Low relative abundances of the mucolytic bacterium Akkermansia muciniphila and Bifidobacterium spp.in feces of children with autism,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77,6718‑6721.】，以及高血压【Li,J.,Zhao,F.,Wang,Y.；et al.,Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension,Microbiome,2017,5,14‑32.】。故通过施加本发明的活性组分，具有预防或治疗上述疾病的潜能。

[0066] 本发明第六方面提供了本发明第一方面和第二方面所述的天麻均一多糖在制备治疗或预防肥胖、糖尿病、炎症、代谢紊乱、癌症、早衰症、渐冻症、IBD、高血压、或孤独症的药物中的应用。

[0067] 本发明第七方面提供了一种平衡或促进肠道内Akk菌的方法，包括以下步骤：向待处理对象施加本发明第一方面、第二方面所述的天麻均一多糖或第四方面所述的药物。进一步地，优选待处理对象为哺乳动物；更进一步地，优选待处理对象为人。

[0068] 本发明第八方面提供了一种治疗肥胖、糖尿病、炎症、代谢紊乱、癌症、早衰症、渐冻症、IBD、高血压、或孤独症的方法，包括以下步骤：向待处理对象施加本发明第一方面、第二方面所述的天麻均一多糖或第四方面所述的药物。进一步地，优选待处理对象为哺乳动物；更进一步地，优选待处理对象为人。

[0069] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不局限于此。

[0070] 下述制备例中，SephacrylTM S‑200购买自GE公司；DEAE‑52阴离子交换树脂购买自Whatman公司。

[0071] 制备实施例

[0072] 实施例1：天麻均一多糖GEP‑3和GEP‑4的制备

[0073] 天麻药材3kg粉碎，用30倍量水溶液于70℃提取3次，浓缩，离心，上清液加入等体积的95％乙醇，静置，离心，上清液减压浓缩后，加入18倍体积的95％乙醇，静置过夜，离心，沉淀用水复溶，再以Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)去除游离蛋白，透析，浓缩，冷冻干燥即得粗多糖GEP90。粗多糖300g加蒸馏水溶解，离心，上清液用DEAE‑cellulose柱色谱进行初步分离。以蒸馏水、0.1、0.2、0.4和0.8mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱体积大于2倍柱体积(约10L)，流速为25mL/min，收集各流份，隔管检测490nm(硫酸‑苯酚法显色后)下的吸光度值。根据糖显色反应并结合HPGPC检测的结果，合并流分，浓缩，透析及冷冻干燥得5个次级组分：Water‑GEP、0.1M‑GEP、0.2M‑GEP、0.4M‑GEP及0.8M‑GEP。

[0074] 将Water‑GEP(3.00g)加蒸馏水溶解，离心，上清液用Sephacryl TM S‑200凝胶色谱柱分离，用蒸馏水溶液洗脱，流速为0.5mL/min，收集各流分。隔管检测490nm(硫酸‑苯酚法显色后)下的吸光度值，根据检测结果合并相同流分，浓缩、透析及冷冻干燥得均一多糖GEP‑3(120mg)，其SEM图如图1所示。

[0075] 将Water‑GEP(100.00g)加蒸馏水溶解，离心，上清液用膜分离仪(5kDa膜)进行分离，收集各流份。隔管检测490nm(硫酸‑苯酚法显色后)下的吸光度值，并根据HPGPC结果合并流份，浓缩及冷冻干燥得到均一多糖GEP‑4(30g)，其SEM图如图2所示。

[0076] 经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)检测GEP‑3和GEP‑4均为均一成分(参见图3和图4)。

[0077] 实施例2：天麻多糖(GEP‑3和GEP‑4)的结构表征

[0078] (1)分子量的测定

[0079] 用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)进行多糖样品的相对分子力量的测定，基本原理是均一多糖通过凝胶渗透色谱，形成对称的色谱峰，出峰时间与分子量大小相关，根据已知分子量得出的校正曲线进行计算。

[0080] 色谱条件：用TSK GMPWXL凝胶柱进行分离，流速0.8mg/ml，进样量20μL，超纯水为流动相，柱温25℃，检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)。

[0081] 实验方法：准确称取均一多糖和Dextrans系列标准品各2.0mg，用超纯水水配置成2.0mg/mL的溶液，进样前用0.45微米的微孔滤膜过滤后检测，记录保留时间，以标准多糖分子量的对数值(Lg)为纵坐标，保留时间为横坐标绘制标准曲线，得出相应的线性回归方程，计算均一多糖的相对分子量。GEP‑3和GEP‑4的相对分子量分别为25kDa和20kDa。

[0082] (2)总糖含量测定

[0083] 硫酸‑苯酚法测定GEP‑3总糖含量为90.65％，GEP‑4总糖含量为91.57％。

[0084] (3)单糖组成分析

[0085] GEP‑3和GEP‑4分别经2mol/L TFA于110℃反应5h进行完全酸水解，得到的完全酸水解产物，再在浓氨水的碱性条件与0.2mol/L PMP甲醇溶液反应150min进行衍生化，衍生化产物进行LC‑MS分析。GEP‑3和GEP‑4都是由葡萄糖组成的多糖。

[0086] (4)甲基化分析

[0087] 采用改良Hakomori法分别对多糖进行甲基化，甲基化后的产物用2mol/L TFA全水解，NaBD4还原和醋酐乙酰化制成部分甲基化的阿尔迪醇乙酸酯衍生物，然后进行GC‑MS分析。

[0088] 结合标准图谱，GEP‑3甲基化结果显示结构中含端基连接葡萄糖、1,4‑连接葡萄糖、1,6‑连接葡萄糖、1,3,4‑连接葡萄糖和1,4,6‑连接的葡萄糖组成，摩尔比为5.14:6.91:4.10:1.00:3.84。

[0089] GEP‑4甲基化结果显示结构中含：端基连接葡萄糖、1,4‑连接葡萄糖、1,6‑连接葡萄糖、1,3,6‑连接葡萄糖和1,4,6‑连接的葡萄糖组成，摩尔比为4.87:10.13:10.87:1.00:5.03。

[0090] (5)均一多糖中柠檬酸、对羟基苯甲醇的连接的确认

[0091] GEP‑4经2mol/L TFA于110℃全水解后，得到的产物旋干后加适量50％甲醇溶解，进行LC‑MS分析。根据碎片进行初步分析后，分别以柠檬酸为对照品进行LC‑MS的初步定量分析。

[0092] 结果表明GEP‑4结构中含有系列对羟基苯甲醇柠檬酸酯，其中，柠檬酸含量为3.44％。经核磁HMBC相关信号确认，GEP‑4中的对羟基苯甲醇柠檬酸酯连接在1,3,6‑连接葡萄糖的1位。

[0093] 试验实施例1：天麻多糖促Akk菌生长评价

[0094] (1)试验材料

[0095] Akk菌(Akkermansia muciniphila strain ATCC BAA‑835)购自商城北纳创联生物科技有限公司。

[0096] (2)试验方法

[0097] Akk菌体外生长检测使用BioTek 800TS型吸收光酶标仪。

[0098] (3)实验操作及结果

[0099] 将Akk菌在合成培养基(3.85g脑心浸出培养基(BHI)，1.6g大豆蛋白胨，1.13g无水葡萄糖，0.55g N‑乙酰葡糖胺，0.4g L‑苏氨酸，0.05g L‑半胱氨酸，100mL纯水)上活化，称取多糖分子用培养基溶化，使终浓度为1mg/mL。将Akk菌转接至液体培养基中制备种子液，接种前测其OD600值，将种子液添加入含有多糖的培养体系中，使体系终浓度OD600值达到0.1，将培养体系置于37℃厌氧环境中培养，并于24h收集培养物，测其OD600值，计算多糖促Akk菌的生长率，实验结果如图5和表1所示。

[0100] 促Akk菌的生长率％＝(样品吸光值–空白吸光值)/空白吸光值×100％[0101] 表1、GEP‑2、GEP‑3和GEP‑4促Akk菌的生长率

[0102]化合物 24h促Akk菌的生长率(％)
GEP‑2 ‑13.7
GEP‑3 17.6
GEP‑4 11.7

[0103] 表1中，GEP‑2为从天麻中分离出的另一种均一多糖，分子量为20kDa。

[0104] 分析及结论：

[0105] 实验结果表明，从天麻中分离得到GEP‑2、GEP‑3和GEP‑4均一多糖，在24小时的时间点并不是所有都表现出对Akk均的促生长作用，其中的GEP‑2还表现出了抑制作用。而GEP‑3和GEP‑4则表现出了对Akk菌的促生长作用，促生长率均在10％以上。

[0106] 试验实施例2：天麻多糖促混合菌中Akk菌的生长评价

[0107] (1)试验材料

[0108] 高脂饮食的肥胖小鼠(HFD小鼠)的新鲜粪便培养的混合菌。

[0109] (2)试验方法

[0110] Akk菌体外生长检测使用BioTek 800TS型吸收光酶标仪。

[0111] (3)实验操作及结果

[0112] 新鲜粪样取自HFD小鼠，收集粪便标本于无菌管中，用1×PBS稀释得到10％(w/v)溶液，匀浆后冰上静置10分钟，2000rpm离心10分钟，获得最终粪便接种物。然后将0.2mL的粪便接种物注射到含有1mg/mL GEP‑3或GEP‑4的4mL GAM培养基中，未加GEP处理的培养基作为对照。各处理组在37℃微厌氧培养系统下接种粪菌发酵，并于24取出发酵液进行分析。收集培养液，用酶标仪测定OD600。

[0113] 促Akk菌的生长率％＝(样品吸光值–空白吸光值)/空白吸光值×100％[0114] 分析及结论：

[0115] 图6的实验结果表明，GEP‑3和GEP‑4可以显著促进HFD小鼠粪便的混合菌群中，Akk均的生长。在1mg/mL的剂量下，GEP‑3将Akk菌的表达量提高了18.5倍，GEP‑4将Akk菌的表达量提高了8.9倍，由此可见，GEP‑3和GEP‑4对混合菌中Akk菌的促生长作用，效果明显。

[0116] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0117] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。