一种带正电荷的抗真菌肽QM-18及其应用转让专利
申请号 : CN202210645813.0
文献号 : CN114853850B
文献日 : 2023-05-02
发明人 : 陈雪艳 , 吴刘记 , 田磊 , 范文杰
申请人 : 河南农业大学
摘要 :
本发明属于生物化学领域，涉及抗真菌肽，特别是指一种带正电荷的抗真菌肽QM‑18及其应用。所述抗真菌肽含有四个带正电荷的区域，通过改变膜通透性，破坏真菌细胞膜，使细胞内溶物外泄实现抗菌作用。经琼脂扩散实验验证得出对新月弯孢菌具有抗菌活性的结论。经分析确认本申请筛选得到的肽QM‑18和膜上的带负电荷的物质相结合，致使真菌细胞膜破损，产生抗真菌作用。
权利要求 :
1.一种带正电荷的抗真菌肽QM‑18，其特征在于：所述抗真菌肽QM‑18的氨基酸序列为‑Gln Met Lys Ile Cys Ile Ala Glu Pro Pro Lys Ile Ser Lys Phe Phe Ser Lys‑。
2.利用权利要求1得到的抗真菌肽QM‑18制备的抗真菌肽药剂。
3.权利要求1所述的抗真菌肽QM‑18在治疗玉米弯孢叶斑病中的应用。
4.权利要求2所述的抗真菌肽药剂在治疗玉米弯孢叶斑病中的应用。
说明书 :
一种带正电荷的抗真菌肽QM‑18及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物化学领域，涉及抗真菌肽，特别是指一种带正电荷的抗真菌肽QM‑18及其应用。
背景技术
[0002] 新月弯孢菌是具有光滑、弯曲、三隔、黑色的分生孢子，大小为20 34 μm× 7 ~ ~17 μm，寄生在240 446 μm的分生孢子梗上。新月弯孢菌可引起玉米弯孢叶斑病，对世界~
范围内的玉米种植和生产造成重大影响。在我国，弯孢叶斑病已成为玉米的主要病害。20世纪90年代，该病菌造成了巨大的产量损失，并蔓延到全国10多个省份。玉米弯孢叶斑病症状包括圆形至椭圆形、浅褐色至浅棕色病变（直径0.5 2.0 mm），边缘为红褐色，在棕色花丝~
期玉米中上冠层常有褪绿晕症状。王兰对非亲合反应体系中掖单13叶片的新月弯孢菌发育及侵染过程的研究发现，接种后24 h分生孢子萌发，分生孢子从一端萌发形成芽管，在48 h后侵入叶细胞，72 h后菌丝从气孔上穿过，接种96 h后产生典型病斑。薛春生等研究结果表明，接种2 h后新月弯孢菌分生孢子即可萌动，4 h后萌发率超过80%。分生孢子大多数可两端萌发，12 24 h即可从气孔或细胞间隙侵入细胞。虽然不少研究已经鉴定到了玉米弯孢~
叶斑病的抗性位点，但是还需有效的抗菌物质控制新月弯孢菌的生长和传播。
范围内的玉米种植和生产造成重大影响。在我国，弯孢叶斑病已成为玉米的主要病害。20世纪90年代，该病菌造成了巨大的产量损失，并蔓延到全国10多个省份。玉米弯孢叶斑病症状包括圆形至椭圆形、浅褐色至浅棕色病变（直径0.5 2.0 mm），边缘为红褐色，在棕色花丝~
期玉米中上冠层常有褪绿晕症状。王兰对非亲合反应体系中掖单13叶片的新月弯孢菌发育及侵染过程的研究发现，接种后24 h分生孢子萌发，分生孢子从一端萌发形成芽管，在48 h后侵入叶细胞，72 h后菌丝从气孔上穿过，接种96 h后产生典型病斑。薛春生等研究结果表明，接种2 h后新月弯孢菌分生孢子即可萌动，4 h后萌发率超过80%。分生孢子大多数可两端萌发，12 24 h即可从气孔或细胞间隙侵入细胞。虽然不少研究已经鉴定到了玉米弯孢~
叶斑病的抗性位点，但是还需有效的抗菌物质控制新月弯孢菌的生长和传播。
[0003] 抗菌肽是具有抗菌、抗病毒和抗真菌活性的小分子物质，因其广谱快速的杀菌活性、低毒性和不易使病原体产生耐药性使它们成为开发抗菌物质的目标。自1942年，Stuart在小麦中发现第一个抗菌肽以来，已经有3000多种来源于细菌、真菌、植物、动物、人类的抗菌肽被鉴定出来。
[0004] 测序技术的发展加快了公共序列库中各种生物的基因组和蛋白质组数据的可用性。在这些大型数据库中使用湿实验室方法标注抗菌肽需要耗费大量的财力、物力。抗菌肽属于各种抗菌肽家族，这些家族表现出独特的序列组成，如防御素中半胱氨酸的保守性，组素中组氨酸的丰度，特殊氨基酸的保守性等。这种家族保守的特异性序列可以从大量序列数据中识别抗菌肽。家族的序列特征是检索和注释序列数据库中可用序列的强大工具，是寻找抗菌肽的便捷手段。
[0005] 但是，以往研究的抗菌肽主要是来源于传统ORF区的传统肽（CP）或者非核糖体依赖型的抗菌肽。而最新的研究表明另一种新型小肽‑非传统肽（NCP）在生物各种生命活动中也发挥着重要的功能。
发明内容
[0006] 本发明提出一种带正电荷的抗真菌肽QM‑18及其应用，提供了一种新型的带正电荷的小肽‑非传统肽，该肽在抗真菌中取得了显著的抑制效果。
[0007] 本发明的技术方案是这样实现的：
[0008] 一种带正电荷的抗真菌肽，所述抗真菌肽含有四个带正电荷的区域。
[0009] 优选的，所述抗真菌肽通过改变膜通透性，破坏真菌细胞膜，使细胞内溶物外泄实现抗菌作用。
[0010] 优选的，所述氨基酸序列为‑Gln Met Lys Ile Cys Ile Ala Glu Pro Pro Lys Ile Ser Lys Phe Phe Ser Lys‑。
[0011] 利用上述的抗真菌肽制备的抗真菌肽药剂。
[0012] 上述的抗真菌肽在抗真菌中的应用。
[0013] 优选的，所述真菌为新月弯孢菌。
[0014] 上述的抗真菌肽在治疗玉米弯孢叶斑病中的应用。
[0015] 上述的抗真菌肽药剂在治疗玉米弯孢叶斑病中的应用。
[0016] 本发明具有以下有益效果：
[0017] 1、本申请筛选合成的肽QM‑18纯度>90％，经琼脂扩散实验验证得出对新月弯孢菌具有抗菌活性的结论。经分析确认本申请筛选得到的肽QM‑18和真菌细胞膜上的带负电荷的物质相结合，致使真菌细胞膜破损，膜通透性增加，导致细胞内溶物外泄，产生抗真菌作用。
[0018] 2、本申请筛选到的非传统肽QM‑18序列为“‑Gln Met Lys Ile Cys Ile Ala Glu Pro Pro Lys Ile Ser Lys Phe Phe Ser Lys‑”，来源于内含子区，分子量为2167.16 Da，等电点为9.63。
附图说明
[0019] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020] 图1为本申请合成的小肽的质谱图。
[0021] 图2为本申请合成的小肽的液相色谱图。
[0022] 图3为小肽对新月弯孢菌的表型鉴定。
[0023] 图4为琼脂扩散法验证肽QM‑18的抗菌活性。
[0024] 图5为肽QM‑18的表面电荷分布。
具体实施方式
[0025] 下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例
[0026] 1.1抗菌肽预测
[0027] 利用两个抗菌肽预测网站对候选氨基酸序列的FASTA格式进行预测，分别是CAMPR3（http://www.camp.bicnirrh.res.in/predict/）的四种算法（SVM、Random Forest、Artificial Neural Network和Discriminant Analysis）和AMP Scanner Vr.2（https://www.dveltri.com/ascan/v2/ascan.html），以概率大于50%为标准对预测结果进行筛选，将概率大于50%的肽进行实验验证。
[0028] 1.2肽合成
[0029] 通过Fmoc（9‑芴基甲氧基羰基）多肽固相合成的方法进行合成，顺序为从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。首先，将有Fmoc保护的氨基酸连接在树脂上，用20%哌啶/DMF溶液将树脂中的Fmoc保护基脱去，使其露出活泼的NH2基，第二个Fmoc保护的氨基酸通过HBTU法被连接上，直到整条肽链连接完毕。用DMF溶剂将肽链从树脂上洗脱下来得到粗品。具体实验方法如下：
[0030] （1）树脂合成
[0031] a. Fmoc‑AA‑王树脂
[0032] 通过Fmoc‑AA‑OH上的羧基与王树脂上的‑OH脱去1分子H2O反应得到。反应如下：
[0033]
[0034] 具体合成步骤如下：
[0035] 在圆底烧瓶中加入称好的王树脂，加入适量干燥DMF溶胀，用磁子搅拌，加入1.5 eq的Fmoc‑AA‑OH，再加6 eq的吡啶，直到Fmoc‑AA‑OH溶解后用滴管缓慢的滴加3 eq的2,6‑二氯苯甲酰氯，加完后用橡皮塞盖紧，震荡反应3 h以上。用砂芯漏斗抽滤除去溶液后，用DMF（3次）、MeOH（1次）、DCM（3次）和MeOH（2次）洗涤树脂。再转入收集管中，在真空干燥器中过夜抽干。
[0036] b. Fmoc‑AA‑2‑Cl Trt树脂的合成
[0037] 通过Fmoc‑AA‑OH上的羧基与2‑Cl Trt树脂上的‑Cl脱去1分子HCl反应得到Fmoc‑AA‑2‑Cl Trt Resin，主要用于C端是Pro，Cys，His这三种氨基酸的合成。反应如下：
[0038]
[0039] 具体合成步骤如下：
[0040] 在圆底烧瓶中加入称量好的2‑Cl Trt树脂和2 eq的Fmoc‑AA‑OH，加入适量干燥的DCM溶胀树脂和溶解氨基酸，再加入6 eq的DIPEA。用塞子盖紧，在室温下搅拌反应2‑3 h。再加入HPLC级MeOH（1 g树脂加10 ml）搅拌30 min。用砂芯漏斗抽滤除去溶液后，用DMF（3次）、MeOH（1次）、DCM（3次）和MeOH（2次）洗涤树脂。再转入收集管中，在真空干燥器中过夜抽干。
[0041] c. Rink Amide MBHA树脂合成
[0042] 通过Linker Amide 基团与MBHA树脂连接反应得到。具体步骤如下：
[0043] 将MBHA树脂加入反应器中，加入2 eq HB活化Rink Amide，加入6倍量NMM。反应3‑4 h。封端，将树脂移入砂芯漏斗分别用DMF洗涤3次、MeOH洗涤1次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次。树脂移入真空抽干。
[0044] （2）树脂用量的称量及溶胀
[0045] 根据要合成肽的摩尔数及树脂的取代度（树脂量=要合成肽的摩尔数/树脂的取代度），计算出所需的树脂量，然后称出树脂，放入贴有相应编号的反应器中。将上述加有树脂的反应器在架子上放置好，加入3‑5倍树脂床层体积的DMF，浸胀30 min。
[0046] （3）脱保护及其洗涤
[0047] 加入约3倍树脂床层体积的20%哌啶/DMF溶液，通氮气反应5 min后，将其抽去，再加入约3倍树脂床层体积的20%哌啶/DMF溶液，通氮气反应15 min。
[0048] （4）脱保护后茚三酮检测
[0049] 取少量的树脂于检测小试管中，加入茚三酮，110‑120℃温度下反应3 min，然后观察其显色。不同的氨基酸会显出不同的颜色，大多数的氨基酸树脂会呈现深蓝色或蓝色，而Pro、Asn、Asp、Gln、Glu、His和Cys多数显红色或红褐色。但是由于合成时肽的序列不同，所以氨基酸显示出的颜色也不是完全符合上述说的情形，有时会受到前面氨基酸的影响而显示其他颜色。但是，只要脱保护后进行的茚三酮检测反应，树脂显示出的颜色和连接时有明显区别，则说明脱保护反应进行完全。
[0050] （5）连接反应
[0051] 溶剂：
[0052] DMF（N，N‑二甲基甲酰氨），DCM（二氯甲烷）
[0053] 原料配比：
[0054] AA：HBTU：NMM=3：2.85：6（摩尔比）
[0055] 将氨基酸加入反应器中，加入能使氨基酸溶解的最少量的DMF，再加入HBTU，再加入NMM，反应60 min。
[0056] 注：①加DMF溶解前要先开氮气，防止氨基酸漏掉。
[0057] ②一定要等氨基酸完全溶解后再加入HBTU。
[0058] ③反应时DMF溶剂的加入量以全部浸没树脂为准。
[0059] ④氮气搅拌的气流要适当。
[0060] （6）连接后NT检测
[0061] 用滴管取少量树脂于检测试管中，先用DMF和MeOH各清洗树脂一遍，后面步骤同脱保护检测。连接完全后树脂一般是无色透明，少数情况下会显淡黄色。跟前面脱保护所显颜色比较区别很明显，则表示连接完全。
[0062] （7）封端
[0063] 配比：5%‑10%乙酸酐/DMF+NMM（乙酸酐：NMM=1：1）
[0064] 加入树脂层3倍体积的封端溶液，通氮气搅拌30 min，然后抽掉溶液，先用DCM冲洗反应器口，再用DMF洗涤5遍，将封端液洗净。
[0065] （8）连接后的洗涤
[0066] 连接后的洗涤与脱保护后的洗涤方法相同，只是连接后洗涤三次即可。
[0067] 重复前面的步骤，直到一条肽链完成
[0068] （9）树脂转移
[0069] 用DMF溶剂将脱保护洗涤后的树脂转移到砂芯漏斗中，用甲醇洗一次，DCM溶剂洗三次，再用甲醇洗两次。最后一次洗涤用甲醇尽量使树脂聚集在砂芯漏斗的中心，抽干，转移至小收集管中，贴好标签，置于真空干燥器内抽干，以备切割。
[0070] （10）切割
[0071] a. 切割液的配制
[0072] A液：TFA：茴香硫醚：苯酚：EDT：水=87.5：5：2.5：2.5：2.5
[0073] B液：TFA：TIS：水=95：3：2
[0074] b. 切割液的选择和用量
[0075] 一般含有Cys，Met和侧链未保护的Trp的肽链选用A液，其它肽都用B液。1 g树脂一般加10‑15 ml切割液。
[0076] c. 切割时间
[0077] 指向树脂中加入切割液开始，到用乙醚沉淀滤液为止这段时间。对于短肽（如五、六肽）切2 h，10个以上的切2.5 h，对于30个以上的肽来说，适当延长时间。
[0078] 加入适量的切割液，放入摇床上反应，减压抽滤，收集滤液，将滤液用乙醚冲洗在离心管中。在离心机中离心沉淀（转速在4000 rad/min左右），倒掉上清液，用玻璃棒将沉淀捣碎，用乙醚冲洗，再离心沉淀。按以上方法重复清洗三遍。
[0079] 将粗品放入真空干燥器内抽干，然后利用HPLC进行纯化，得到纯度> 90%的纯品，并进行质谱鉴定。
[0080] 1.3肽溶液的配置
[0081] 将合成好的肽溶解于无菌水中，然后用无菌水配置成肽浓度为10 mM的母液，‑20℃保存。
[0082] 1.4表型鉴定
[0083] PDA培养基高温高压灭菌后，与肽溶液混合配置成肽终浓度为100μΜ的混合液用无菌水代替肽溶液作为对照。充分混匀后倒入直径为30mm的无菌培养皿中。待培养基凝固后，从培养四天的真菌菌落外缘取一个5mm的菌饼，菌丝面朝下，接种在培养基的中央。在黑暗，28℃条件下培养。24小时后观察菌落生长情况。
[0084] 1.5抑菌圈
[0085] 新月弯孢菌培养15天后，用无菌水将孢子冲洗掉，调整菌浓度为1×106个/mL。PDA培养基高温高压灭菌后，在培养皿内倒平板。100 μL孢子在培养基上均匀涂布，然后在培养皿的中心放置含肽或不含肽的滤纸片。在黑暗，28℃条件下培养。
[0086] 1.6表面电荷分析
[0087] 利用AlphaFold2的Google Colab在线版本（https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/
AlphaFold2.ipynb）对小肽进行结构预测，预测得到的蛋白结构以PDB文件格式进行下载，将下载的PDB文件导入PyMOL软件（Version 2.5.2）生成蛋白质模型，通过APBS软件插件（https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/plugins/apbsrun/）进行进一步的净电荷分布分析。
AlphaFold2.ipynb）对小肽进行结构预测，预测得到的蛋白结构以PDB文件格式进行下载，将下载的PDB文件导入PyMOL软件（Version 2.5.2）生成蛋白质模型，通过APBS软件插件（https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/plugins/apbsrun/）进行进一步的净电荷分布分析。
[0088] 2结果分析
[0089] 2.1抗菌肽的筛选
[0090] 为了筛选具有抗菌活性的小肽，我们首先在玉米中鉴定到的小肽挑选31个进行抗菌肽的预测，发现11个小肽QV‑11、KP‑11、KE‑12、KD‑13、GN‑8、QM‑18、KP‑10、KL‑9、GA‑16、IL‑11、PI‑8在至少一个数据库或算法中预测出有抗菌活性（表1）。
[0091] 表1抗菌肽预测
[0092]
[0093] 注：CAMPR3（SVM、RF、DAc）、AMP scanner大于0.5认定为有抗菌活性，CAMPR3（ANN）为Y认定为有抗菌活性。
[0094] 2.2玉米非传统肽的合成与质谱鉴定
[0095] 为了验证抗菌肽的活性，我们对11个小肽进行化学合成，通过质谱分析发现非传统肽的结构和分子量都与预期一致（图1），进一步利用高效液相色谱对合成的玉米非传统肽进行纯度分析发现，合成的肽的纯度>90％（图2），满足要求，可以用于后续实验。
[0096] 2.3抗新月弯孢菌小肽的筛选
[0097] 新月弯孢菌分别在含肽的培养基上和对照培养基（不含肽）上生长，在接种后24小时对菌落进行观察，发现随着时间的推移，虽然菌落都在扩展生长，但是在肽QM‑18培养基上的扩展速度明显小于对照，但是其他10个肽与对照没有明显的差异（图3）。这些结果表明肽QM‑18对新月弯孢菌具有抗菌活性。
[0098] 2.4肽QM‑18抗菌活性
[0099] 为了进一步研究肽QM‑18的抗菌活性，我们利用琼脂扩散实验进行验证。发现含肽QM‑18的滤纸片周围有抑菌圈出现，但是不含肽的滤纸片周围没有抑菌圈出现（图4）。这些结果进一步验证了肽QM‑18对新月弯孢菌具有抗菌活性。
[0100] 2.5肽QM‑18的抗菌机制
[0101] 之前的研究表明，吲哚杀菌素模拟物CP‑11具有增加的正电荷和两亲性质，导致更大的抗真菌和抗菌活性。为了探索肽QM‑18的抗菌机制，我们预测了肽QM‑18的三维结构及表面净电荷。如图5所示，我们可以看到肽QM‑18含有四个带正电的区域（白色部分），猜测肽QM‑18可能和膜上的带负电荷的物质相结合，致使真菌细胞膜破损，膜通透性增加，导致细胞内溶物外泄，产生抗真菌作用。
[0102] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。