鼠源弓形虫FtsH1单克隆抗体及其应用

摘要

本发明公开了鼠源弓形虫FtsH1单克隆抗体及其应用；所述单克隆抗体为1H3和5F7，本发明中的单克隆抗体1H3和5F7均可以特异性的识别弓形虫FtsH1蛋白。为进一步研究弓形虫FtsH1功能及弓形虫“迟发型死亡”奠定基础，同时也为新型抗虫药物的研制及弓形虫病的治疗提供了相关理论依据。可应用于检测或诊断弓形虫所致疾病或开发相关治疗性抗体或药物。

权利要求

1.一种FtsH1单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为1H3或5F7；

所述1H3包括1H3轻链可变区和1H3重链可变区；

所述1H3轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；

所述1H3轻链可变区CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1；

所述1H3轻链可变区CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO.2；

所述1H3轻链可变区CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO.3；

所述1H3重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；

所述1H3重链可变区CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO.4；

所述1H3重链可变区CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO.5；

所述1H3重链可变区CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO.6；

所述5F7包括5F7轻链可变区和5F7重链可变区；

所述5F7轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；

所述5F7轻链可变区CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO.7；

所述5F7轻链可变区CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO.2；

所述5F7轻链可变区CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO.3；

所述5F7重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；

所述5F7重链可变区CDR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO.4；

所述5F7重链可变区CDR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO.5；

所述5F7重链可变区CDR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO.6。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述1H3包含1H3轻链可变区和1H3重链可变区；

所述1H3轻链可变区的氨基酸序列为：SEQ ID NO.9；

所述1H3重链可变区的氨基酸序列为：SEQ ID NO.11；

所述5F7包含5F7轻链可变区和5F7重链可变区；

所述5F7轻链可变区的氨基酸序列为：SEQ ID NO.13；

所述5F7重链可变区的氨基酸序列为：SEQ ID NO.11。

3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述1H3属于IgG1亚型单克隆抗体，所述5F7属于IgG2b亚型单克隆抗体。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括权利要求1～3任一项所述的单克隆抗体的编码基因。

5.一种载体，包含权利要求4所述的核酸分子。

6.一种细胞，包含权利要求5所述的载体。

7.权利要求1～3任一项所述单克隆抗体或权利要求4所述核酸分子或权利要求5所述载体或权利要求6所述细胞在以下任一种中的应用：a1)非诊断目的的检测FtsH1蛋白；

a2)制备检测FtsH1蛋白的产品；

a3)制备检测或诊断刚地弓形虫所致疾病的产品；

a4)制备治疗刚地弓形虫所致疾病的药物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测FtsH1蛋白的产品为试剂盒或芯片。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。

10.一种产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1～3任一项所述单克隆抗体或权利要求4所述核酸分子或权利要求5所述载体或权利要求6所述细胞。

11.一种非诊断目的检测FtsH1蛋白的方法，通过使用权利要求1～3任一项所述单克隆抗体进行检测。

说明书

鼠源弓形虫FtsH1单克隆抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种鼠源弓形虫FtsH1单克隆抗体及其应用。

背景技术

[0002] 刚地弓形虫是一种顶复门寄生虫，能够感染包括人在内的所有温血动物，引起人畜共患的弓形虫病。成年人感染弓形虫，在一定条件下可造成脑、眼等器官的损害,严重者甚至导致死亡；孕妇感染可造成胚胎的先天性危害。目前对于弓形虫病的治疗，临床上仍缺乏有效的治疗药物，现有的药物存在着副作用大，局限性大的问题。

[0003] 研究表明，顶复门寄生虫体内含有一个特殊的，不可或缺的细胞器，具有与藻类和植物的叶绿体同源的残留质体，称为顶质体。顶质体在进化过程中，逐渐丧失了光合作用的功能，但仍发挥着不可或缺的作用，如顶质体中的II型酯酸合成代谢酶，参与脂肪酸的合成，其他相关代谢酶参与血红素的合成等。弓形虫顶质体的丢失或缺乏，可导致虫体的大量死亡。研究发现，多西环素、克林霉素等顶质体抑制剂能够阻止顶质体原核蛋白的翻译，这种现象不会导致虫体的直接死亡，而是会导致其延迟死亡，称为“迟发型死亡”。顶质体缺乏引起的“迟发型死亡”为弓形虫病的治疗提供了一条新途径。若用于临床治疗可大大降低药物的副作用，对于寄生虫病的治疗有着极大的帮助。

[0004] 在对于顶质体的研究中发现，金属蛋白酶TgFtsH1可作为相关寄生虫中放线菌素的靶点,引起顶质体发育缺陷并抑制重组表达。基于此，本实验拟通过制备FtsH1蛋白单克隆抗体，筛选出与FtsH1互作的蛋白，进而研究FtsH1蛋白的作用机制，为弓形虫病的药物治疗提供一个新的靶点。

发明内容

[0005] 本发明第一方面的目的，在于提供一种单克隆抗体。

[0006] 本发明第二方面的目的，在于提供一种核酸分子。

[0007] 本发明第三方面的目的，在于提供一种载体。

[0008] 本发明第四方面的目的，在于提供一种细胞。

[0009] 本发明第五方面的目的，在于提供上述单克隆抗体、核酸分子、载体或细胞的应用。

[0010] 本发明第六方面的目的，在于提供一种产品。

[0011] 本发明第七方面的目的，在于提供一种检测FtsH1蛋白的方法。

[0012] 本发明所采取的技术方案是：

[0013] 本发明的第一方面，提供一种FtsH1单克隆抗体，可以用于检测弓形虫FtsH1蛋白，所述单克隆抗体为1H3或5F7；

[0014] 所述1H3包括1H3轻链可变区和1H3重链可变区；

[0015] 所述1H3轻链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3；

[0016] 所述1H3轻链可变区CDR1的氨基酸序列为：

[0017] a)SEQ ID NO.1；或

[0018] b)与SEQ ID NO.1所述至少95％相同；或

[0019] c)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0020] 所述1H3轻链可变区CDR2的氨基酸序列为：

[0021] a)SEQ ID NO.2；或

[0022] b)与SEQ ID NO.2所述至少95％相同；或

[0023] c)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0024] 所述1H3轻链可变区CDR3的氨基酸序列为：

[0025] a)SEQ ID NO.3；或

[0026] b)与SEQ ID NO.3所述至少95％相同；或

[0027] c)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0028] 所述1H3重链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3；

[0029] 所述1H3重链可变区CDR1的氨基酸序列为：

[0030] a)SEQ ID NO.4；或

[0031] b)与SEQ ID NO.4所述至少95％相同；或

[0032] c)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0033] 所述1H3重链可变区CDR2的氨基酸序列为：

[0034] a)SEQ ID NO.5；或

[0035] b)与SEQ ID NO.5所述至少95％相同；或

[0036] c)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0037] 所述1H3重链可变区CDR3的氨基酸序列为：

[0038] a)SEQ ID NO.6；或

[0039] b)与SEQ ID NO.6所述至少95％相同；或

[0040] c)SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0041] 所述5F7包括5F7轻链可变区和5F7重链可变区；

[0042] 所述5F7轻链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3；

[0043] 所述5F7轻链可变区CDR1的氨基酸序列为：

[0044] a)SEQ ID NO.7；或

[0045] b)与SEQ ID NO.7所述至少95％相同；或

[0046] c)SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0047] 所述5F7轻链可变区CDR2的氨基酸序列为：

[0048] a)SEQ ID NO.2；或

[0049] b)与SEQ ID NO.2所述至少95％相同；或

[0050] c)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0051] 所述5F7轻链可变区CDR3的氨基酸序列为：

[0052] a)SEQ ID NO.3；或

[0053] b)与SEQ ID NO.3所述至少95％相同；或

[0054] c)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0055] 所述5F7重链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3；

[0056] 所述5F7重链可变区CDR1的氨基酸序列为：

[0057] a)SEQ ID NO.4；或

[0058] b)与SEQ ID NO.4所述至少95％相同；或

[0059] c)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0060] 所述5F7重链可变区CDR2的氨基酸序列为：

[0061] a)SEQ ID NO.5；或

[0062] b)与SEQ ID NO.5所述至少95％相同；或

[0063] c)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0064] 所述5F7重链可变区CDR3的氨基酸序列为：

[0065] a)SEQ ID NO.6；或

[0066] b)与SEQ ID NO.6所述至少95％相同；或

[0067] c)SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。

[0068] 在本发明的一些实施方式中，

[0069] 所述1H3包含轻链可变区和重链可变区；

[0070] 所述1H3轻链可变区的氨基酸序列为：

[0071] a)SEQ ID NO.9；或

[0072] b)与SEQ ID NO.9所述至少95％相同；或

[0073] c)SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0074] 所述1H3重链可变区的氨基酸序列为：

[0075] a)SEQ ID NO.11；或

[0076] b)与SEQ ID NO.11所述至少95％相同；或

[0077] c)SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0078] 所述5F7轻链可变区的氨基酸序列为：

[0079] a)SEQ ID NO.13；或

[0080] b)与SEQ ID NO.13所述至少95％相同；或

[0081] c)SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；

[0082] 所述5F7包含轻链可变区和重链可变区；

[0083] 所述5F7重链可变区的氨基酸序列为：

[0084] a)SEQ ID NO.11；或

[0085] b)与SEQ ID NO.11所述至少95％相同；或

[0086] c)SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。

[0087] 在本发明的一些实施方式中，所述1H3属于IgG1亚型单克隆抗体，所述5F7属于IgG2b亚型单克隆抗体。

[0088] 在本发明的一些实施方式中，所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体。

[0089] 本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包括本发明第一方面所述的单克隆抗体的编码基因。

[0090] 在本发明的一些实施方式中，所述单克隆抗体为1H3时，所述核酸分子包括：编码所述1H3的轻链可变区的核酸分子和编码所述1H3的重链可变区的核酸分子。

[0091] 在本发明的一些实施方式中，编码所述1H3的轻链可变区的核酸分子的序列如SEQ ID NO.8所示；编码所述1H3的重链可变区的核酸分子的序列如SEQ ID NO.10所述。

[0092] 在本发明的一些实施方式中，所述单克隆抗体为5F7时，所述核酸分子包括：编码所述5F7的轻链可变区的核酸分子和编码所述5F7的重链可变区的核酸分子。

[0093] 优选地，编码所述5F7的轻链可变区的核酸分子的序列如SEQ ID NO.12所示；编码所述5F7的重链可变区的核酸分子的序列如SEQ ID NO.10所述。

[0094] 本发明的第三方面，提供一种载体，包含本发明第二方面所述的核酸分子。

[0095] 本发明的第四方面，提供一种细胞，包含本发明第三方面所述的载体。

[0096] 本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述单克隆抗体或本发明第二方面所述核酸分子或本发明第三方面所述载体或本发明第四方面所述细胞在以下任一种中的应用：

[0097] a1)检测FtsH1蛋白中的应用；

[0098] a2)制备检测FtsH1蛋白的产品中的应用；

[0099] a3)在制备检测或诊断刚地弓形虫所致疾病的产品中的应用；

[0100] a4)在制备或开发刚地弓形虫所致疾病的治疗性抗体中的应用；

[0101] a5)在制备或开发刚地弓形虫所致疾病的药物中的应用。

[0102] 在本发明的一些实施方式中，所述检测FtsH1蛋白的产品为试剂盒或芯片，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。

[0103] 本发明的第六方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第一方面所述单克隆抗体或本发明第二方面所述核酸分子或本发明第三方面所述载体或本发明第四方面所述细胞。

[0104] 本发明的第七方面，提供一种检测FtsH1蛋白的方法，通过使用本发明第一方面所述单克隆抗体进行检测。

[0105] 本发明的有益效果是：

[0106] 本发明以重组表达纯化的FtsH1蛋白包被ELISA板，通过间接ELISA法检测纯化抗体的效价，并用此纯化抗体得到两种单克隆抗体1H3和5F7，并且对收集的弓形虫顶质体蛋白进行WesternBlot鉴定以及免疫荧光实验，结果表明单克隆抗体1H3和5F7均可以特异性的识别弓形虫FtsH1蛋白。为进一步研究弓形虫FtsH1功能及弓形虫“迟发型死亡”奠定基础，同时也为新型抗虫药物的研制及弓形虫病的治疗提供了相关理论依据。可应用于检测或诊断弓形虫所致疾病或开发相关治疗性抗体或药物。

附图说明

[0107] 图1为FtsH1基因扩增结果。M表示DNA marker(2000bp)；1为扩增产物结果。

[0108] 图2为pET‑28a(+)‑FtsH1重组质粒PCR鉴定。M表示DNA marker(5000bp)；1～7分别表示挑取的单克隆菌落PCR片段。

[0109] 图3为pET28a(+)‑FtsH1的诱导表达。

[0110] 图4为考马斯亮蓝检测FtsH1蛋白纯化结果M表示蛋白质marker2510；1表示流穿液；2表示pH6.5 wash buffer洗脱液；3～10表示pH4.5 Elution buffer洗脱液。

[0111] 图5为考马斯亮蓝检测FtsH1蛋白复性结果。

[0112] 图6为间接ELISA法检测FtsH1蛋白免疫小鼠血清平均效价。

[0113] 图7为单克隆杂交瘤细胞株上清效价测定。

[0114] 图8为小鼠单克隆抗体IgG亚类亚型鉴定结果。利用间接ELISA检测获得的抗体亚型，其中1H3株分泌IgG1亚型单克隆抗体，5F7株分泌IgG2b亚型单克隆抗体。

[0115] 图9为FtsH1‑1H3‑单克隆抗体轻重链PCR扩增结果。

[0116] 图10为FtsH1‑5F7‑单克隆抗体轻重链PCR扩增结果。

[0117] 图11为FtsH1单克隆抗体1H3、5F7抗体可变区PCR扩增。

[0118] 图12为FtsH1单克隆抗体1H3、5F7 wb鉴定。

[0119] 图13为FtsH1单克隆抗体与弓形虫sag1抗体IF鉴定结果。

[0120] 图14为FtsH1单克隆抗体与弓形虫顶质体其他蛋白cpn60抗体IF鉴定结果。

具体实施方式

[0121] 以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

[0122] 实施例1构建pET‑28a(+)‑FtsH1重组质粒

[0123] (1)FtsH1基因的扩增与纯化

[0124] 依据ToxoDB数据库获取弓形虫ME49虫株的FtsH1基因序列(TGME49_259260)设计引物，在上游引物前加入BamHI酶切位点，在下游引物前加入HindIII酶切位点，提取弓形虫ME49虫株RNA,逆转录为cDNA，用引物进行FtsH1基因的扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后通过 Gel Extraction Kit试剂盒进行切胶回收，纯化得到FtsH1基因片段，结果如图1所示，所述设计引物序列如下：

[0125] 上游引物:GGATCCGGCGTTTTGCTTGTGGGACCT(SEQ ID NO.14)，下划线为BamHI限制性内切酶识别碱基序列。

[0126] 下游引物:AAGCTTTCTAGCGGCGAGGAGAGCCGCTT(SEQ ID NO.15)，下划线为HindIII限制性内切酶识别碱基序列。

[0127] PCR反应体系见表1。

[0128] 表1 PCR反应体系

[0129]

[0130] PCR反应参数见表2。

[0131] 表2 PCR反应参数

[0132]

[0133] (2)FtsH1基因和pET‑28a(+)载体的双酶切与酶连

[0134] ①使用限制性核酸内切酶BamHI和HindIII对FtsH1基因和pET‑28a(+)载体进行双酶切，配制双酶切反应体系，反应条件为37℃，2h。

[0135] 双酶切反应体系见表3。

[0136] 表3双酶切反应体系

[0137]

[0138]

[0139] ②酶切后进行核酸凝胶电泳，切胶回收纯化，使用T4 DNA连接酶按摩尔比为5：1连接FtsH1基因和pET‑28a(+)载体，酶连反应条件为22℃，2.5h。

[0140] 酶连反应体系见表4。

[0141] 表4酶连反应体系

[0142]

[0143] (3)pET‑28a(+)‑FtsH1重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中

[0144] ①从‑80℃取出冻存的BL21(DE3)感受态细胞，冰上溶化；

[0145] ②取10μL重组质粒轻轻加入BL21(DE3)感受态细胞悬液中，轻轻混匀(不要来回吹打)，冰水混合物中静置30min；

[0146] ③42℃水浴热激30s；

[0147] ④冰水混合物中静置2min；

[0148] ⑤加入500μL无抗LB培养基，轻轻混匀后将EP管转移至摇床上，37℃，250r/min培养1h；

[0149] ⑥吸取200μL菌液，用涂布棒将其涂布于含有卡那霉素(Kanamycin)的固体LB培养基上，先将平板正置于室温至液体被吸收干后，再将平板倒置于37℃温箱中培育12～16h；

[0150] ⑦在平板上挑取7个单克隆菌落分别加入10μL ddH2O，进行菌落PCR以及电泳，结果如图2所示。从图2中可以看出FtsH1基因正确插入pET‑28a载体。

[0151] (4)pET‑28a(+)‑FtsH1阳性克隆的扩大培养和保种

[0152] 根据PCR电泳结果，将阳性条带所代表的菌落分别加入6mlLB培养液(kana+)中继续培养12～16h。将上述扩大培养的菌液提取质粒后送测序，结果显示质粒已成功导入感受态细胞后，取500μL菌液与500μL的80％甘油以1:1比例混匀，即获得了含重组FtsH1质粒的甘油菌，保存于‑80℃备用。

[0153] 实施例2 FtsH1免疫蛋白的表达和纯化

[0154] (1)诱导表达FtsH1蛋白

[0155] ①从‑80℃冰箱里取出保存的甘油菌，吸取100μL菌液加入到含有4ml LB培养基(Kana+)15mL离心管中，迅速将甘油菌放回‑80℃冰箱。将离心管置于摇床中，37℃、250rpm摇菌14h。

[0156] ②取摇菌液4mL，加入到400mL的LB液体培养基(Kana+)中扩大培养，37℃、250r/min摇菌约2～3h，当菌液OD值为0.6～0.8时(此时细菌处于对数增长期)，加入1mol/L的IPTG诱导剂至终浓度为0.1mmol/L，继续摇菌8h。

[0157] ③9000×g离心10min，弃上清，收集菌体，将菌体用20ml裂解液重悬。

[0158] ④加入20μL蛋白酶抑制剂(PMSF)后，将重悬后的菌液的离心管置于碎冰中，用超声粉碎仪进行超声裂解细菌(400W，超声4s，间隔7s，超声100次)。超声结束后，14000×g，4℃离心5min，分别收集上清与沉淀，上清吸取至新的离心管中，沉淀用10mL PBS重悬。上清、沉淀各取50μL到1.5mL EP管中，各加入10μL 6×Protein Loading buffer，混匀后沸水煮10min，保存于‑20℃以备检测。

[0159] (2)细菌总蛋白的SDS‑PAGE电泳

[0160] ①胶模固定：将两块洗净吹干的玻璃板对齐夹好。将胶条装入电泳槽固定好。加水进行5min检漏。

[0161] ②制备分离胶：按分离胶配制方法配好10％分离胶，用1ml微量移液器缓慢注入胶模中，离梳子下缘1cm处(占玻璃板的2/3)停止操作，沿玻璃板壁轻轻加一层去离子水层，室温下聚合40min。

[0162] ③待聚合完成后，分离胶上层呈一直线，垂直倒去上方的去离子水，用滤纸吸去残留的水分，然后按浓缩胶配制方法加入5％的浓缩胶，插入样品梳子，注意避免气泡出现，把凝胶垂直放置于室温下等待聚合。

[0163] ④室温30min后即可聚合完成，小心拔下梳子，将凝胶固定放置在电泳装置中，加入蛋白电泳缓冲液。

[0164] ⑤将蛋白Marker2510和煮沸过的样品按顺序上样。

[0165] ⑥电泳：80V电压，电泳30min。当样品迁移到上层浓缩胶与下层分离胶的分界处，将电压调至110V，继续电泳2h左右。当溴酚蓝迁移到下层分离胶底边时，停止电泳。打开电泳装置，卸下玻璃板，用剥胶板小心剥下凝胶，切去浓缩胶，把分离胶用考马斯亮蓝染液进行染色。

[0166] ⑦将分离胶置于含考马斯亮蓝染液的盒子中室温缓慢摇动30min进行染色。

[0167] ⑧弃去染色液后，加入快脱液，继续缓慢摇动15min。倒掉脱色液，再加入新的快脱液，继续缓慢摇动15min，最后倒入慢脱液，室温摇床过夜，直到脱色完成。

[0168] ⑨观察诱导表达的结果并拍照，结果如图3所示。从图3可以看出，FtsH1蛋白主要以包涵体形式存在于裂解后的沉淀中，蛋白大小约为38kD，经变性后，存在于变性后的上清中。

[0169] (3)FtsH1蛋白的纯化

[0170] ①配制各种缓冲液：包涵体洗涤液，包涵体裂解液，包涵体变性液，复性液，1×Wash buffer，1×Elution buffer，其中1×Wash buffer pH值为6.5，1×Elution buffer pH值为4.5，复性液分别含有4mol/L，2mol/L，1mol/L，0mol/L尿素。

[0171] ②将裂解后的沉淀用20mL包涵体洗涤液重悬后，用超声粉碎仪进行超声(400W，超声4s，间隔7s，超声50次)，9000×g，4℃离心10min，弃上清，重复上述操作一次。

[0172] ③将洗涤2次后的沉淀加入10mL变性液，置于室温摇床孵育2小时，使包涵体变性溶解，9000×g离心10min后，取上清。

[0173] ④将变性后上清与1ml珠子(珠子提前离心5000×g，1min，除去乙醇)共同孵育，4℃摇床3h。

[0174] ⑤上柱：将孵育好的珠子结合至Ni柱上，收集流穿液。

[0175] ⑥洗脱：8ml 1×Wash buffer洗脱一次。

[0176] ⑦过柱：依次用1ml 1×Elution buffer洗脱8次，分别标记为过柱1‑8。

[0177] ⑧SDS‑PAGE和考马斯亮蓝染色检测洗脱蛋白的结果，结果如图4所示。

[0178] ⑨洗脱结束后，加入去离子水清洗Ni柱后再加入5ml 20％乙醇，柱子内剩3ml后塞上塞子，用封口膜封口，放置4℃冰箱，以备下次使用。

[0179] (4)FtsH1蛋白的复性

[0180] ①根据洗脱蛋白的结果，将条带浓的蛋白加入透析袋中(透析袋提前检漏)，两端用夹子夹紧。在大烧杯底部放入磁力小珠，倒入2L复性液(Urea 4mol/L pH＝8.0)，使透析袋在4℃冰箱中缓慢旋转复性过夜。

[0181] ②次日回收复性液，烧杯洗净后，倒入2L复性液(Urea 2mol/L pH＝8.0)，同时以2mmol/L：0.2mmol/L的比例加入还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽以及0.7mLβ‑巯基乙醇，烧杯用保鲜膜包紧后，将蛋白透析复性6‑8h。

[0182] ③回收复性液，烧杯洗净后，倒入2L复性液(Urea 1mol/L pH＝8.0)，同时以2mmol/L：0.2mmol/L的比例加入还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽以及0.7mLβ‑巯基乙醇，烧杯用保鲜膜包紧后，将蛋白透析复性过夜。

[0183] ④第二日回收复性液，烧杯洗净后，再在烧杯中倒入2L复性液(Urea 1mol/L pH＝8.0)，此次不添加谷胱甘肽及β‑巯基乙醇，将蛋白透析复性6‑8h。

[0184] ⑤最后回收复性液，烧杯洗净后，再换2L复性液(Urea 0mol/L pH＝8.0)透析6‑8h。

[0185] ⑥回收复性的蛋白，SDS‑PAGE和考马斯亮蓝染色检测蛋白复性的结果，结果如图5所示。从图5中可以看出FtsH1蛋白复性成功。

[0186] 实施例3小鼠免疫和效价测定

[0187] (1)小鼠免疫

[0188] 选用6只6‑8周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫，2只作为对照组，4只作为免疫组。准备1mL的佐剂(第一次免疫为氟氏完全佐剂，第二次和第三次免疫为氟氏不完全佐剂)和1ml纯化的FtsH1蛋白，分别装入两个注射器中。用输液管连接两个注射器，封口膜将连接处包紧后，来回推拉注射器，充分乳化约20min，静置30min后，当水乳相充分混匀，不分离时即可进行皮下注射。固定小鼠后，用75％酒精棉球消毒注射部位皮肤，将皮肤提起形成褶皱，注射器针头刺入皱褶下，缓缓将500μL(20μg/只)乳化的蛋白分5次，每次100μL注入皮下，拔针时按压针刺部位，防止外漏。每两周进行一次免疫，每次免疫结束2周后，对小鼠进行剪尾采血，检测血清效价。取血清效价最高的小鼠，在细胞融合的前3天对小鼠腹腔注射100μl纯化的FtsH1蛋白(不加佐剂)，进行加强免疫。

[0189] (2)间接ELISA测小鼠血清抗体效价

[0190] ①抗原包被：将FtsH1蛋白用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH＝9.6)稀释至1μg/mL，以100μL/孔加入96孔板中，4℃冰箱包被过夜；次日，将96孔板从4℃冰箱内取出，甩尽板内液体，用1×PBST洗涤3次，每次洗涤3min。

[0191] ②封闭：每孔加入200μL 5％牛血清白蛋白(BSA)的封闭液，37℃封闭2h；甩尽板内液体，用1×PBST洗涤3次，每次洗涤3min。

[0192] ③加一抗：将收集的免疫小鼠血清以1：800的比例稀释，取1：800血清稀释液100μL加入96孔板A行的第1孔；在A行的第2到第11孔中分别加入100μL5％牛血清白蛋白(BSA)；取1：800血清稀释液100μL加入96孔板A行的第2孔，用移液枪来回打混匀后，吸取第2孔内100μL液体加入第3孔，吹打混匀后，吸取第3孔内100μL液体加入第4孔；重复以上步骤直至第8孔，此时稀释倍数为1：102400；实验设置两组复孔，同时设置FtsH1多抗作为阳性对照、SP2/
0细胞培养液作为阴性对照和5％牛血清白蛋白(BSA)作为空白对照；37℃孵育1h后，洗涤步骤如上。

[0193] ④加酶标二抗：每孔各加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG(1：5000稀释)，37℃孵育1h后，洗涤步骤如上。

[0194] ⑤显色：每孔各加入100μLTMB显色液，37℃避光10min。

[0195] ⑥终止：每孔各加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应；酶标仪在450nm处测定OD值。

[0196] ⑦结果：计算阳性血清OD值P与阴性血清OD值N之比，当P/N≥2.1时为阳性，当1.5≤P/N＜2.1时为可疑，当P/N＜1.5时为阴性，以P/N≥2.1的最高稀释度作为抗体效价。结果如图6所示。从图6看出随着小鼠免疫次数的增加，小鼠血清平均效价不断增加，在第3次免疫后达到1：102400。

[0197] 实施例4细胞融合和筛选

[0198] (1)细胞融合

[0199] ①收集小鼠脾细胞：将加强免疫的小鼠断颈处死，用75％酒精浸泡消毒后，在并冰盒上分离脾脏。用剪刀剪开皮肤和腹膜，使脾脏暴露，用小镊子夹住脾脏轻轻提起，小剪刀剪断结缔组织，将脾脏分离，置于200目的不锈钢筛网中，同时将筛网放置在装有无血清的1640培养基的细胞培养皿中，用5mL注射器针芯挤压脾脏(不能进行碾磨，防止细胞破碎)，充分压碎结束后，将其吸取到50mL的离心管中，1000×g离心10min，弃上清。

[0200] ②脾细胞用20mL无血清1640培养基重悬并计数。将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0离心后，用5mL 1640培养基重悬并计数，将脾细胞与SP2/0细胞按照10：1的比例混匀，1000×g离心7‑10min后弃上清。

[0201] ③轻弹离心管管底，使管底细胞松散。将离心管置于37℃水浴中，在1min内一边轻轻旋转离心管，一边一滴滴加入37℃预热的1mL50％PEG。静置90s后，在1min内加入1mL无抗无血清1640培养基，该步骤重复两次。再在离心管中2min内加入20mL无血清1640培养基，1000×g离心10min后，弃上清。

[0202] ④在离心管加入50mL 15％1640培养基重悬细胞，铺板到96孔板中，每孔100μL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。

[0203] ⑤次日补加每孔100μL含2×HAT的15％1640培养基，37℃，5％CO2培养箱中培养。

[0204] ⑥每隔两日用含1×HAT的15％1640培养基对孔中细胞进行半数换液，7‑10d后，换1×HT的15％1640培养基进行半数换液，孔中细胞长至1/3满时，可进行阳性克隆的筛选。

[0205] (2)采用间接ELISA进行筛选

[0206] ①抗原包被：将FtsH1蛋白用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH＝9.6)稀释至1μg/mL，以100μL/孔加入96孔板中，4℃冰箱包被过夜；次日，将96孔板从4℃冰箱内取出，甩尽板内液体，用1×PBST洗涤3次，每次洗涤3min。

[0207] ②封闭：每孔加入200μL 5％牛血清白蛋白(BSA)的封闭液，37℃封闭2h；洗涤步骤如上。

[0208] ③加一抗：收集长满1/3孔底的杂交瘤细胞上清，各取100μL加入到封闭好的96孔板中；实验设置两组复孔，另设FtsH1多抗作为阳性对照、SP2/0细胞培养液作为阴性对照和5％牛血清白蛋白(BSA)作为空白对照；37℃孵育1h后，洗涤步骤如上。

[0209] ④加酶标二抗：每孔各加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG(1：5000稀释)，37℃孵育1h后，洗涤步骤如上。

[0210] ⑤显色：每孔各加入100μLTMB显色液，37℃避光10min。

[0211] ⑥终止：每孔各加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应；酶标仪在450nm处测定OD值；待测样本孔的OD值与阴性对照孔的OD值之比大于2.1时，为阳性结果。

[0212] ⑦单克隆化：将阳性结果的杂交瘤细胞转移至6孔板中扩大培养，重复上述ELISA检测步骤后，选择阳性孔内的杂交瘤细胞转移至T25细胞培养瓶中进一步扩大培养，冻存原代细胞并进一步进行亚克隆；通过有限稀释法取100个阳性孔的细胞均匀铺板于96孔板，培养1‑2周后，重复上述ELISA检测步骤检测细胞上清，选择阳性结果的细胞在经过几轮有限稀释法筛选得到稳定分泌抗FtsH1抗体的单克隆细胞株。

[0213] 实施例5单克隆抗体的效价检测、亚型鉴定和纯化

[0214] (1)单克隆抗体的效价检测

[0215] ①抗原包被：将FtsH1蛋白用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH＝9.6)稀释至1μg/mL，以100μL/孔加入至96孔板中，4℃冰箱包被过夜；次日，将96孔板从4℃冰箱内取出，甩尽板内液体，用1×PBST洗涤3次，每次洗涤3min。

[0216] ②封闭：每孔加入200μL 5％牛血清白蛋白(BSA)的封闭液，37℃封闭2h；洗涤步骤如上。

[0217] ③加一抗：将收集的稳定分泌FtsH1单克隆抗体的两株杂交瘤细胞株上清以1：200的比例稀释，取1：200细胞上清稀释液100μL加入96孔板A行的第1孔；在A行的第2到第12孔中分别加入100μL5％牛血清白蛋白(BSA)；取1：200细胞上清稀释液100μL加入96孔板A行的第2孔，来回吹打混匀后，吸取第2孔内100μL液体加入第3孔，吹打混匀后，吸取第3孔内100μL液体加入第4孔；重复以上步骤直至第9孔，此时稀释倍数为1：102400；实验设置两组复孔，同时以FtsH1多抗作为阳性对照、SP2/0细胞培养液作为阴性对照和5％牛血清白蛋白(BSA)作为空白对照；37℃孵育1h后，洗涤步骤如上。

[0218] ④加酶标二抗：每孔各加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG(1：5000稀释)，37℃孵育1h后，洗涤步骤如上。

[0219] ⑤显色：每孔各加入100μLTMB显色液，37℃避光10min。

[0220] ⑥终止：每孔各加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应；酶标仪在450nm处测定OD值。

[0221] ⑦结果：计算阳性血清OD值P与阴性血清OD值N之比，当P/N≥2.1时为阳性，当1.5≤P/N＜2.1时为可疑，当P/N＜1.5时为阴性，以P/N≥2.1的最高稀释度作为抗体效价。结果如图7所示。从图7可以看出，实验共筛选得到2株FtsH1单克隆抗体的高效价细胞株，分别命名为1H3和5F7。利用间接ELISA测定抗体的效价，结果显示1H3与5F7效价均达到1：102400。

[0222] (2)抗体亚型鉴定

[0223] ①抗原包被：将收集到的抗FtsH1单克隆抗体用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH＝9.6)以1：50稀释比例100μL/孔加入至96孔板中，4℃冰箱包被过夜；次日，将96孔板从4℃冰箱内取出，甩尽板内液体，用1×PBST洗涤3次，每次洗涤3min。

[0224] ②封闭：每孔加入200μL 5％牛血清白蛋白(BSA)的封闭液，37℃封闭2h；洗涤步骤如上。

[0225] ③加一抗：按照试剂盒推荐稀释比例稀释兔抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM亚型的抗体；37℃孵育1h后，洗涤步骤如上。

[0226] ④加酶标二抗：每孔各加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG(1：5000稀释)，37℃孵育1h后，洗涤步骤如上。

[0227] ⑤显色：每孔各加入100μLTMB显色液，37℃避光10min。

[0228] ⑥终止：每孔各加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应；酶标仪在450nm处测定OD值。结果如图8所示。1H3株分泌IgG1亚型单克隆抗体，5F7株分泌IgG2b亚型单克隆抗体。

[0229] (3)抗体纯化

[0230] 取6只健康的6～8周龄的BALB/c鼠，每只腹腔注射液体石蜡500μL刺激小鼠腹水的产生。7‑10d后待小鼠腹部明显膨隆时，将扩大培养的杂交瘤细胞吹打下来，800×g离心6
5min，弃上清后，用PBS重悬混匀后，计数细胞并将细胞调至2×10/mL，每只小鼠腹腔注射
6
500μL，即1×10 个单克隆细胞。约10d后小鼠腹部明显膨大时收集小鼠腹水产生的抗体。4℃，10000×g离心10min，取上清，使用Protein G树脂纯化试剂盒纯化抗体，以SDS‑PAGE测定单克隆抗体的纯度，将抗体浓缩后，加入等比例体积的甘油混匀，置于‑20℃保存。

[0231] 实施例6抗FtsH1单克隆抗体CDR序列鉴定

[0232] 分别提取1H3株和5F7株杂交瘤细胞RNA，使用Tran One‑Step gDNA Removal and cDNA synthesis Super Mix试剂盒逆转录为cDNA。根据抗体轻链和重链的可变区设计15对通用引物见表5，分别进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增产物使用Gel Extraction Kit试剂盒进行切胶回收后，送测序，PCR产物琼脂糖凝胶电泳如结果如图9、10、11所示。图9、10结果为抗体轻重链扩增结果。M表示DNA marker 1000bp；泳道1表示轻链κ链‑3；泳道2表示轻链κ链‑4；泳道3表示轻链κ链‑5；泳道4表示轻链κ链‑6；泳道5表示轻链κ链‑6，8，9；泳道6表示轻链κ链‑14；泳道7表示轻链κ链‑19；泳道8表示轻链κ链‑20；泳道9表示轻链λ1/2；泳道10表示轻链λx；泳道11表示重链Cα；泳道12表示重链Cγ
2b；泳道13表示重链Cγ1‑2c；泳道14表示重链Cγ3；泳道15表示重链Cμ。图11为选用抗体轻链κ链引物，重链Cγ2b链引物对1H3的cDNA进行扩增，使用抗体轻链κ链‑4引物，重链Cγ3引物对5F7的cDNA进行扩增，1H3，5F7抗体轻链大小约为400bp，重链大小约为500bp，与预期相符，说明成功扩增出1H3、5F7单克隆抗体轻重链可变区。

[0233] 表5鼠源抗体轻链和重链的可变区通用引物序列

[0234]

[0235]

[0236] 常用的兼并碱基代码：R＝A,G；W＝A,T；S＝G,C；Y＝C,T；K＝G,T。

[0237] PCR反应体系见表6。

[0238] 表6 PCR反应体系

[0239]体系 体积
TransStartFastPfu FlyDNA Polymerase 0.5μL
2.5mMdNTPs 2μL
5×TransStartFastPfuFlyBuffer 5μL
F(正向引物)(10μM) 0.5μL
R(反向引物)(10μM) 0.5μL
单克隆杂交瘤细胞cDNA(模板) 1μL
ddH2O 15.5μL
总体积 25μL

[0240] PCR反应参数见表7。

[0241] 表7 PCR反应参数

[0242]

[0243] 1H3轻链碱基序列：AATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGCAGAAAGTCACCATAACCTGCAGTGCCATCTCAACTGTAAATTACATGGACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATGCAACATCCAAACTGGCTCTTGGAGTCCCTACTTGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGTGGCTGAAGATGCCACCTCTTATTTCTGTCATCAGTGGAGTAGTTACCCACCCATGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC(SEQ ID NO.8)；

[0244] 轻链氨基酸序列：IVLTQSPAIMSASPGQKVTITCSAISTVNYMDWYQQKPGSSPKLWIYATSKLALGVPTCFSGSGSGTSYSLTISSMVAEDATSYFCHQWSSYPPMDVRWRHQAGNQT(SEQ ID NO.9)。

[0245] 轻链的CDR氨基酸序列见表8。

[0246] 表8 1H3轻链的CDR氨基酸序列

[0247]

[0248] 1H3重链碱基序列：GTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGCTGAGGTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCAGTAGCAATTGGATAGAGTGGGTTAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTAGAAGCGGTAGTACTAATTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGTGTGATCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.10)；

[0249] 重链氨基酸序列：VQLQESGAEVMKPGASVKISCKATGYTFSSNWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPRSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCASVIWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.11)。

[0250] 重链的CDR氨基酸序列见表9。

[0251] 表9 1H3重链的CDR氨基酸序列

[0252]

[0253] 5F7轻链碱基序列：

[0254] AATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGCAGAAAGTCACCATAACCTGCAGTGCCATCTCAAGTATAAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATGCAACATCCAAACTGGCTCTTGGAGTCCCTGCTTGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGTGGCTGAAGATGCCACCTCTTATTTCTGTCATCAGTGGAGTAGTTACCCACCCATGGACGTTCGGTGGAGGCACCAACCTGGAAATCAAAC(SEQ ID NO.12)；

[0255] 轻链氨基酸序列：

[0256] IVLTQSPAIMSASPGQKVTITCSAISSINYMHWYQQKPGSSPKLWIYATSKLALGVPACFSGSGSGTSYSLTISSMVAEDATSYFCHQWSSYPPMDVRWRHQPGNQT(SEQ ID NO.13)。

[0257] 轻链的CDR氨基酸序列见表10。

[0258] 表10 5F7轻链的CDR氨基酸序列

[0259]

[0260] 5F7重链碱基序列：

[0261] GTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGCTGAGGTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCAGTAGCAATTGGATAGAGTGGGTTAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTAGAAGCGGTAGTACTAATTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGTGTGATCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.10)；

[0262] 重链氨基酸序列：

[0263] VQLQESGAEVMKPGASVKISCKATGYTFSSNWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPRSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCASVIWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.11)。

[0264] 重链的CDR氨基酸序列见表11。

[0265] 表11 5F7重链的CDR氨基酸序列

[0266]

[0267] 实施例7抗FtsH1单克隆抗体Western Blot鉴定

[0268] ①分别取50uL弓形虫ME49虫株未裂解蛋白及用弱裂解液裂解弓形虫ME49虫株10h裂解蛋白和用强裂解液裂解弓形虫ME49虫株30min裂解蛋白。

[0269] ②分别加入10uL 6×SDS‑PAGE protein loading buffer，振荡混匀后，100℃金属浴加热10min后上样，经10％SDS‑PAGE后再用Bio‑Rad电转移装置将蛋白转移至PVDF膜上。

[0270] ③37℃环境下用5％BSA(1×TBST稀释)封闭已转印好的PVDF膜2h后，用1×TBST洗膜4次，每次5min。

[0271] ④按1：1000稀释比例(5％BSA稀释)加入经纯化浓缩后的单克隆抗体，4℃摇床孵育过夜，用1×TBST洗膜4次，每次5min。

[0272] ⑤按1：5000稀释比例(5％BSA稀释)加入HRP标记的Goat anti mouse IgG，37℃孵育1.5h，用1×TBST洗膜4次，每次5min。

[0273] ⑥加入ECL显色液显影后，于ECL化学发光成像仪内成像，结果显示1H3株及5F7株的单克隆抗体在100～140kDa处可检测到特异性条带，且均可与弓形虫体内的顶质体FtsH1蛋白特异性结合，结果如图12所示。

[0274] 实施例8抗FtsH1单克隆抗体的免疫荧光鉴定

[0275] ①将HFF细胞接种到铺有爬片的两组12孔板中，待细胞长满后加入弓形虫ME49虫株进行侵染，于37℃，5％CO2培养箱培养24h后，待弓形虫入侵细胞后，用PBS洗涤3次。

[0276] ②加入甲醇固定液，37℃固定30min后，用PBS洗涤3次，每次5min。

[0277] ③加入0.5％Tritonx‑100透化液，室温静置透化20min后，用PBS洗涤3次，每次5min。

[0278] ④加入10％BSA(PBS稀释)，于37℃封闭2h后，用PBS洗涤3次，每次5min。

[0279] ⑤一组12孔板按1：100稀释比例(10％BSA稀释)加入经纯化浓缩后的FtsH1抗体及顶质体其他蛋白抗体cpn60，另一组12孔板按1：100稀释比例(10％BSA稀释)加入经纯化浓缩后的FtsH1抗体及按1：800稀释比例(10％BSA稀释)加入兔源抗弓形虫多抗sag1抗体，于4℃孵育过夜，用PBS洗涤3次，每次5min。

[0280] ⑥按1：1000稀释比例(10％BSA稀释)加入Alexa Fluor 594(红色荧光)标记的Goat anti mouse IgG和Alexa Fluor 488(绿色荧光)标记的Goat anti rabbit IgG，37℃避光孵育1h后，用PBS洗涤3次，每次5min。

[0281] ⑦取出爬片，用去离子水洗涤并风干后，用含有DAPI染料的封片剂将爬片封片在载玻片上，固定后，将其置于荧光显微镜下观察，结果显示1H3株及5F7株产生的FtsH1抗体均可与弓形虫体内的顶质体结合，观察红色荧光，其特异性较高。如图13、14所示。

[0282] 上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。