逆境胁迫诱导型启动子TIP1-6-pro及其表达载体构建方法与应用

摘要

本发明涉及农业生物技术领域，为解决可用于植物抗逆分子设计育种的启动子及功能基因较少的问题，本发明提出了一种逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro及其表达载体构建方法与应用，TIP1‑6‑pro核苷酸序列如SEQID NO：1所示，通过克隆获得一个菜用大豆启动子TIP1‑6‑pro的DNA片段，并对其功能进行验证，发现该启动子在整个幼苗植株中在干旱、高盐、ABA、MeJA条件下驱动目标基因表达，可应用于植物抗逆基因工程。

权利要求

1.一种逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro，其特征在于，所述的逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro，其特征在于，所述的逆境胁迫包括非生物胁迫、激素影响。

3.根据权利要求2所述的逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro，其特征在于，所述的非生物胁迫包括旱、盐胁迫，激素影响包括ABA、MeJA。

4.一种利用权利要求1‑3所述的逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro逆境胁迫诱导表达转入基因的转基因植物构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建所述逆境胁迫诱导型启动子的植物表达载体；

（2）将待逆境胁迫诱导表达的基因插入（1）植物表达载体中，由所述逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro启动表达；

（3）将（2）构建好的植物表达载体转化农杆菌；

（4）将（3）转化后的农杆菌侵染植物，获得逆境胁迫诱导表达转入基因的转基因植物；

所述的逆境胁迫包括非生物胁迫、激素影响；所述的非生物胁迫包括旱、盐胁迫，激素影响包括ABA、MeJ。

5.根据权利要求4所述的利用逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro逆境胁迫诱导表达转入基因的转基因植物构建方法，其特征在于，步骤（1）中载体骨架为pCAMBIA1391z质粒。

6.一种根据权利要求4或5所述的利用逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro逆境胁迫诱导表达转入基因的转基因植物构建方法在植物抗旱、抗盐上的应用，其特征在于，所述的植物包括菜用大豆、拟南芥。

说明书

逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro及其表达载体构建方法与

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro及其表达载体构建方法与应用。

背景技术

[0002] TIPs(tonoplast intrinsic proteins)是一类定位于液泡膜或液泡形成体上的水通道蛋白，由5个亲水环相连形成6个跨膜螺旋，介导水分等物质跨膜转运，在植物响应逆境胁迫中发挥积极作用。

[0003] 菜用大豆指采收鲜荚食用的大豆专用型品种，作为一类重要的豆类蔬菜食用。富含蛋白质、碳水化合物、维生素、异黄酮、皂苷、磷脂等，营养价值极高，活性成分丰富，市场前景广阔。近年频发的异常干旱气候和土地的盐碱化，严重影响了菜用大豆的生长、产量和品质。国内针对菜用大豆干旱等逆境胁迫的研究尚处起步阶段，可用于菜用大豆抗逆分子设计育种的启动子及功能基因并不多。

[0004] 启动子是功能基因的重要组成部分，控制基因转录的起始时间、空间和强度，受植物生长发育阶段、内外环境刺激以及激素水平调控。按其转录方式分为组成型、诱导型和组织特异性启动子。组成型启动子不受时间和空间限制，能高效启动外源基因在植物所有组织中持续稳定高表达，会造成资源浪费。诱导型和组织特异型启动子用于驱动目标基因在特定条件下特定组织内高效表达，可以有效地解决组成型启动子存在的问题，其开发利用为基因工程研究的热点。

[0005] 逆境胁迫诱导型启动子能够接受逆境条件下的诱导信号，进而特异启动目的基因表达，抵御外界环境胁迫。激素在植物逆境胁迫信号传导过程中发挥重要作用，调控植物生长、气孔开闭、光合作用、渗透调节物质及抗氧化酶积累等过程。挖掘菜用大豆逆境胁迫诱导型启动子，构建植物表达载体，用于驱动目标基因在逆境条件下高效表达，对于研究菜用大豆抗逆调控能力具有重要意义。

发明内容

[0006] 为解决可用于植物抗逆分子设计育种的启动子及功能基因较少的问题，本发明提出了一种逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro及其表达载体构建方法与应用，通过克隆获得一个菜用大豆启动子TIP1‑6‑pro的DNA片段，并对其功能进行验证，发现该启动子在整个幼苗植株中在干旱、高盐、ABA、MeJA条件下驱动目标基因表达，可应用于植物抗逆基因工程。

[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：一种逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro核苷酸序列如SEQID NO：1中第1‑1483位碱基序列所示。

[0008] 一种逆境胁迫诱导表达转入基因的转基因植物构建方法，包括以下步骤：

[0009] (1)构建所述逆境胁迫诱导型启动子的植物表达载体；

[0010] 作为优选，所述的载体骨架为pCAMBIA1391z质粒。

[0011] (2)将待逆境胁迫诱导表达的基因插入(1)植物表达载体中，由所述逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro启动表达；

[0012] 所述的逆境胁迫诱导表达的基因为GUS，该基因产物为GUS蛋白(β‑葡萄糖苷酸酶)；GUS蛋白相当稳定而不易降解，将被检材料用含有底物X‑Gluc的缓冲液浸泡，若组织细胞发生了GUS基因的转化，并表达出GUS蛋白，可使具有GUS活性的组织或细胞呈现蓝色，用肉眼或显微镜可以观察，且一定程度下染色深浅可反映GUS活性程度。因此利用GUS可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况，非常直观方便；

[0013] (3)将(2)构建好的植物表达载体转化农杆菌；

[0014] (4)将(3)转化后的农杆菌侵染植物，获得逆境胁迫诱导表达转入基因的转基因植物。

[0015] 上述所述的逆境胁迫包括非生物胁迫、激素影响，非生物胁迫具体包括干旱、高盐，激素影响包括ABA(脱落酸)、MeJA(茉莉酸甲酯)。ABA、MeJA都被称为应激激素或胁迫激素(stress hormone)，可以增加植物的抗旱性和抗盐性。

[0016] 本发明启动子TIP1‑6‑pro可以启动目标基因在整个幼苗植株尤其在维管组织、根毛、侧根中明显表达，在干旱、高盐等非生物胁迫、ABA、MeJA等激素条件下可以显著提高目标基因的表达水平，在植物抗逆基因工程育种中具有良好的应用价值。

[0017] 一种逆境胁迫诱导表达转入基因的转基因植物构建方法在植物抗旱、抗盐上的应用。即将幼苗植株种植在逆境胁迫的环境中，利用启动子TIP1‑6‑pro可以使导入目的基因在逆境胁迫环境下整个幼苗植株中稳定表达。

[0018] 所述的植株包括豆科植物、拟南芥；豆科植物优选为菜用大豆。

[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：启动子TIP1‑6‑pro可以启动目标基因在整个幼苗植株尤其在维管组织、根毛、侧根中明显表达，在干旱、高盐、ABA、MeJA条件下可以显著提高目标基因的表达水平，在植物抗逆基因工程育种中具有良好的应用价值。

附图说明

[0020] 图1为本发明TIP1‑6基因在不同处理条件下表达模式示意图；

[0021] 其中：A和B分别为PEG和NaCl非生物胁迫处理，C和D分别为ABA和MeJA激素处理；

[0022] 图2为本发明TIP1‑6‑pro启动子中非生物胁迫和激素应答元件分布示意图；

[0023] 图3为本发明TIP1‑6‑pro启动子GUS融合表达载体构建示意图；

[0024] 图4为本发明不同组织内TIP1‑6‑pro启动子转基因拟南芥GUS染色示意图；

[0025] 其中：A为幼苗地上部分染色结果，B为幼苗地下部分(主根和侧根)染色结果；

[0026] 图5为本发明不同浓度PEG和NaCl处理条件下TIP1‑6‑pro启动子转基因拟南芥GUS活性检测示意图；

[0027] 其中：A和C为GUS染色结果，B和D为GUS活性检测结果，星号表示处理植株与对照植株比较的显著差异(**p<0.01)；

[0028] 图6为本发明不同浓度ABA和MeJA处理条件下TIP1‑6‑pro启动子转基因拟南芥GUS活性检测示意图；

[0029] 其中，A和C为GUS染色结果，B和D为GUS活性检测结果，星号表示处理植株与对照植株比较的显著差异(**p<0.01)。

具体实施方式

[0030] 下面通过实施例和附图说明对本发明作进一步详细说明，实施例中所用原料均可市购或采用常规方法处理。

[0031] 引物列表如表1所示：

[0032] 表1：

[0033]

[0034] 注：下划线为限制性内切酶识别位点。

[0035] 实施例1

[0036] (1)材料处理：将菜用大豆(种质编号:GMLN012012017)种子播种于花盆(营养土:蛭石＝3:1)，放置光照培养箱，温度设置为22℃白天/20℃黑夜，光周期设置为16h光照/8h黑暗，相对湿度设置为60％。培养3周，从花盆中拔出，洗掉泥土，分别进行干旱(20wt％PEG6000)、高盐(250mM NaCl)、脱落酸(100μM ABA)、茉莉酸甲酯(100μM MeJA)溶液浸根处理，分别处理0h、0.5h、1.5h、6h、12h、24h，设置相同时间段清水浸根处理为试验对照，最后分别取整株幼苗并用锡箔纸包裹，置于液氮中速冻，保存于‑80℃超低温冰箱。

[0037] (2)基因表达模式分析：按照RNAprep Pure Plant Kit和FastQuant RT Kit(天根生化科技有限公司)说明书分别提取RNA并反转录合成cDNA。以菜用大豆cDNA为模板，以TIP1‑6F和TIP1‑6R为引物组合，对TIP‑6进行实时荧光定量PCR扩增，同时设置Actin基因作为内参，引物序列如表1中所示。

[0038] 荧光定量PCR(qRT‑PCR)采用Applied Biosystems StepOnePlusTMReal‑Time System进行PCR扩增。PCR反应条件设置为：95℃15min；95℃10s，52℃20s，72℃30s，40个循环。PCR反应体系为20μl，按照SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(天根生化科技有限公–ΔΔCt司)说明书进行。反应结束后分析引物溶解曲线和荧光值变化，采用2 方法分析mRNA表达量。

[0039] 结果显示：TIP1‑6基因对干旱、高盐、ABA、MeJA均有响应，在PEG和MeJA处理1.5h后表达量最高，在NaCl和ABA处理6.0h后表达量最高，如图1所示。

[0040] (3)启动子克隆及组成元件分析：按照快捷型植物基因组DNA提取系统(天根生化科技有限公司)的说明书提取DNA。以菜用大豆DNA为模板，利用高保真酶PrimeSTAR Max(TaKaRa)，以TIP1‑6‑proF和TIP1‑6‑proR为引物组合，引物序列如表1所示进行PCR扩增。PCR反应条件设置为：95℃3min；95℃30s，52℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min。PCR反应体系为20μl，按照高保真酶PrimeSTAR Max(TaKaRa)说明书进行。将PCR扩增片段用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa)进行片段回收，并连接进入克隆载体pEASY‑Blunt(全式金生物技术有限公司)，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。经筛选和测序比对后，将正确的菌液用质粒DNA提取试剂盒提取质粒，‑80℃保存备用。利用在线软件PlantCARE(http://
bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对启动子序列所含非生物胁迫和激素信号顺式作用元件进行分析。

[0041] 结果显示：自‑1483位至‑1位所示的DNA分子即为如序列1所示的启动子TIP1‑6‑pro的核苷酸序列，包含干旱及多种激素应答元件，具体由1个MBS(干旱)、5个ABRE(脱落酸)、2个CGTCA‑motif(茉莉酸)、2个TGACG‑motif(茉莉酸)、1个TCA‑element(水杨酸)、1个TGA‑element(生长素)、1个P box(赤霉素)、1个TATC box元件组成，如图2所示。

[0042] 实施例2

[0043] (1)启动子GUS基因融合表达载体构建：根据表达载体pCAMBIA1391z的限制性酶切位点(Pst I和Sma I)，利用高保真酶PrimeSTAR Max，以TIP1‑6‑proGUSF和TIP1‑6‑proGUSR为引物组合，如表1所示进行PCR扩增。将PCR扩增片段和pCAMBIA1391z载体同时进行双酶切(TaKaRa)，并将酶切过后的扩增片段和载体进行回收及连接(TaKaRa)，构建好的重组载体pCAMBIA1391z‑TIP1‑6‑pro进行测序。经测序比对后，将正确的菌液用质粒DNA提取试剂盒提取质粒，‑80℃保存备用。

[0044] 结果显示：pCAMBIA1391z载体限制性酶切位点Pst I和Sma I之间的序列被替换为图2中自‑1483位至‑1位所示的DNA分子，重组载体的GUS由TIP1‑6‑pro启动表达，如图3所示。

[0045] (2)拟南芥遗传转化植株获得：根据农杆菌介导的花序浸染法将重组载体pCAMBIA1391z‑TIP1‑6‑pro转化进入拟南芥，将收获的T1代转基因拟南芥种子消毒后播种于40mg/ml HYG(潮霉素)的MS培养基中，筛选抗性苗，移栽到土中。提取T1代抗性苗的DNA，以TIP1‑6‑proF和TIP1‑6‑proR为引物组合进行PCR扩增。同样方法，筛选获得T3代转基因拟南芥纯合株系。

[0046] 测试例1

[0047] 将转基因拟南芥植株浸泡于GUS染色液(0.1M磷酸缓冲液，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mM铁氰化钾，X‑Gluc 0.5mg/ml)中37℃恒温过夜处理12h后，用体积浓度70％乙醇脱色，利用体式显微镜观察GUS表达的分布情况并拍照，如图4所示。

[0048] 结果显示：TIP1‑6‑pro具有启动活性，转基因拟南芥幼苗包括根、茎、叶组织均检测到蓝色，尤其在维管组织、根毛、侧根中明显表达。

[0049] 测试例2

[0050] 转基因拟南芥植株非生物胁迫和激素处理：将获得的T3代转基因拟南芥种子播种在MS培养基，幼苗正常生长5天后，分别转移到不同浓度(PEG，NaCl，ABA，MeJA)的MS培养基处理培养5天，GUS染色拍照并测定GUS活性。GUS酶活测定方法主要参考Jefferson方法，该方法以4‑甲基伞形酮酰‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷酯(4‑MUG)为底物，GUS酶催化其水解为4‑甲基伞形酮(4‑MU)及β‑D葡萄糖醛酸。4‑MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。

[0051] PEG模拟干旱胁迫；NaCl模拟盐胁迫；ABA可以调节植物气孔开度，在缺水条件下，植物叶片中ABA的含量增多，引起气孔关闭，这是由于ABA促进钾离子、氯离子和苹果酸离子等外流，促进气孔关闭；MeJA可以调控植物气孔开闭和光合作用强度，促使植物体内渗透调节物质含量升高，调节植物抗氧化酶体系，减缓干旱、盐胁迫对植物造成的伤害。

[0052] 结果显示：如图5和图6所示，TIP1‑6‑pro是干旱、高盐、ABA、MeJA诱导型启动子，转基因拟南芥幼苗在不同浓度PEG、NaCl、ABA、MeJA处理后蓝色均加深，在2wt％PEG、50mM NaCl、25μM ABA、50μM MeJA处理后GUS活性最强。

[0053] 由上述测试例可知，本发明的一种逆境胁迫诱导表达转入基因的转基因植物构建方法在植物抗旱、抗盐上的应用，即逆境胁迫诱导型启动子TIP1‑6‑pro可以启动目标基因在干旱、高盐、ABA、MeJA条件下高效表达。