喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得BmNPV病蛹的方法

摘要

本发明公开了一种通过喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法，包括：使用浓度为105‑109PIB/ml的BmNPV病毒液浸渍桑叶得到带病毒桑叶；选用BmNPV敏感品系的5龄末期健康蚕，喂食带病毒桑叶，保证蚕成熟前的3次喂桑中，有1次喂食的是带病毒桑叶，蚕成熟上蔟结茧化蛹，发病得到病蛹；或选用BmNPV敏感品系的5龄期起蚕，喂食带病毒桑叶，发病后取活蚕血液，接种至BmNPV敏感品系的5龄末期健康蚕，蚕成熟上蔟结茧化蛹，发病得到病蛹；或选用BmNPV敏感品系的5龄期起蚕，喂食带病毒桑叶，蚕饱食后，喂食正常桑叶，发病取活蚕血液，接种至化蛹24‑48小时的BmNPV敏感品系健康蚕蛹，发病得到病蛹。本发明操作方便和简单，杂质少，扩繁效率高，成本低。

权利要求

1.通过喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法，其特征在于，包括：

5 9

使用浓度为10‑10 PIB/ml的BmNPV病毒液浸渍桑叶得到带病毒桑叶；

A：选用BmNPV敏感品系的5龄末期健康蚕，喂食带病毒桑叶，保证蚕成熟前的2天内喂桑中，有1次喂食的是带病毒桑叶，蚕成熟后上蔟结茧化蛹后，发病得到所述BmNPV病蛹；

或B：选用BmNPV敏感品系的5龄期起蚕，喂食带病毒桑叶，蚕饱食后，改为喂食正常桑叶，直至活蚕出现典型病状，然后取活蚕血液，穿刺接种至BmNPV敏感品系的5龄末期健康蚕上，蚕成熟后上蔟结茧化蛹后，发病得到所述BmNPV病蛹；

或C：选用BmNPV敏感品系的5龄期起蚕，喂食带病毒桑叶，蚕饱食后，喂食正常桑叶，直至活蚕出现典型病状，然后取活蚕血液，穿刺接种至化蛹24‑48小时的BmNPV敏感品系健康蚕蛹上，发病得到所述BmNPV病蛹。

2.如权利要求1所述的通过喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法，其特征在于，所述B和C中，为保证蚕饱食带病毒桑叶，在喂食带病毒桑叶后，等待8 12小时，待带病毒桑叶被食光后或接近被食光后，第二次喂食改用正常桑叶喂~食。

3.如权利要求2所述的通过喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法，其特征在于，喂食带病毒桑叶5 6天后收集出现典型病状的活蚕，剪尾~收集血液，收集的血液用于穿刺接种。

4.如权利要求1所述的通过喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法，其特征在于，针对B中的5龄末期健康蚕：取无菌注射器抽取或接种针粘取所述活蚕血液，剌入5龄末期健康蚕体壁接种所述活蚕血液；

针对C中的健康蚕蛹：取消毒好的注射器抽取所述活蚕血液，将蛹皮刺破接种到蚕蛹中。

5.如权利要求1所述的通过喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法，其特征在于，所述A和B中，蚕成熟上蔟后，上蔟2天后采蚕，再过2天后蚕化蛹，削茧得到蚕蛹，蚕蛹经过3 4天后出现病状，收集得到所述病蛹；

~

所述C中，接种后的蚕蛹发育96 120小时，到发病中后期，蛹体出现病状，收集得到所述~病蛹。

说明书

喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得BmNPV病蛹的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及家蚕抗病育种技术领域，更具体地说，本发明涉及一种通过喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法。

背景技术

[0002] 家蚕血液型脓病(BmNPV)是一种家蚕亚急性传染病，是造成蚕业生产减产的主要病害之一，在广西亚热带高温季节尤为严重。此病的发生是家蚕被家蚕核型多角体病毒(BmNPV)侵染引起的，传染方式主要为食下传染和创伤传染，所以含有病原的蚕粪、蚕尸、病蚕接触过的含有病原的环境和物品都能成为再传染源。

[0003] 家蚕的生物特性和一定空间内蚕群集中的高密度的饲养方式决定了此病发生一旦发生，具有损失大，传染快的特点，也决定了家蚕血液型脓病的防治重点是在群体控制，而非个体的控制和治疗。所以家蚕抗病育种就显得尤为重要。而家蚕抗病育种一般采用的添食BmNPV进行蛾区或个体筛选，整个选育过程中需要用到大量的BmNPV。

[0004] 中国专利CN108220250A公开了家蚕活体穿剌接种的方法进行病毒扩繁，存在的不足为：1、蚕体注射不易操作；2、蚕发病时会狂躁爬行，对环境病原污染有一定风险；3、在病蚕收集破碎时，大蚕的皮肤、丝腺不易破碎；4、蚕还处于食桑阶段，破碎后杂质较多，影响病原提纯；5、家蚕幼虫可合并感染多种BmNPV、CPV、FV等多种病毒病，采用幼虫扩繁的BmNPV难以制备不含其它病毒病的BmNPV多角体病毒。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是解决至少上述缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

[0006] 本发明的另一个目的是提供一种通过喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法，其在5龄蚕末期或蛹期对家蚕进行喂食带毒桑叶或接种病蚕血液，使得蚕发病在上蔟之后，不会出现蚕期发病时狂躁爬行现象，蛹体较静，穿刺接种时比活泼的蚕体操作方便和简单，蛹体比蚕体更容易破碎、且破碎后的溶液比进食期的蚕破碎后杂质更少，容易提取病毒，扩繁效率高，成本低，获得的病原不含其它病毒病原。

[0007] 为了实现本发明的这些目的和其它优点，本发明提供一种通过喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接种获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法，包括：

[0008] 使用浓度为105‑109PIB/ml的BmNPV病毒液浸渍桑叶得到带病毒桑叶；

[0009] A：选用BmNPV敏感品系的5龄末期健康蚕，喂食带病毒桑叶，保证蚕成熟前的2天内喂桑中，有1次喂食的是带病毒桑叶，蚕成熟后上蔟结茧化蛹后，发病得到所述BmNPV病蛹；

[0010] 或B：选用BmNPV敏感品系的5龄期起蚕，喂食带病毒桑叶，蚕饱食后，喂食正常桑叶，直至活蚕出现典型病状，然后取活蚕血液，接种至BmNPV敏感品系的5龄末期健康蚕上，蚕成熟后上蔟结茧化蛹后，发病得到所述BmNPV病蛹；

[0011] 或C：选用BmNPV敏感品系的5龄期起蚕，喂食带病毒桑叶，蚕饱食后，喂食正常桑叶，直至活蚕出现典型病状，然后取活蚕血液，接种至化蛹24‑48小时的BmNPV敏感品系健康蚕蛹上，发病得到所述BmNPV病蛹。

[0012] 根据蚕的特性，蚕成熟之前需要充分进食饱食后，才能成熟上蔟结茧，结茧大概在上蔟后2天内成型，上蔟4天左右完成结茧并化蛹，即5龄期蚕末期至结茧化蛹的时间为4～5天，根据此特性，申请人设计的上述A、B或C方案均能够保证蚕发病在上蔟结茧之后，在此阶段发病不会出现蚕期发病时狂躁爬行现象，蛹体较静，穿刺接种时比活泼的蚕体操作方便和简单，蛹体比蚕体更容易破碎、且破碎后的溶液比进食期的蚕破碎后杂质更少，容易提取病毒，扩繁效率高，成本低，从而解决背景技术中提到的传统家蚕活体穿刺接种存在的问题。

[0013] 并且，在B和C的病毒复壮过程中，选用5龄期的起蚕，喂食带病毒桑叶，然后取活蚕血液，5龄期的起蚕具有几个特点：第一、体型大，血液充足，容易抽取血液；第二、进食量大，生长快，能够快速取食带病毒桑叶而发病；第二、在5龄期中，5龄期的起蚕对病毒较为敏感，抵抗力低，因此容易得到发病蚕。

[0014] 优选的是，所述的喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯5
BmNPV病蛹的方法中，所述A中，使用BmNPV病毒液的病毒浓度为10PIB/ml，桑叶浸泡于病毒液中10分钟，然后晾干得到所述带病毒桑叶；

[0015] 所述B和C中，使用BmNPV病毒液的病毒浓度为109PIB/ml，桑叶浸泡于病毒液中10分钟，然后晾干得到所述带病毒桑叶。

[0016] 上述技术方案中，A的喂食使用105的较低病毒浓度的病毒液，结合蚕正常的桑叶采食量，可以保证大多数蚕摄入合适量的病毒，避免出现摄入病毒量过大，后期能结茧但不9
能化蛹的情况，也可以避免摄入病毒量过少，而无法发病的情况。B和C的喂食使用10的较高浓度病毒液，能够使得5龄期蚕快速发病，而获得大量活蚕血液，提高了效率。

[0017] 优选的是，所述的喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法中，所述A中，具体为蚕成熟当天或前一天开始喂食带病毒桑叶，蚕成熟上蔟，未成熟的蚕继续喂食正常桑叶。

[0018] 常规的养蚕方法中，1日喂食1～4次桑叶，业内也称1日1～4回育，在本发明中，使用的是1日2回育。喂食的病毒桑叶的量和常规饲养的量无区别，保证蚕饱食即可。例如，按蛾区(1个蛾区平均400头蚕)计算，5龄蚕整个蚕期(按6天算)喂食桑叶6kg，这样1个蛾区一次大概喂叶0.5kg。

[0019] 优选的是，所述的喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法中，所述B和C中，为保证蚕饱食带病毒桑叶，在喂食带病毒桑叶后，等待8～12小时，待带病毒桑叶被食光后或接近被食光后，再使用正常桑叶喂食。

[0020] 优选的是，所述的喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法中，喂食带病毒桑叶5～6天后收集出现典型病状的的活蚕，使用酒精对活蚕体表进行消毒，体表晾干后，剪尾收集血液，收集的血液马上用于接种，或冷藏保存时间不超过6小时内使用。

[0021] 优选的是，所述的喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法中，针对B中的5龄末期健康蚕的接种方法为：取消毒好的注射器抽取所述活蚕血液，蚕体头往尾方向数，从第6‑9环节的任一节间膜处，剌入家蚕体壁，接种所述活蚕血液；

[0022] 针对C中的健康蚕蛹的接种方法为：取消毒好的注射器抽取所述病蚕血液，蛹体头往尾方向数，从蛹背部第2或第3环节将蛹皮轻轻刺破，将活蚕血液接种到蚕蛹中。

[0023] 优选的是，所述的喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法中，所述A和B中，蚕成熟上蔟后，在25～26℃温度，65％空气湿度条件下正常生长，上蔟2天后采蚕，再过2天后蚕化蛹，削茧得到蛹，蛹经过3～4天后出现病状，收集得到病蛹，存于‑20℃；

[0024] 所述C中，接种后的蚕蛹于25～29℃条件下发育96～120小时，到发病中后期，蛹体出现病状，收集得到病蛹，存于‑20℃。

[0025] 优选的是，所述的喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法中，具体包括：

[0026] 将保存于‑20℃的BmNPV病毒取出解冻，并加入无菌水重悬，4000rpm离心10min去上清，重复2‑3次，洗去保存病毒时加入的药品；然后再加入无菌水重悬，利用血球计数板和5
光学显微镜对BmNPV悬液进行计数，并配置成1×10PIB/ml的病毒液备用；

[0027] 将桑叶浸泡于所述病毒液中10min，充分浸渍均匀，取出待桑叶表面水分晾干得到带病毒桑叶备用；

[0028] 选用BmNPV敏感品系的5龄末期蚕，在蚕成熟当天或者前一天；

[0029] 将晾干的带病毒桑叶喂蚕，保证熟前的3次添桑，有1次是病毒叶，熟蚕上蔟，未熟蚕的继续喂正常叶；

[0030] 熟蚕上蔟后25‑26℃，湿度65％的条件下，上蔟2天后采茧，再过2天化蛹后削茧，蛹单层平铺于蚕窝中，经过3‑4天后出现环节松弛，蛹体发软，体壁易破的病症，即可收集得到病蛹，保存于‑20℃。

[0031] 优选的是，所述的喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法中，具体包括：

[0032] 将保存的BmNPV病毒配制成浓度109PIB/ml的病毒液，取桑叶在病毒液中浸泡10分钟，将桑叶捞起、晾干后得到带病毒桑叶；

[0033] 带病毒桑叶添食到BmNPV敏感品系的5龄期的起蚕中，保证蚕饱食，8‑12小时后病毒叶食光或接近食光后就使用正常叶饲养，5‑6天后收集出现症狂躁爬行、环节和节间膜肿胀、气门出现油浸斑，血液浑浊的典型病状的活蚕，用75％的酒精消毒蚕体，晾干后剪尾角收集血液，此时血液含大量病毒；

[0034] 用收集的血液进行穿刺接种，血液即取即用，或冷藏保存时间不超过6h；

[0035] 选择BmNPV敏感品系的5龄末期健康蚕；使用规格为32G的注射器，使用前煮沸30分钟消毒，再使用体积分数75％酒精消毒；

[0036] 取消毒好的注射器抽取所述血液，从蚕的头往尾方向第6‑9环节的任一节间膜处，剌入家蚕体壁，接种带BmNPV病毒的所述血液；

[0037] 接种后，熟蚕上蔟，进行25‑26℃，空气湿度65％的正常温湿度保护，上蔟2天后采茧，再过约2天化蛹后削茧，蛹单层平铺于蚕窝中，经过3‑4天后出现环节松弛，蛹体发软，体壁易破病症，即可收集病蛹，保存于‑20℃。

[0038] 优选的是，所述的喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法中，具体包括：

[0039] 将保存的BmNPV病毒配制成浓度109PIB/ml的病毒液，取桑叶在病毒液中浸泡10分钟，将桑叶捞起、晾干后得到带病毒桑叶；

[0040] 带病毒桑叶添食到BmNPV敏感品系的5龄期的起蚕中，保证蚕饱食，8‑12小时后病毒叶食光或接近食光后就使用正常叶饲养，5‑6天后收集出现症狂躁爬行、环节和节间膜肿胀、气门出现油浸斑，血液浑浊的典型病状的活蚕，用体积分数75％的酒精消毒蚕体，晾干后剪尾角收集血液，此时血液含大量病毒；

[0041] 用收集的血液进行穿刺接种，血液即取即用，或冷藏保存时间不超过6h；

[0042] 选择化蛹24‑48小时的BmNPV敏感品系健康嫩蚕蛹，此时蛹皮刚刚变硬，蛹体用有效氯1％的漂白粉溶液浸泡消毒30s，冲洗、晾干体表水分，备用；

[0043] 使用规格为32G的注射器，使用前煮沸30分钟消毒，再使用体积分数75％酒精消毒；

[0044] 取消毒好的注射器抽取所述血液，从蛹头往尾方向的蛹背部第2或第3环节将蛹皮轻轻刺破，将血液接种到蚕蛹中；

[0045] 把接种后的蚕蛹置于25‑29℃的条件下发育96‑120小时，到发病中后期，蛹体出现环节松弛，蛹体开始发软的病状，即可收集得到病蛹，收集的病蛹于‑20℃保存。

[0046] 本发明至少包括以下有益效果：

[0047] 本发明的方法对设备、工具要求低，人员技术水平要求不高；对环境条件要求低，发病后不会出现蚕期发病时狂躁爬行从而污染环境的现象，对环境的安全、洁净影响小；蛹体较静，穿刺接种时比活泼的蚕体操作方便和简单；蛹体比蚕体更容易破碎、且破碎后的溶液比进食期的蚕破碎后杂质更少，容易提取病毒；扩繁效率高，成本低。

[0048] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

[0049] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

[0050] 应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

[0051] 需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0052] 实施例1

[0053] 喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法，包括：

[0054] 将保存于‑20℃的BmNPV病毒取出解冻，并加入无菌水重悬，4000rpm离心10min去上清，重复2‑3次，洗去保存病毒时加入的药品；然后再加入无菌水重悬，利用血球计数板和5
光学显微镜对BmNPV悬液进行计数，并配置成1×10PIB/ml的病毒液备用；

[0055] 将桑叶浸泡于所述病毒液中10min，充分浸渍均匀，取出待桑叶表面水分晾干得到带病毒桑叶备用；

[0056] 选用BmNPV敏感品系的5龄末期蚕，在蚕成熟当天或者前一天；

[0057] 将晾干的带病毒桑叶喂蚕，保证熟前的3次添桑，有1次是病毒叶，熟蚕上蔟，未熟蚕的继续喂正常叶；

[0058] 熟蚕上蔟后25‑26℃，湿度65％的条件下，上蔟2天后采茧，再过2天化蛹后削茧，蛹单层平铺于蚕窝中，经过3‑4天后出现环节松弛，蛹体发软，体壁易破的病症，即可收集病蛹，保存于‑20℃。

[0059] 实施例2

[0060] 喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法，包括：

[0061] 将保存的BmNPV病毒配制成浓度109PIB/ml的病毒液，取桑叶在病毒液中浸泡10分钟，将桑叶捞起、晾干后得到带病毒桑叶；

[0062] 带病毒桑叶添食到BmNPV敏感品系的5龄期的起蚕中，保证蚕饱食，8‑12小时后病毒叶食光或接近食光后就使用正常叶饲养，5‑6天后收集出现症狂躁爬行、环节和节间膜肿胀、气门出现油浸斑，血液浑浊的典型病状的活蚕，用75％的酒精消毒蚕体，晾干后剪尾角收集血液，此时血液含大量病毒；

[0063] 用收集的血液进行穿刺接种，血液即取即用，或冷藏保存时间不超过6h；

[0064] 选择BmNPV敏感品系的5龄末期健康蚕；使用规格为32G的注射器，使用前煮沸30分钟消毒，再使用体积分数75％酒精消毒；

[0065] 取消毒好的注射器抽取所述血液，从蚕的头往尾方向第6‑9环节的任一节间膜处，剌入家蚕体壁，接种带BmNPV病毒的所述血液；

[0066] 接种后，熟蚕上蔟，进行25‑26℃，空气湿度65％的正常温湿度保护，上蔟2天后采茧，再过约2天化蛹后削茧，蛹单层平铺于蚕窝中，经过3‑4天后出现环节松弛，蛹体发软，体壁易破病症，即可收集病蛹，保存于‑20℃。

[0067] 实施例3

[0068] 喂食接毒5龄末期蚕或穿刺接毒获得不含其它病毒病原的纯BmNPV病蛹的方法，包括：

[0069] 将保存的BmNPV病毒配制成浓度109PIB/ml的病毒液，取桑叶在病毒液中浸泡10分钟，将桑叶捞起、晾干后得到带病毒桑叶；

[0070] 带病毒桑叶添食到BmNPV敏感品系的5龄期的起蚕中，保证蚕饱食，8‑12小时后病毒叶食光或接近食光后就使用正常叶饲养，5‑6天后收集出现症狂躁爬行、环节和节间膜肿胀、气门出现油浸斑，血液浑浊的典型病状的活蚕，用体积分数75％的酒精消毒蚕体，晾干后剪尾角收集血液，此时血液含大量病毒；

[0071] 用收集的血液进行穿刺接种，血液即取即用，或冷藏保存时间不超过6h；

[0072] 选择化蛹24‑48小时的BmNPV敏感品系健康嫩蚕蛹，此时蛹皮刚刚变硬，蛹体用有效氯1％的漂白粉溶液浸泡消毒30s，冲洗、晾干体表水分，备用；

[0073] 使用规格为32G的注射器，使用前煮沸30分钟消毒，再使用体积分数75％酒精消毒；

[0074] 取消毒好的注射器抽取所述血液，从蛹头往尾方向的蛹背部第2或第3环节将蛹皮轻轻刺破，将血液接种到蚕蛹中；

[0075] 把接种后的蚕蛹置于25‑29℃的条件下发育96‑120小时，到发病中后期，蛹体出现环节松弛，蛹体开始发软的病状，即可收集得到病蛹，收集的病蛹于‑20℃保存。

[0076] 通过本发明的病蛹获取家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的方法为：将实施例1～3的病蛹破碎后，提取和收集提取液即可。

[0077] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。