猪瘟病毒的多聚体疫苗及其制备方法转让专利
申请号 : CN202210425979.1
文献号 : CN114835822B
文献日 : 2022-11-04
发明人 : 查银河 , 盖其静 , 余晓玉 , 张稳涛
申请人 : 浙江洪晟生物科技股份有限公司
摘要 :
本发明公开了猪瘟病毒的多聚体疫苗及其制备方法，属于生物制品领域。本发明公开的疫苗活性成分为由融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG和融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG连接而成的蛋白质。还提供该蛋白质的制备方法，包括在生物细胞中表达融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG和融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG的编码基因，得到上述蛋白质的步骤。本发明利用蛋白质工程的方法，将SpyTag融合在E2和Fc蛋白中，与白喉毒素突变体CRM197融合SpyCatcher进行共表达，最后形成免疫刺激物聚体E2蛋白，状态更稳定，免疫效果更好。
权利要求 :
1.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质由融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG和融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG连接而成；
所述融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG从N端到C端分别是CSFV‑E2、SpyTag多肽和猪IgG重链恒定区，所述融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG从N端到C端分别是CRM197、SpyCatcher多肽和猪IgG轻链恒定区，其中SpyTag与SpyCatcher能够自发形成异肽键偶联，从而将所述融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG和所述融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG连接；
所述融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG为下述A1)或A2)：A1).氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
A2).在A1)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG为下述B1)或B2)：B1).氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
B2).在B1)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子由编码所述融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG的核酸分子和编码所述融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG的核酸分子组成；
所述编码融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG的核酸分子是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
所述编码融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG的核酸分子是SEQ ID No.2所示的DNA分子。
3.表达盒，其特征在于：所述表达盒含有权利要求2中所述的核酸分子。
4.重组载体，其特征在于：所述重组载体含有权利要求2所述的核酸分子或含有权利要求3所述的表达盒。
5.重组微生物，其特征在于：所述重组微生物含有权利要求2所述的核酸分子或含有权利要求3所述的表达盒或含有权利要求4所述的重组载体。
6.重组转基因细胞系，其特征在于：所述重组转基因细胞系含有权利要求2所述的核酸分子或含有权利要求3所述的表达盒或含有权利要求4所述的重组载体。
7.猪瘟疫苗，其包含权利要求1所述的蛋白质。
8.权利要求1所述蛋白质的制备方法，包括如下步骤：使权利要求1中所述融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG的编码基因和权利要求1中所述融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG的编码基因在生物细胞中进行表达得到所述蛋白质的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述生物细胞为非人哺乳动物细胞。
10.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的表达盒或权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组微生物或权利要求6所述的重组转基因细胞系在制备预防猪瘟的产品中的应用。
说明书 :
猪瘟病毒的多聚体疫苗及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物制品领域，具体涉及一种预防猪瘟的多聚体疫苗及其制备方法。
背景技术
[0002] 猪瘟俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒(Hogcholera virus，Swine fever virus，简称CSFV)引起的一种急性、发热、接触性传染病，具有高度传染性和致死性。猪是该病毒唯一的自然宿主。该传染病于1833年首次发现于美国俄亥俄州，百余年来其流行遍及全球。国际兽疫局将其定为A类传染病，中国《动物防疫法》将其列为一类传染病，是目前危害中国养猪业发展的主要疫病之一。中国猪瘟兔化弱毒疫苗在防治猪瘟中曾起到决定性作用，但近几年来出现免疫效果不理想。
[0003] CSFV为有囊膜病毒，40～60nm，单股正链RNA。CSFV基因组长约123kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)，此ORF翻译成含3898个氨基酸残基、分子量约438kD的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白。CSFV的所有结构蛋白和rns非结构蛋白均由该ORF所编码，共编码4个结构蛋白(C、E (E0)、E1和E2)和8个非结构蛋白pro
(N 、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。在结构蛋白中，最具有免疫防治研究价值的是E0和E2，尤其E2蛋白是目前亚单位疫苗首选蛋白。
(N 、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。在结构蛋白中，最具有免疫防治研究价值的是E0和E2，尤其E2蛋白是目前亚单位疫苗首选蛋白。
[0004] E2蛋白是CSFV的囊膜糖蛋白，是主要的抗原蛋白。在体外，E2可诱导产生病毒的中和抗体，在体内可诱导产生抗CSFV的攻击抗体。由于糖基化程度不同，E2的分子量可为51～58kDa。E2分子内的15个半胱氨酸(Cys)残基在属内均保守，其中N端6个Cys残基参与抗原结构域的形成，C端9个Cys残基则参与同源、异源二聚体的形成。
[0005] 白喉毒素是一种蛋白，由535个氨基酸组成，共有两个亚基，亚基间通过二硫键连接。分子量为62kD，含有两个与有14个氨基酸的环相结合的双硫桥，分子具有毒性及产生特定免疫力的特征。白喉毒素197是白喉毒素一个突变体，其52位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸，使毒素丧失活性，对细胞不产生毒性作用，但其抗原和免疫活性仍然与天然毒素一致。
[0006] IgG融合蛋白主要特点是包含Fc段，与单克隆抗体Fc功能类似。融合蛋白可以延长蛋白的半衰期，当Fc与Fc受体(FcRn)结合，在受体的保护下，半衰期可延长至21天。同时提高分子量，降低身体清除率，Fc通过二硫键连接形成二聚体，对补加轻链免疫刺激物进一步改造可以形成聚体复合物，提高分子稳定性，同时Fc结构与免疫细胞表面的Fc受体结合，发挥IgG和白喉毒素各种生物学功能，主要包括调节细胞因子分泌、调节B细胞增值分化及提高抗体滴度等。除此之外，Fc可以特异性地与ProteinA结合，简化纯化步骤，在生物制品中有重要意义。
[0007] SpyTag是一个多肽段，SpyCatcher是与之相对应的一个蛋白质，二者能够重组，并自发形成异肽键偶联，这就将蛋白质组装和化学反应结合在一起，是可以基因编码的化学反应。
发明内容
[0008] 本发明要解决的技术问题是如何提高猪瘟E2亚单位疫苗的稳定性和/或延长其半衰期，增强其免疫效果。
[0009] 为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供蛋白质，所述蛋白质由融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG和融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG连接而成，
[0010] 所述融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG为下述A1)‑A3)中任一种：
[0011] A1).氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
[0012] A2).A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性，且与猪瘟病毒疫苗相关的蛋白质；
[0013] A3).在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0014] 所述融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG为下述B1)‑B3)中任一种：
[0015] B1).氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
[0016] B2).B1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与猪瘟病毒疫苗相关的蛋白质；
[0017] B3).在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0018] 其中，SEQ ID No.3中第1～19位为信号肽的氨基酸序列，第20～379位为CSFV‑E2的氨基酸序列，第380～402位为Linker和SpyTag多肽的氨基酸序列，第403～722位为猪IgG重链恒定区Fc的氨基酸序列，也可以含此全部序列中部分序列；SEQ ID No.4中第1～19位为信号肽的氨基酸序列，第20～554位为CRM197毒素的氨基酸序列，第555～678位为Linker和SpyCatcher多肽的氨基酸序列，第679～780位为猪IgG轻链恒定区的氨基酸序列，也可以含此全部序列中部分序列。
[0019] 所述融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG从N端到C端分别是CSFV‑E2、SpyTag多肽和猪IgG重链恒定区，也可以含此全部序列中部分序列。所述融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG从N端到C端分别是CRM197、SpyCatcher多肽和猪IgG轻链恒定区，也可以含此全部序列中部分序列。其中SpyTag与SpyCatcher能够重组，并自发形成异肽键偶联，从而将所述融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG和所述融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG连接。两条猪IgG重链恒定区通过在铰链区形成二硫键连接。
[0020] 上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0021] 所述蛋白标签(protein‑tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。
[0022] 为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供与上述蛋白质相关的核酸分子，所述核酸分子由编码所述融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG的核酸分子和编码所述融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG的核酸分子组成；
[0023] 所述编码融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG的核酸分子为下述g11)‑g13)中任一种，
[0024] g11).编码链的编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
[0025] g12).编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
[0026] g13).与g11)或g12)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码上述融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG的DNA分子；
[0027] 所述编码融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG的核酸分子为下述g21)‑g23)中任一种，
[0028] g21).编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
[0029] g22).编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
[0030] g23).与g21)或g22)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码上述融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG的DNA分子。
[0031] SEQ ID No.1中第1～57位为信号肽的编码基因，第58～1137位为CSFV‑E2的编码序列，第1138～1206位为Linker和SpyTag多肽的编码序列，第1207～2169位为猪IgG重链恒定区的编码序列；SEQ ID No.2中第1～57位为信号肽的编码序列，第58～1662位为CRM197毒素基因，第1663～2034位为Linker和SpyCatcher多肽的编码序列，第2035～2343位为猪IgG轻链恒定区的编码序列。
[0032] 上述DNA分子可为按哺乳细胞密码子优化合成的。
[0033] 为实现上述目的，第三个方面，本发明提供一种表达盒，所述表达盒含有上述核酸分子。
[0034] 为实现上述目的，第四个方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体含有上述的核酸分子或含有上述的表达盒。
[0035] 为实现上述目的，第五个方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物含有上述的核酸分子或含有上述的表达盒或含有上述的重组载体。
[0036] 进一步地，所述重组微生物可为大肠杆菌或酵母。
[0037] 为实现上述目的，第六个方面，本发明提供一种重组转基因细胞系，所述重组转基因细胞系含有上述的核酸分子或含有上述的表达盒或含有上述的重组载体。
[0038] 进一步地，所述转基因细胞系可为哺乳动物细胞。
[0039] 进一步地，所述转基因细胞系可为非人动物细胞。
[0040] 进一步地，所转基因细胞系可为CHO细胞。
[0041] 为实现上述目的，第七个方面，本发明提供一种猪瘟疫苗，其包含上述的蛋白质。
[0042] 所述猪瘟由猪瘟病毒引起，所述猪瘟病毒为黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒(Hogcholera virus，Swine fever virus，简称CSFV)。
[0043] 为实现上述目的，第八个方面，本发明提供上述蛋白质的制备方法，包括如下步骤：使上述融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG的编码基因和上述融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG的编码基因在生物细胞中进行表达得到上述蛋白质的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物。
[0044] 进一步地，上述的制备方法中，所述生物细胞可为非人哺乳动物细胞。
[0045] 为实现上述目的，第九个方面，本发明提供上述的蛋白质或上述的核酸分子或上述的表达盒或上述的重组载体或上述的重组微生物或上述的重组转基因细胞系在制备预防猪瘟的产品中的应用。
[0046] 进一步地，所述预防猪瘟的产品可为疫苗。
[0047] 本发明中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11、1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
[0048] 本发明中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
[0049] SpyTag是一个多肽段，SpyCatcher是与之相对应的一个蛋白质，二者能够重组,并自发形成异肽键偶联。IgG融合蛋白主要特点是包含Fc段与单克隆抗体Fc功能类似，融合蛋白可以延长蛋白的半衰期，当Fc与Fc受体(FcRn)结合，在受体的保护下，半衰期可延长至21天。同时提高分子量，降低身体清除率，Fc通过二硫键连接形成二聚体，对补加轻链免疫刺激物进一步改造可以形成聚体复合物，提高分子稳定性，同时Fc结构与免疫细胞表面的Fc受体结合，发挥IgG和白喉毒素各种生物学功能，主要包括调节细胞因子分泌、调节B细胞增值分化及提高抗体滴度等。除此之外，Fc可以特异性地与ProteinA结合，简化纯化步骤。本发明利用蛋白质工程的方法，用猪瘟E2蛋白替换猪IgG抗体重链可变区与恒定区域序列融合并在中间加SpyTag，将SpyTag融合在E2和Fc蛋白中，得到融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG；用白喉毒素突变体CRM197替换IgG轻链的恒定区域的N端，并在中间加SpyCatcher，得到融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LigG。本发明将融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG基因和融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LigG基因进行共表达，增加IgG稳定性，最后形成免疫刺激物聚体E2蛋白，状态更稳定。
[0050] 本发明取得的有益效果如下：
[0051] 利用蛋白质工程的方法，将SpyTag融合在E2和Fc蛋白中，与白喉毒素突变体CRM197融合SpyCatcher进行共表达，增加IgG稳定性，最后形成免疫刺激物聚体E2蛋白，状态更稳定。
[0052] 本发明用猪瘟E2蛋白替换猪IgG抗体重链可变区与恒定区域序列融合可以在中间加SpyTag，白喉毒素突变体CRM197替换合LgG轻链的恒定区域的N端，分别将融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG基因和融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LigG基因置于哺乳细胞启动子下游串联双表达元件，表达载体转CHO，经过培养的产物通过ProteiA纯化获得目标融合蛋白，与佐剂混合做成疫苗。实验证明，该蛋白质表达量稳定，同时经过靶动物猪实验表明该方法可以刺激猪体内中和抗体的产生，可以预防猪瘟，还可以做成喷雾饮水形式疫苗。
附图说明
[0053] 图1为重组表达载体PEEGSE2197的物理图谱。
[0054] 图2为阳性细胞表达蛋白的Western Blot检测结果。
[0055] 图3为重组细胞CHO/PEEGS‑E2197‑88在10L发酵流加培养的照片。
[0056] 图4重组细胞CHO/PEEGS‑E2197‑88在10L发酵流加培养表达产物的Western Blot检测结果。
[0057] 图5为表达产物纯化后蛋白质的电泳图谱。
[0058] 图6为CHO/PEEGS‑E2197‑88细胞纯化蛋白的液相色谱图。
[0059] 图7为融合蛋白E219788‑1和E2血清琼扩反应。
具体实施方式
[0060] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0061] 原始基因合成及载体：重组融合蛋白(CSFV‑E2‑SpyTag‑HIgG)和重组融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG的编码序列按哺乳细胞密码子优化合成。
[0062] 酶类及其他生化试剂：内切酶、连接酶购自TaKaRa公司，重组酶购自全式金，质粒提取试剂盒购自天根生物，ProteiA亲和填料购置江苏千纯生物公司，LB培养基、无机盐等其它均为国产试剂。
[0063] 实施例1、融合蛋白设计及重组表达载体的构建
[0064] 1.1、融合蛋白的设计
[0065] 为了提高CSFV‑E2蛋白免疫效果，分别将CSFV‑E2编码基因与猪IgG重链恒定区编码基因融合、将CRM19L编码基因与猪IgG轻链恒定区编码基因融合。而SpyTag是一个多肽段，SpyCatcher是与之相对应的一个蛋白质，二者能够重组，并自发形成异肽键偶联。
[0066] 委托北京擎科生物有限公司合成融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG编码基因(SEQ ID No.1)和融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG编码基因(SEQ ID No.2)，其中，用(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG基因替换PEE12.4载体的HindIII和ECORI酶切位点之间的片段(HindIII和ECORI酶切位点之间的小片段)，获得重组表达载体PEE12.4‑(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG。用CRM197‑SpyCatcher‑LIgG基因替换PEE6.4载体的HindIII和ECORI酶切位点之间的片段(HindIII和ECORI酶切位点之间的小片段)，获得重组表达载体PEE6.4‑CRM197‑SpyCatcher‑LIgG。
[0067] 融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG编码基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1，其编码的氨基酸序列是SEQ ID No.3；融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgGIgG的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID No.2，其编码融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID No.4；
[0068] SEQ ID No.1中第1～57位为信号肽的编码基因，第58～1137位为CSFV‑E2的编码序列，第1138～1206位为Linker和SpyTag多肽的编码序列，第1207～2169位为猪IgG重链恒定区的编码序列；SEQ ID No.2中第1～57位为信号肽的编码序列，第58～1662位为CRM197毒素基因，第1663～2034位为Linker和SpyCatcher多肽的编码序列，第2035～2343位为猪IgG轻链恒定区的编码序列。
[0069] 其中，SEQ ID No.3中第1～19位为信号肽的氨基酸序列，第20～379位为CSFV‑E2的氨基酸序列，第380～402位为Linker和SpyTag多肽的氨基酸序列，第403～722位为猪IgG重链恒定区Fc的氨基酸序列；SEQ ID No.4中第1～19位为信号肽的氨基酸序列，第20～554位为CRM197毒素氨基酸序列，第555‑678位为Linker和SpyCatcher多肽的氨基酸序列，第679～780位为猪IgG轻链恒定区的氨基酸序列。
[0070] 1.2、重组表达载体的构建
[0071] 用Not I和Sal I限制性内切酶分别双酶切1.1的重组表达载体PEE12.4‑(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG和重组表达载体PEE6.4‑CRM197‑SpyCatcher‑LIgGIgG，将酶切产物琼脂糖凝胶电泳，分别回收对应大小片段，并连接转化。
[0072] 将连接产物转化DH5α感受态细胞，获得阳性重组菌，挑取单克隆于含有500μL LB培养基的1.5mL EP管中37℃220rpm培养6小时，鉴定阳性克隆。
[0073] 阳性克隆经过试管富集后提质粒，用Not I/Sal I双酶切验证正确。验证正确的重组表达载体命名为PEEGSE2197，其物理图谱如图1所示，重组载体PEEGSE2197的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0074] 实施例2、稳转细胞株构建及蛋白表达
[0075] 2.1、稳转细胞株构建
[0076] 将实施例1的重组表达载体PEEGSE2197用Pvu I酶切回收，获得线性化表达载体PEEGSE2197。将线性化表达载体PEEGSE2197转染CHO细胞，转染步骤包括：
[0077] 步骤1：转染前24h，将细胞密度调整至2.5‑3×106cells/mL，过夜培养。
[0078] 步骤2：转染当天，用新鲜培养基将细胞密度稀释至3×106cells/mL，细胞存活率≥95％。
[0079] 步骤3：准备DNA‑PEI复合物，分别用Opti‑MEM稀释DNA和PEI，转染时的DNA终浓度为1～2μg/mL，PEI与DNA的质量比为5:1，稀释后的DNA与PEI分别静置5min后1:1混合，轻柔翻转混匀数次。
[0080] 步骤4：DNA‑PEI复合物于室温静置20min后缓慢滴加至待转染的细胞悬液中。
[0081] 步骤5：转染后48小时观察细胞状态，检测质粒是否表达，若荧光可见，则将培养液更换为筛选培养基(含50μM MSX(蛋氨酸亚氨基代砜(methioninesulfoximine)的IMDM培养基(Gibco，货号12200036))进行后续高产细胞株的筛选。
[0082] 步骤6：用含50μM的MSX的IMDM培养基(Gibco，货号12200036)加压筛选1个月获得阳性细胞，阳性细胞采用有限稀释法稀释到96孔板中，镜检检查保证每孔有一个细胞并记录，在5％CO2、37℃、100rpm培养15天，之后添加含50μM的MSX的IMDM培养基(Gibco，货号12200036)传至48孔板中，继续在5％CO2、37℃、100rpm条件下培养15d。在加压培养基上获得细胞后继续传代，连续培养传代2个月18代后取培养孔的上清，Western Blot方法检测蛋白表达量，其中，Western Blot方法中所用的一抗为以E2蛋白(氨基酸序列是SEQ ID No.3的第20～379位)为免疫原免疫小鼠得到的多克隆抗体，以HRP‑羊抗鼠IgG(试剂厂家Solarbio，货号SE131)为第二抗体。WB结果如图2，图2中MK表示Marker，72#、88#、96#和102#表示细胞编号。
[0083] 共计得到88#和96#两株高表达融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG和融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgGIgG的稳定胞株，将88#和96#作为工程细胞株，大量扩繁后保存‑80℃液氮中，将其命名为CHO/PEEGS‑E2197‑88和CHO/PEEGS‑E2197‑96。
[0084] 2.2、稳定细胞株的10L发酵流加培养
[0085] 发酵罐采用上海百仑哺乳发酵罐10L反应系统，装液量为5L，转速为80rpm，pH7.2，6
培养温度为37℃。准备1L种子液，CHO/PEEGS‑E2197‑88的细胞密度为2.0×10个/mL，加入
6
发酵罐中，每天计数，观察细胞状态。当发酵第5天细胞密度达到5.0×10时，每天补加补料培养基400mL同时温度降低到33℃，此条件下连续培养6天，此时蛋白浓度达到最大，停止补加补料培养基，降到30℃培养1天后停止发酵。发酵过程中用O2维持发酵罐不低于10％溶氧水平，用CO2和NaHCO3控制pH7.2，细胞发酵罐过程如图3。取发酵液用Western Blot检测表达产物含量，结果如图4所示，结果表明蛋白含量随着发酵时间增长而增加。其中，Western Blot方法中所用的一抗为以E2蛋白(氨基酸序列是SEQ ID No.3的第20～379位)为免疫原免疫小鼠得到的多克隆抗体，以HRP‑羊抗鼠IgG(试剂厂家Solarbio，货号SE131)为第二抗体。发酵培养基为GIBCO(A2910001)；补料培养基为GIBCO(A2910001)+8％葡萄糖。
培养温度为37℃。准备1L种子液，CHO/PEEGS‑E2197‑88的细胞密度为2.0×10个/mL，加入
6
发酵罐中，每天计数，观察细胞状态。当发酵第5天细胞密度达到5.0×10时，每天补加补料培养基400mL同时温度降低到33℃，此条件下连续培养6天，此时蛋白浓度达到最大，停止补加补料培养基，降到30℃培养1天后停止发酵。发酵过程中用O2维持发酵罐不低于10％溶氧水平，用CO2和NaHCO3控制pH7.2，细胞发酵罐过程如图3。取发酵液用Western Blot检测表达产物含量，结果如图4所示，结果表明蛋白含量随着发酵时间增长而增加。其中，Western Blot方法中所用的一抗为以E2蛋白(氨基酸序列是SEQ ID No.3的第20～379位)为免疫原免疫小鼠得到的多克隆抗体，以HRP‑羊抗鼠IgG(试剂厂家Solarbio，货号SE131)为第二抗体。发酵培养基为GIBCO(A2910001)；补料培养基为GIBCO(A2910001)+8％葡萄糖。
[0086] 2.3、重组蛋白的纯化
[0087] 收集2.2获得的发酵液，经过国产科百特深层过滤系统获得澄清液，第一步选用buffer A：20mM PBS，0.15M NaCl，pH7.2，电导18.128ms/cm，平衡纯化柱子(ProteiA亲和填料购置江苏千纯生物公司)。用澄清的发酵液上样，buffer A冲洗柱子上杂蛋白，buffer B：4.5mM柠檬酸钠，25mM柠檬酸pH3.0，电导1.27ms/cm洗脱。洗脱液用0.5M TIRS‑CL中和低pH纯化液即为纯化蛋白，SDS‑PAGE检测结果如图5，图5左起第一泳道为Marker，左起第二泳道和左起第三泳道为待测样品。
[0088] 采用考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，对两个细胞发酵结果显示CHO/PEEGS‑E2197‑88细胞纯化蛋白浓度达到1.35mg/mL和CHO/PEEGS‑E2197‑962
细胞纯化蛋白达到1.08mg/mL，其中检测曲线Y＝8.2037X；R＝0.9975。
细胞纯化蛋白达到1.08mg/mL，其中检测曲线Y＝8.2037X；R＝0.9975。
[0089] 对CHO/PEEGS‑E2197‑88细胞纯化蛋白，纯化蛋白经过液相色谱检测蛋白纯度，结果如图6所示，图6中，横坐标为样品保留时间(单位为min)，纵坐标为波长信号强度(单位为nm)。图6结果表明其蛋白纯度达到93.82％，有效蛋白浓度为1.26mg/mL，用该批蛋白作为实验用蛋白样品。对该蛋白样品内毒素检测，其中内毒素测定按凝胶法进行，待测蛋白样品内毒素含量为0.0075EU/mL，小于0.015EU/mL。结果表明蛋白样品的内毒素水平达到生物制品要求。
[0090] 整个纯化工艺步骤简便。产物纯度高，纯化获得的蛋白质命名为融合蛋白E219788‑1，将E219788‑1和猪瘟E2阳性血清做琼扩检验，结果如图7，纯化蛋白和血清成功发生琼扩条带。
[0091] 融合蛋白E219788‑1由(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG和CRM197‑SpyCatcher‑LIgGIgG组成，其中(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG的氨基酸序列是SEQ ID No.3。SEQ ID No.3中，第1～19位为信号肽，第20～379位为CSFV‑E2，第380～402位为Linker和SpyTag多肽，第403～722位为猪IgG重链恒定区的编码序列。CRM197‑SpyCatcher‑LIgGIgG的氨基酸序列是SEQ ID No.4。SEQ ID No.4中第1～19位为信号肽的氨基酸序列，第20～554位为CRM197毒素氨基酸序列，第555‑678位为Linker和SpyCatcher多肽的氨基酸序列，第679～780位为猪IgG轻链恒定区的氨基酸序列。
[0092] 其中，(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG中的SpyTag与CRM197‑SpyCatcher‑LIgG中的SpyCatcher能够重组，并自发形成异肽键偶联，从而将(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG和CRM197‑SpyCatcher‑LIgG连接。猪IgG重链恒定区通过在铰链区形成二硫键连接而互相连接。
[0093] 2.4、疫苗的制备
[0094] 2.4.1、小鼠用实验疫苗配制
[0095] 500μg/mL疫苗A：在超净台中将40mL 2.3中制备的E219788‑1蛋白(浓度1.35mg/mL)放入无菌烧杯中，加入35mL无菌PBS和25mL Summit‑350(Adjuvant漯河桑米特生物科技有限公司试用)佐剂，将手动均质机调节到4000rpm乳化10min，整个过程在冰上操作。操作结束后无菌分装到西林瓶中得到500μg/mL E2疫苗待用。
[0096] 2.4.2、猪用实验用疫苗配制
[0097] 50μg/mL疫苗B：在超净台中将4mL 2.3中制备的E219788‑1蛋白(浓度1.35mg/mL)放入无菌烧杯中，加入71mL无菌PBS和25mL Summit‑350(Adjuvant)佐剂，将手动均质机调节到4000rpm乳化10min，整个过程在冰上操作。操作结束后无菌分装到西林瓶中得到50μg/mL E2疫苗待用。
[0098] 2.4.3、100μg/mL疫苗配制
[0099] 100μg/mL疫苗C：在超净台中将8mL 2.3中制备的E219788‑1蛋白(浓度1.35mg/mL)放入无菌烧杯中，加入67mL无菌PBS和用25mL Summit‑350(Adjuvant)佐剂，将手动均质机调节到4000rpm乳化10min，整个过程在冰上操作。操作结束后无菌分装到西林瓶中得到100μg/mL E2疫苗待用。
[0100] 实施例3、E2疫苗的安全性与效果验证
[0101] 将实施例2中2.4制备的E2疫苗用于该步实验，商品化疫苗为市售科瘟净(猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗(WH‑09株))。
[0102] 3.1、重组融合蛋白安全性实验
[0103] 取6‑8周龄、体重18～22g的Balb/C小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)各20只(雌雄各半)，分别随机分组，每组5只，共4组。第1组为E2疫苗50μg组，第2组为E2疫苗100μg组，第3组为商品化疫苗组(阳性对照)，第4组为PBS组(阴性对照)。
[0104] 第1组：每只小鼠首次皮下肌肉接种0.1mL实施例2中2.4.1的E2疫苗溶液(500μg/mL疫苗A)，使融合蛋白E2的剂量为50μg/只，2周后以相同方法剂量进行第二次接种，每次注射后连续观测2周。
[0105] 第2组：每只小鼠首次皮下肌肉接种0.2mL实施例2中2.4.1的E2疫苗溶液(500μg/mL疫苗A)，使融合蛋白E2的剂量为100μg/只，2周后以相同方法剂量进行第二次接种，每次注射后连续观测2周。
[0106] 第3组：首次接种0.2mL/只科瘟净，在单剂量组接种2周后以相同方法剂量0.2mL/只进行第二次接种，每次注射后连续观测2周。
[0107] 第4组：首次接种0.2mL/只PBS溶液，在单剂量组接种2周后以相同方法剂量0.2mL/只进行第二次接种，每次注射后连续观测2周。
[0108] 实验期间，每天观测、记录实验动物临床症状变化，包括精神、采食、活动、呼吸、饮水、排泄状况、注射部位炎症反应、体温等。如果小鼠死亡，则需解剖、取样，观察大体病理变化和组织病理变化。
[0109] 经过2周的连续观测，对注射E2疫苗前后的临床症状进行比较，发现4个小组的小鼠均饮食正常，精神无不良变化，呼吸及排泄未见异常，注射部位未发现发炎现象，实验期间没有小鼠出现不良反应，无小鼠死亡，表明实施例2制备的E2疫苗是一种安全免疫蛋白。
[0110] 3.2、E2疫苗免疫效力实验
[0111] 3.2.1、动物免疫
[0112] 以实施例2中制备的50μg/mL疫苗B和100μg/mL疫苗C，作为本次动物实验材料。以科瘟净为阳性对照，以PBS为阴性对照，按表1分组模式分组，筛选猪瘟抗体阴性猪进行动物试验，融合蛋白疫苗免疫程序按猪瘟免疫程序2次免疫进行，即首次免疫后间隔21天以相同的剂量进行二次免疫。
[0113] 其中，猪瘟抗体ELISA检测试剂盒，购自IDEXX公司，批号为：REF：99‑43220，LOT SN：G131)；判定标准：阻断率大于或等于40％判为阳性；阻断率等于或小于30％判为阴性；阻断率在30％～40％之间判为可疑。
[0114] 猪瘟抗原ELISA检测试剂盒，购自IDEXX公司，批号为：REF：99‑40939，LOT SN：G351；判定标准：被检样品的S‑N值等于或小于0.100，判为猪瘟病毒抗原阴性；被检样品的S‑N值大于0.1，小于或等于0.3，判为可疑；被检样品的S‑N值大于0.3，判为猪瘟病毒抗原阳性。
[0115] 试验仪器为Bio‑Rad Imark型酶联免疫分析仪。
[0116] 选用2月龄、体重在约40kg的商品化、且猪瘟抗原和抗体检测均为双阴性长白仔猪25头，均分为5组，5头/组，分组结果如表1，按分组结果免疫接种。肌肉注射1mL/猪，21天后以相同的剂量、相同的途径进行第二次免疫，与同类产品比较试验共用1组阴性对照；第5组不免疫作对照同等条件下分栏饲养。
[0117] 表1.试验动物分组
[0118] 组别 用药及用量 数量(头)第1组 50μg/mL E2疫苗 5
第2组 100μg/mL E2疫苗 5
第3组 科瘟净 5
第4组 PBS 5
第5组 不作任何免疫分栏饲养 5
第2组 100μg/mL E2疫苗 5
第3组 科瘟净 5
第4组 PBS 5
第5组 不作任何免疫分栏饲养 5
[0119] 3.2.2、抗体效价测定
[0120] 所有20头试验猪分别在首免当日、首免后第14天、21天、二免后第14天、21天、42天前腔静脉采血，分离血清，用IDEXX试剂盒检测猪瘟抗体阻断率。
[0121] 在猪体内试验结果如表2，猪血清抗体阻断率结果如表2结果表明：100μg E2疫苗的免疫剂量高于科瘟净的免疫效果；50μg E2疫苗的免疫剂量能达到商品疫苗科瘟净的免疫效果，二免21天后达到保护效果抗体水平，但随着时间延后，E2疫苗的抗体阻断率(82.35～95.45％)高于科瘟净猪瘟灭活疫苗的阻断率(76.51％)。
[0122] 表2.猪免疫E2疫苗后抗体阻断率变化值
[0123]
[0124] 表2中“/”表示未测定。
[0125] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。