罗伊氏乳杆菌SXDT-32及其应用

摘要

本发明涉及益生菌领域，具体涉及罗伊氏乳杆菌SXDT‑32及其应用。其保藏编号为CGMCC No. 24727。该菌株对大肠杆菌、沙门氏菌具有很好的抑制作用；能在动物体内定植，并对人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强；可以牢固的黏附定植于动物肠道中，抑制病原微生物在肠道中生长，提高动物肠道免疫力，缓解动物结肠炎症，降低动物腹泻和死亡率，改善动物肠道健康，此外，还可提高动物生长性能。

权利要求

1.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT‑32，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT‑32的保藏编号为CGMCC No. 24727。

2.包含权利要求1所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT‑32的微生物菌剂。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂是液体菌剂或固体菌剂。

4.权利要求1所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT‑32的用于制备以下制剂的应用：抑制病原微生物的制剂，所述病原微生物为大肠杆菌或沙门氏菌；

促进动物体重的制剂；

治疗结肠炎症的制剂；或

降低腹泻率的制剂。

5.一种动物饲料添加剂，其特征在于，含有包含权利要求1所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT‑32，或者由所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT‑32发酵制备而得。

说明书

罗伊氏乳杆菌SXDT‑32及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及益生菌领域，具体涉及罗伊氏乳杆菌SXDT‑32及其应用。

背景技术

[0002] 早期断奶引起的应激主要表现为仔猪腹泻，从而导致仔猪生长性能降低，死亡率提高。虽然抗生素在过去的几十年里显著提高了腹泻的治疗效果，但常导致耐药菌株的产生、传播以及食品中的抗生素残留已经成为一个严重的问题。因此，许多国家正在逐步禁止在动物生产中使用抗生素。然而，禁抗导致了仔猪腹泻发生率和死亡率陡然增加。因此，迫切需要开发针对腹泻的绿色安全、高效无毒的治疗方法。

[0003] 目前，对于益生菌的研究已然成为了热点。已发现益生菌能在肠道健康和疾病治疗方面表现出巨大的潜力。是一种潜在的抗生素替代品。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32。

[0005] 本发明的再一目的是提供上述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32的应用。

[0006] 本发明的再一目的是提供一种生物菌剂。

[0007] 本发明的再一目的是提供一种饲料添加剂。

[0008] 本发明的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32，其保藏编号为CGMCC No. 24727。

[0009] 本发明提供了含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32的菌剂。所述菌剂可以是液体菌剂或固体菌剂，可采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。

[0010] 本发明提供了罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32用于制备以下制剂的应用：

[0011] 抑制病原微生物；

[0012] 促进动物生长的制剂

[0013] 治疗结肠炎症的制剂；

[0014] 降低腹泻率的制剂；或

[0015] 提高肠道免疫力的制剂。

[0016] 优选地，所述病原微生物为细菌。更优选为革兰氏阴性菌。

[0017] 作为本发明的一种实施方式，所述病原微生物为大肠杆菌或沙门氏菌。

[0018] 根据本发明的动物饲料添加剂，其含有上述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32。

[0019] 以上所述的动物饲料添加剂或动物饲料含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32的发酵菌体。

[0020] 本发明提供含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT‑32的菌剂。

[0021] 本发明所述的菌剂可以是液体菌剂或固体菌剂，可采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。

[0022] 本发明通过实验证明，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT‑32对大肠杆菌、沙门氏菌具有很好的抑制作用；能在动物体内定植，并对人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强；可以促进动物生长，改善结肠炎症，降低腹泻率，提高肠道免疫力，改善肠道健康。

[0023] 本发明的有益效果在于：本发明通过在马身猪粪便中分离获得一株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT‑32，该菌株对大肠杆菌、沙门氏菌具有很好的抑制作用；能在动物体内定植，并对人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强；以葡聚糖硫酸钠（DSS）建立小鼠结肠炎症损伤模型，发现该菌株能够缓解并治疗小鼠结肠炎症，缓解因DSS引起的小鼠体重降低和结肠长度缩短；在对7‑30日龄的仔猪饲养试验中也显示出，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT‑32能显著降低仔猪腹泻率，并能提高仔猪21日龄和30日龄重。罗伊氏乳杆菌可以牢固的黏附定植于动物肠道中，抑制病原微生物在肠道中生长，提高动物肠道免疫力，缓解动物结肠炎症，降低动物腹泻和死亡率，改善动物肠道健康，此外，还可提高动物生长性能。

附图说明

[0024] 图1为本发明实施例2中罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32的生长曲线；

[0025] 图2为本发明实施例2中罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32 的孔雀石绿染色后油镜镜检图；

[0026] 图3为本发明实施例2中罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32的菌落形态图；

[0027] 图4为本发明实施例3中小鼠试验方案实施图；

[0028] 图5为本发明实施例3中试验小鼠整个试验期体重变化图；

[0029] 图6显示本发明实施例3中试验小鼠在试验开始后第7天时体重变化情况；

[0030] 图7显示本发明实施例3中试验小鼠在试验开始后第13天时体重变化情况；

[0031] 图8显示本发明实施例3中试验小鼠在试验开始后第18天时体重变化情况；

[0032] 图9显示本发明实施例3中试验小鼠的结肠长度；

[0033] 图10显示本发明实施例3中试验小鼠结肠HE染色以及根据结肠HE染色进行的病理评分；

[0034] 图11显示本发明实施例4中仔猪在第21日龄和30日龄时的体重变化情况；

[0035] 图12显示本发明实施例4中仔猪在整个试验期内的腹泻率统计结果。

[0036] 罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT‑32，该菌株于2022年 4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri，保藏编号为CGMCC No. 24727。

具体实施方式

[0037] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0038] 实施例1 罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的分离与16S rRNA鉴定[0039] 罗伊氏乳杆菌的分离与鉴定：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)分离自山西省大同市阳高县古城镇北方四季牧场的马身猪粪便中。

[0040] 1、粪便收集：采集20头育肥马身猪粪便各1g，加入20ml含有20%甘油的无菌生理盐水进行旋涡混匀，并分装到无菌冻存管中，每管1ml。处理完成后置于干冰中，带回实验室保存于‑80°C冰箱，直到使用。

[0041] 2、菌株分离：取马身猪粪样1ml，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，吸取合适稀释度的稀释液0.1mL在MRS琼脂上均匀涂布，37°C培养48h后，将生长出的菌落通过平板划线接种到新的MRS固体培养基进行纯化培养48h。

[0042] 3、菌株富集：将纯化培养后的菌株，在无菌操作台上用接种环逐一接种到无菌MRS肉汤培养基中，置于摇床中，37°C培养48h后进行16S rRNA鉴定，并将剩余部分与含有50%甘油的生理盐水混合，保存至‑80°C冰箱。

[0043] 4、16S  rRNA鉴定 ：将富集后的菌液，使用细菌通用引物27F： AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，进行菌落PCR扩增后,进行16S rDNA测序鉴定，将各个菌株的16S rDNA序列与数据库中所有已测定细菌的16S rDNA序列进行比对，其中发现有6株与乳杆菌属的Lactobacillus reuteri  DSM20016的16S rDNA 序列的同源相似性最高，确定这6株菌种类别为罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillus reuteri)。

[0044] 实施例2 罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的特性检测

[0045] 1、抑菌能力检测

[0046] 病原指示菌选用2种常见致病菌：大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113和鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)ATCC14028。

[0047] 采用牛津杯法测定菌株的抑菌活性。将大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113和鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)ATCC14028分别接种在LB肉汤培养基中，放置 37°C培养箱中培养12‑18h。将大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113和鼠伤寒沙门氏菌 
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(Salmonella typhimurium)ATCC14028菌株浓度分别用无菌生理盐水调整至1×10 CFU/mL，各取200μl, 均匀涂布在LB琼脂培养基，将灭菌后的牛津杯均匀轻放在LB培养基上，在
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牛津杯中分别加入200μL已活化并且菌液浓度在1×10 CFU/mL的带有MRS肉汤的菌液。放置 
37°C培养箱中培养12h。用游标卡尺测量抑菌圈大小并评价抑菌效果。结果显示（表1），相比于其它5株罗伊氏乳杆菌，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32对大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113和鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)ATCC14028均有较强抑制效果，取得了最大的抑菌圈直径，并且显著高于SXDT‑1菌株（p<0.05）。

[0048] 表1 罗伊氏乳酸菌对病原菌的抑制能力

[0049]

[0050] 注：以上数值为抑菌圈直径，单位mm。

[0051]  2、耐胆盐检测

[0052] 将已活化并且菌液浓度在1×108CFU/mL的菌液，分别取1ml接种到9ml含猪胆盐浓度为0.3g/100mL的无菌生理盐水中，1h后采用平板涂布法测定活菌数。

[0053] 结果显示（表2），在0.3g/100mL的胆盐浓度下，相比较其它5株罗伊氏乳杆菌，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32的存活率显著高于其它菌株（p<0.05），存活率达到18.44%左右。

[0054] 表2罗伊氏乳杆菌在强胆盐0.3%浓度下的存活率%

[0055]

[0056] 3、耐人工胃液检测

[0057] 将已活化并且菌液浓度在1×108CFU/mL的菌液，分别取1ml接种到9ml PH=1.5的人工胃液中，1h后采用平板涂布法测定活菌数。结果显示（表3），在pH=1.5的人工胃液1h后，相比较其它5株罗伊氏乳杆菌，其中罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32的存活率显著高于其它菌株（p<0.05），存活率达到19.60%左右。

[0058] 表3罗伊氏乳杆菌在PH=1.5的人工胃液中的存活率%

[0059]

[0060] 4、耐人工肠液检测

[0061] 将已活化并且菌液浓度在1×108CFU/mL的菌液，分别取1ml接种到9ml pH=6.8的人工胃液中，4h后采用平板涂布法测定活菌数。结果显示（表4），在人工肠液4h后，相比较其它5株罗伊氏乳杆菌，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32存活率取得最大值，达到18.96%左右，并且显著高于SXDT‑1、SXDT‑21、SXDT‑31菌株（p<0.05）。

[0062] 表4罗伊氏乳杆菌在人工肠液的存活率%

[0063]

[0064] 5、生长曲线测定

[0065] 按1%接种量从浓度为1×108CFU/mL的罗伊氏乳杆菌SXDT‑32菌液中吸取定量的菌液接种到MRS肉汤培养基中，放入37°C的摇床中。每隔1h使用酶标仪测定发酵液在OD600的值。结果显示（图1），罗伊氏乳杆菌SXDT‑32菌株在4h后即可进入对数生长期，14h进入平台8
期，最大活菌数达到2.7×10CFU/mL。

[0066] 6、形态及菌落观察

[0067] 将菌体涂抹在载玻片并对其烘干，用含有1%的孔雀石绿染色3分钟，染色完成后用去离子水缓慢冲洗，洗掉多余的染色液，烘干玻片后置于显微镜下油镜观察并拍照，结果显示于（图2）。用接种环蘸取一环菌液在MRS琼脂培养基进行划线，37°C培养48h后对其菌落形态进行观察，结果显示于（图3）。

[0068] 罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT‑32的微生物学特性如下:

[0069] (1)菌落形态：单菌落圆形，直径约1 2mm，呈现乳白色，不透明，菌落表面光滑微~凸，边缘规则。

[0070] (2)染色后细菌形态呈现短杆状，无鞭毛，不运动。

[0071] (3)生长特性：在MRS液体培养基中，置于37°C摇床培养，4小时后开始进入对数生8
长期，14h进入平台期，最大活菌数为2.7×10CFU/mL。

[0072] 实施例3 罗伊氏乳杆菌SXDT‑32对DSS造模小鼠肠道健康的影响

[0073] 通过以上实验，确定罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32菌株具有最好的抗逆益生特性，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 24727。因此保留罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32菌株用于后去实验。

[0074] 一、实验方法

[0075] 1、选取36只20日龄的ICR雄性小鼠，饲养于中国农业科学院动物科学研究所动物中心。试验过程中，将鼠房的温度控制在21±2℃，光照/黑暗时间为12小时，并自由取食和饮水。

[0076] 2、以葡聚糖硫酸钠（DSS）建立小鼠结肠炎症损伤模型，将所有小鼠随机分为三组：Con组，DSS组，L.r+DSS组。Con组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml的生理盐水，为期18天；DSS组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml的生理盐水（NS），为期18天，在试验的第8‑13天，给小鼠饮用含有3%DSS的自来水6天；L.r+DSS组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml浓
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度为1×10CFU/mL的菌液，为期18天，在试验的第8‑13天，给小鼠饮用含有3%DSS的自来水6天。具体试验方案见图4。试验过程中，每天测量小鼠体重，观察并记录小鼠的状态，存活情况，有无临床异常症状等。试验结束后测量结肠长度并采集小鼠结肠组织样本，将样本保存在4%的甲醛溶液中，用于HE染色，观察小鼠结肠形态，并对其进行病理评分。

[0077] 二、实验结果

[0078] 1、生长情况：整个试验中小鼠生长变化情况如图5所示，第7天各组间的小鼠体重没有明显差异（图6）；第13天时，Con组小鼠体重显著高于DSS组和L.r+DSS组的小鼠体重，虽L.r+DSS组与DSS组的小鼠体重无显著差异，但是从数值上来看，L.r+DSS组的小鼠体重高于DSS组（图7）；第18天时，L.r+DSS组小鼠体重与Con组无显著差异，且显著高于DSS组（图8）。

[0079] 2、结肠长度：如图9所示，虽然Con组小鼠结肠长度与L.r+DSS组存在显著差异，但L.r+DSS组的小鼠结肠长度显著高于DSS组。

[0080] 3、结肠形态及病理评分：如图10所示，DSS组小鼠结肠肠道出现严重的炎症细胞浸润，出现严重的炎症情况，L.r+DSS组小鼠肠道局部出现了炎症情况；病理评分显示，DSS组分值显著高于L.r+DSS组。这些结果预示着罗伊氏乳杆菌SXDT‑32菌株可以很好的缓解和治疗小鼠结肠炎症，促进肠道健康。

[0081] 实施例4罗伊氏乳杆菌SXDT‑32对仔猪肠道健康的影响

[0082] 一、实验方法

[0083] 选用河北唐山某养殖场产的健康母猪40头（3   4岁，5   6胎）及其临产仔猪。在~ ~断奶前，所有育有哺乳仔猪的母猪分别被圈养在封闭的产房内，并提供商品饲料和自由饮水。猪圈环境保持清洁、通风，并定期消毒。

[0084] 所有母猪被随机分为对照组（Con）和菌液饲喂组（L.r）。每组20头母猪，每窝选取14头仔猪。两组仔猪初始体重相近（初始BW =1.73±0.03 kg），并在21日龄开始断奶。Con组：从仔猪7日龄开始，对仔猪饲喂商用教槽料，使其自由采食，直至30日龄结束试验；L.r
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组：从仔猪7日龄开始，对仔猪饲喂额外含有5×10 CFU/kg罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT‑32的同品牌商用教槽料，使其自由采食，直至30日龄结束试验。试验过程中，第21、30天测量仔猪体重，观察并记录仔猪的状态，统计仔猪腹泻率等。

[0085] 二、实验结果

[0086] 1、仔猪体重情况：如图11所示，L.r组仔猪在21日龄时的体重显著高于Con组；L.r组仔猪在30日龄时的体重也显著高于Con组。

[0087] 2、腹泻率：如图12所示，L.r组仔猪的腹泻率显著低于Con组。

[0088] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。