与山羊耐热性状相关的SNP标记与应用

摘要

本发明提供一种与山羊耐热性状相关的SNP标记与应用。所述SNP分子标记位于山羊第21号染色体第46330931bp处；所述位点上存在T/A碱基突变，与山羊耐热性状具有显著的相关性。本发明的SNP标记能够用于山羊分子标记辅助育种。本发明提供的分子标记不受山羊的年龄、性别等限制，可用于耐热山羊选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，大大加快了耐热山羊的育种进程。

权利要求

1.鉴定耐热山羊品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测山羊的基因组DNA；

2)以待测山羊的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO:1‑2所示的引物进行PCR扩增反应；

3)分析PCR扩增产物，检测PCR扩增产物第345bp处的基因型，鉴定基因型为AA的个体耐热性显著高于TA、TT基因型个体的耐热性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所用PCR扩增反应体系以50 μL计包括：50～100 ng/μL待测山羊的基因组DNA 1μL，10 pmol/μL正向引物和反向引物各1μL，

10 mmol/L dNTPs Mixture 1μL，1.25 U/25μL Taq DNA聚合酶1μL，2×PCR反应缓冲液25μL和余量的双蒸水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所用PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；55℃或60℃退火30s，72℃延伸1‑2min，共30‑35个循环；72℃保温2min。

4.检测分型与山羊耐热性状相关的SNP标记的试剂在鉴定及选育改良耐热山羊品种中的应用，所述SNP标记为SEQ ID NO:3所示序列第345bp处的T/A多态性，在该SNP位点的基因型为AA的个体的耐热性被鉴定为显著高于TA、TT基因型个体的耐热性，基因型为AA的个体用于耐热山羊品种选育。

5.检测分型与山羊耐热性状相关的SNP标记的试剂在山羊耐热性状早期预测中的应用，所述SNP标记为SEQ ID NO:3所示序列第345bp处的T/A多态性，在该SNP位点的基因型为AA的个体的耐热性被预测显著高于TA、TT基因型个体的耐热性。

说明书

与山羊耐热性状相关的SNP标记与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学及遗传育种领域，具体地说，涉及一种与山羊耐热性状相关的SNP标记与应用。

背景技术

[0002] SLC25A21基因是一个蛋白质编码基因，其编码的蛋白是溶质载体蛋白家族中的重要成员。该蛋白在线粒体载体转运C5‑C7C氧二羧酸盐通过线粒体内膜的过程中发挥重要作用。其转运的物质包括2‑氧代己二酸脂、2‑氧代戊二酸等，其中2‑氧代己二酸脂是哺乳动物赖氨酸、色氨酸和羟赖氨酸分解代谢的常见中间产物。该基因发生突变时，可能对哺乳动物体内的氨基酸代谢过程产生严重影响。在高温和低温环境下山羊群体中进行选择信号筛选，发现SLC25A21基因座位的多态性变异对山羊热适应性的影响达到显著水平。

[0003] 随着全球气温逐步升高和集约化养殖加剧，山羊对热环境的适应性问题逐渐成为规模化养殖场不得不面临的一项挑战。山羊处于极端的高温环境下，机体会出现热应激，进而在生理、泌乳、繁殖等环节给行业造成经济损失。山羊对热环境的适应性是一个复杂的生物过程，涉及到许多不同的生物过程和调节蛋白。近年来，分子遗传技术的飞速发展，使DNA分子标记技术在山羊遗传多样性研究中起着重要作用，为更好地开发和利用优良品种的优良经济特性及保护和合理的利用品种资源，有必要开发山羊特异的分子标记，应用于耐热性山羊的选育，并为耐热性山羊的分子育种提供一定的理论依据。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供与山羊耐热性状相关的SNP标记与应用。

[0005] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种与山羊耐热性状相关的SNP标记，所述SNP标记含有山羊如SEQ ID NO:3所示序列第345bp处的多态性为T/A的核苷酸序列。

[0006] 所述SNP标记位于山羊第21号染色体第46330931bp处；所述位点上存在T/A碱基突变，与山羊耐热性状具有显著的相关性；所述SNP标记基于山羊基因组序列信息版本号ASM170441v1，2016年8月。

[0007] 进一步地，所述SNP标记包含的多态性位点的基因型为AA的个体耐热性显著高于TA、TT基因型。

[0008] 第二方面，本发明提供用于检测所述SNP标记的引物，包括如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物。

[0009] 第三方面，本发明提供含有所述引物的检测试剂或试剂盒。

[0010] 进一步地，所述试剂盒还包括dNTP Mixture、TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。

[0011] 第四方面，本发明提供鉴定或选育耐热山羊品种的方法，包括以下步骤：

[0012] 1)提取待测山羊的基因组DNA；

[0013] 2)以待测山羊的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO:1‑2所示的引物进行PCR扩增反应；

[0014] 3)分析PCR扩增产物。

[0015] 优选地，步骤2)中所用PCR扩增反应体系以50μl计包括：50～100ng/μl待测山羊的基因组DNA 1μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各1μl，10mmol/L dNTPs Mixture1μl，1.25U/25μl TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶1μl，2×PCR反应缓冲液25μl和余量的双蒸水。

[0016] 优选地，PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃或60℃退火30s，72℃延伸1‑2min，共30‑35个循环；72℃保温2min。步骤3)包括：检测PCR扩增产物第
345bp处的基因型，基因型为AA的个体耐热性显著高于TA、TT基因型。

[0017] 优选地，可利用sanger测序方法来检测待测山羊的基因型。

[0018] 第五方面，本发明提供所述SNP标记、用于检测所述SNP标记的引物或含有引物的所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

[0019] (1)用于耐热山羊品种的鉴定及改良；

[0020] (2)用于山羊耐热性状早期预测；

[0021] (3)用于与山羊耐热性状相关的分子标记辅助育种。

[0022] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

[0023] 本发明提供一种与山羊耐热性状相关的SNP标记，所述SNP分子标记位于山羊第21号染色体第46330931bp处；所述位点上存在T/A碱基突变，与山羊耐热性状具有显著的相关性，并针对该位点设计检测引物。本发明的SNP标记能够用于山羊分子标记辅助育种。本发明提供的分子标记不受山羊的年龄、性别等限制，可用于耐热山羊选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，大大加快了耐热山羊的育种进程。

附图说明

[0024] 图1为本发明较佳实施例中三种基因型测序峰图；其中，(a)为AA型；(b)为TA型；(c)为TT型。

[0025] 图2为本发明较佳实施例中SNP位点的山羊扩大群体验证结果。

具体实施方式

[0026] 本发明提供一种与山羊耐热性状相关的SNP标记，所述SNP分子标记位于山羊第21号染色体第46330931bp处；所述位点上存在T/A碱基突变，与山羊耐热性状具有显著的相关性，该基因存在AA、TA和TT三种基因型，AA基因型的个体耐热性显著高于TA基因型以及TT基因型；所述SNP分子标记基于山羊基因组序列信息版本号ASM170441v1，2016年8月。

[0027] 本发明中，在山羊第21号染色体第46330931bp位点，等位基因A在热环境山羊中的频率高达81.25％，而在常温环境山羊中频率只有19.33％。对于通过基因型区分和筛选出耐热性状的山羊具有较大的指导意义，能够提高耐热山羊筛选的准确率和效率。

[0028] 本发明还提供用于检测所述SNP标记的特异性引物，包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列为：5’‑TCGGGAGACAGTGAAGGAAG‑3’(SEQ ID NO:1)；所述反向引物的核苷酸序列为：5’‑TCCCATGTCCACCTAACACC‑3’(SEQ ID NO:2)。

[0029] 本发明还提供一种用于检测所述SNP标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对。

[0030] 优选地，所述试剂盒还包括dNTP Mixture、TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。

[0031] 更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板；所述标准阳性模板的基因型为AA；所述标准阳性模板DNA作为阳性对照，增加所述SNP标记检测的准确性。

[0032] 本发明还提供一种用于检测所述SNP标记的方法，包括以下步骤：

[0033] 1)提取待测山羊的基因组DNA；

[0034] 2)以待测山羊的基因组DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；

[0035] 3)检测所述PCR扩增产物的第345bp处的基因型，得到SNP位点的基因型。

[0036] 本发明首先提取待测山羊的基因组DNA；对于提取待测山羊的基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。

[0037] 得到待测山羊的基因组DNA后，本发明以待测山羊的基因组DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物。

[0038] 优选地，PCR扩增反应的体系以50μl计包括以下组分：待测山羊的基因组DNA 1μl，正向引物和反向引物各1μl，dNTP Mixture 1μl，1.25U/25μl TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶1μl，2×PCR反应缓冲液25μl和余量的双蒸水。

[0039] 其中，所述待测山羊的基因组DNA的浓度优选为50～100ng/μl，进一步优选为60～80ng/μl；所述正向引物和反向引物的浓度分别优选为10pmol/μl；所述dNTPs的浓度优选为
10mmol/L。

[0040] 优选地，PCR扩增反应的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃或60℃退火30s，72℃延伸1‑2min，共30‑35个循环；72℃保温2min。

[0041] 得到PCR扩增产物后，检测所述PCR扩增产物的第345bp处的基因型，得到所述SNP位点的基因型。

[0042] 本发明对于检测PCR扩增产物的基因型的方法没有特别的限制，利用本领域常规的基因型检测方法即可。在本发明的具体实施方式中，利用sanger测序方法来检测待测山羊的基因型。

[0043] 本发明的检测方法具有准确可靠，操作简便的优势。

[0044] 本发明还提供所述SNP标记或所述引物对或所述试剂盒在山羊分子标记辅助育种中的应用。本发明所述的SNP标记或所述引物对或所述试剂盒能够与其他用于中国山羊表型检测的特异性引物或试剂盒相结合用于中国山羊分类和育种研究。

[0045] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0046] 实施例1山羊SLC25A21基因多态性位点的鉴定

[0047] 1、提取待测中国山羊组织中的基因组DNA

[0048] 采集13只高温环境(年平均温度TMP≥20℃)下的山羊(其中包括9只海南黑山羊、4只雷州山羊)、32只常温环境(10℃≤TMP<20℃)下的山羊(其中包括10只广丰山羊、8只长江三角洲白山羊、9只圭山山羊、5只赣西黑山羊)、61只低温环境(0℃≤TMP<10℃)下的山羊(其中包括11只阿尔巴斯型绒山羊、10只辽宁绒山羊、9只中卫山羊、8只南疆山羊、9只乌珠穆沁白绒山羊、5只青格达山羊和9只柴达木绒山羊)和28只极低温环境(TMP<0℃)下的山羊(其中包括9只柴达木山羊、8只西藏日土绒山羊和11只西藏班戈绒山羊)的组织样，采用磁珠法提取组织中的基因组DNA。

[0049] 2、扩增含SNP位点的核苷酸片段

[0050] 根据NCBI数据库收录的SLC25A21基因座位的序列设计引物，包括正向引物F：5’‑TCGGGAGACAGTGAAGGAAG‑3’(SEQ ID NO:1)；和反向引物R：5’‑TCCCATGTCCACCTAACACC‑3’(SEQ ID NO:2)，以步骤1中的基因组DNA为模板，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段。

[0051] 该SNP位点位于PCR扩增片段(SEQ ID NO:3)的345bp处，此处碱基为T或A。

[0052] 其中PCR反应使用的扩增体系以50μl计为：100ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各1μl，10mmol/L dNTP Mixture 1μl，1.25U/25μl TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶1μl，2×PCR反应缓冲液25μl，余量为双蒸水。

[0053] 其中PCR反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃或60℃退火30s，72℃延伸1‑2min，共30‑35个循环；72℃保温2min。

[0054] 3、检测PCR扩增片段，获得SNP标记

[0055] 对步骤2中的PCR扩增产物进行测序检测，所述PCR扩增产物的第345bp处的基因型为所述SNP位点的基因型。三种基因型的测序峰图如图1所示。

[0056] 实施例2对239只山羊的SLC25A21基因座位的多态性位点进行扩大群体分析[0057] 1、利用T检验对来自不同地区的239只山羊(表1)进行检验分析，上述SNP位点在高温环境下山羊中的等位基因A的频率极显著高于在常温(P<0.01)、低温(P<0.01)和极低温(P<0.01)环境下山羊中的等位基因T的频率；而在常温环境与低温环境和极低温环境下山羊之间，等位基因A的频率没有显著差异(P>0.01)。验证了该处SNP位点的等位基因A与山羊耐热性状的相关性。

[0058] 2、利用Pearson相关性检验对所有群体中多态性位点的基因型频率和年平均温度进行相关性检验分析。在所有群体中，上述SNP位点AA基因型的频率与年平均温度(TMP，℃)间存在极显著的相关性(Pearson’s r＝0.7926，P<0.001)。进一步验证了该处SNP位点的等位基因A与山羊耐热性状的相关性。由表1和图2可以看出，AA是耐热型山羊品种的优势基因型，而TA和TT是常温环境山羊品种中的基因型。

[0059] 表1SNP位点在不同温度环境下山羊品种中的基因型频率

[0060]

[0061]

[0062] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。