一种与山羊耐热性状相关的SNP标记及其检测方法和应用

摘要

本发明涉及分子标记技术领域，具体公开了一种与山羊耐热性状相关的SNP标记及其检测方法和应用。本发明的SNP分子标记位于山羊第4号染色体第53175525bp位点；所述位点上存在T/C碱基突变，与山羊耐热性状具有显著的相关性。本发明的SNP标记能够用于山羊分子标记辅助育种。本发明提供的分子标记不受山羊的年龄、性别等限制，能够用于耐热山羊选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，能够显著促进耐热性山羊选育的育种进程。

权利要求

1.鉴定或选育耐热山羊品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测山羊的基因组DNA；

2)以待测山羊的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO:1‑2所示的引物进行PCR扩增反应，扩增出待测SNP分子标记所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO.3所示；所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.3所示序列的第373位，其多态性形式为T/C；

3)检测所述SNP分子标记的多态性位点的基因型，当所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为CC时，对应于山羊耐热性高，当所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为TC或TT时，对应于山羊耐热性低。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所用PCR扩增反应体系以50μl计包括：50～100ng/μl待测山羊的基因组DNA 1μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各1μl，

10mmol/L dNTPs Mixture 1μl，1.25U/25μl TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶1μl，2×PCR反应缓冲液25μl和余量的双蒸水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所用PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃或60℃退火30s，72℃延伸1‑2min，共30‑35个循环；72℃保温

2min。

4.SNP分子标记、引物组或试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)用于耐热山羊品种的鉴定及改良；

(2)用于山羊耐热性状早期预测；

(3)用于与山羊耐热性状相关的分子标记辅助育种；

所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.3所示序列的第373位，其多态性形式为T/C；当所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为CC时，对应于山羊耐热性高，当所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为TC或TT时，对应于山羊耐热性低；

所述引物组为用于扩增所述SNP分子标记的引物组；

所述试剂或试剂盒为含有所述引物组的试剂或试剂盒。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物组包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs Mixture、TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。

说明书

一种与山羊耐热性状相关的SNP标记及其检测方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子标记技术领域，具体地说，涉及一种与山羊耐热性状相关的SNP标记及其检测方法和应用。

背景技术

[0002] CPVL基因编码的蛋白是羧肽酶，与丝氨酸羧肽酶有着很强的序列相似性。羧肽酶是一大类蛋白酶，其作用是从蛋白质或肽段的羧基末端切割单个氨基酸。该蛋白可能参与溶酶体中吞噬性颗粒的消化过程，参与炎症蛋白酶级联反应，以及修剪肽段以呈递抗原。当该基因发生突变时，可能影响哺乳动物体内的免疫反应过程。

[0003] 随着气温逐步升高和集约化养殖加剧，山羊对热环境的适应性问题逐渐成为规模化养殖场不得不面临的一项挑战。山羊处于极端的高温环境下，机体会出现热应激，进而在生理、泌乳、繁殖等环节给行业造成损失。山羊对热环境的适应性是一个复杂的生物过程，涉及到许多不同的生物过程和调节蛋白。近年来，分子遗传技术的飞速发展，使DNA 分子标记技术在山羊遗传多样性研究中起着重要作用，为更好地开发和利用优良品种的优良经济特性及保护和合理的利用品种资源。因此有必要开发山羊特异的分子标记，应用于耐热性山羊的选育，并为耐热性山羊的分子育种提供一定的理论依据。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种与山羊耐热性状相关的SNP标记及其检测方法和应用。

[0005] 具体地，本发明的技术方案如下：

[0006] 本发明提供一种与山羊耐热性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.3所示序列的第373位，其多态性形式为T/C。

[0007] 本发明中，当所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为CC时，对应于山羊耐热性高，当所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为TC或TT时，对应于山羊耐热性低。

[0008] 本发明在高温和低温环境下山羊群体中进行选择信号筛选，发现CPVL基因座位的多态性变异对山羊热适应性的影响达到显著水平。所述SNP分子标记位于山羊第4号染色体第53175525bp位点；所述位点上存在T/C碱基突变，与山羊耐热性状具有显著的相关性；该基因存在CC、TC和TT三种基因型，CC基因型的个体耐热性显著高于TC基因型以及TT基因型；所述SNP分子标记基于山羊基因组序列信息版本号ASM170441v1，2016年8月。

[0009] 在本发明中，在山羊第4号染色体第53175525bp位点，等位基因C在热环境山羊中的频率高达61.20％，而在常温、低温和极低温环境山羊中的频率只有8.83％。对于通过基因型区分和筛选出山羊耐热性状的山羊具有较大的指导意义，能够提高耐热山羊筛选的准确率和效率。

[0010] 本发明还提供用于扩增上述SNP分子标记的引物组。

[0011] 优选，所述引物组包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’‑GGCATCCGACTCCTTCCAAT‑3’；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5’‑CCCCAGGTTGATTGTGAGAA‑3’。

[0012] 本发明另提供含有上述引物组的试剂或试剂盒。

[0013] 所述试剂盒还包括dNTPs Mixture、TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液以及标准阳性模板中的至少一种。

[0014] 所述标准阳性模板的基因型为CC；所述标准阳性模板DNA作为阳性对照，增加所述SNP位点检测的准确性。

[0015] 本发明还提供一种鉴定或选育耐热山羊品种的方法，其包括以下步骤：

[0016] 1)提取待测山羊的基因组DNA；

[0017] 2)以待测山羊的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO:1‑2所示的引物进行PCR扩增反应；

[0018] 3)分析PCR扩增产物。

[0019] 本发明的方法步骤2)中所用PCR扩增反应体系以50μl计包括：50～100ng/μl待测山羊的基因组DNA1μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各1μl，10mmol/L dNTPs Mixture 1μl，1.25U/25μl TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶1μl，2×PCR反应缓冲液25μl和余量的双蒸水。

[0020] 优选，本发明的方法步骤2)中所用PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃或60℃退火30s，72℃延伸1‑2min，共30‑35个循环；72℃保温2min。

[0021] 本发明的方法步骤3)包括：检测PCR扩增产物第373bp处的基因型，基因型为CC的个体耐热性显著高于TC、TT基因型。

[0022] 本发明对所述提取待鉴定山羊的基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。本发明对于检测PCR扩增产物的基因型的方法没有特别的限制，利用本领域常规的基因型检测方法即可。本发明具体实施过程中，利用sanger测序方法来检测待测山羊的基因型。

[0023] 本发明的方法具有准确可靠，操作简便的优势。

[0024] 本发明还提供上述SNP分子标记或引物组或试剂或试剂盒的以下任一应用：

[0025] (1)用于耐热山羊品种的鉴定及改良；

[0026] (2)用于山羊耐热性状早期预测；

[0027] (3)用于与山羊耐热性状相关的分子标记辅助育种。

[0028] 本发明所述的SNP分子标记或者所述引物组或者所述试剂或试剂盒能够与其他用于中国山羊表型检测的特异性引物或者试剂或试剂盒相结合用于中国山羊分类和育种研究。

[0029] 本发明的有益效果至少在于：

[0030] 本发明提供了一种与山羊耐热性状相关的SNP标记，所述SNP分子标记位于山羊第4号染色体第53175525bp位点；所述位点上存在T/C碱基突变，与山羊耐热性状具有显著的相关性。本发明的SNP标记能够用于山羊分子标记辅助育种。本发明提供的分子标记不受山羊的年龄、性别等限制，能够用于耐热山羊选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，能够显著促进耐热型山羊选育的育种进程。

附图说明

[0031] 图1为本发明较佳实施例中三种基因型测序峰图；其中，(a)为TT型；(b)为TC型；(c)为CC型；

[0032] 图2为本发明较佳实施例中SNP位点的山羊扩大群体验证结果。

具体实施方式

[0033] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0034] 下述实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。

[0035] 实施例1山羊CPVL基因多态性位点的鉴定

[0036] 1.1提取待测中国山羊组织中的基因组DNA

[0037] 选取9只热环境(年平均温度TMP≥20℃)下的山羊(其中包括9只都安山羊)；23只常温环境(10℃≤TMP<20℃)下的山羊(其中包括9只贵州黑山羊、5只崂山奶山羊、9只徐淮山羊)；32只低温环境(0℃≤TMP<10℃)下的山羊(其中包括8只河西绒山羊、10只辽宁绒山羊、3只阿拉善型绒山羊、11只阿尔巴斯型绒山羊)；25只极低温环境(TMP<0℃)下的山羊(其中包括8只西藏阿里绒山羊、8只西藏日土绒山羊、9只柴达木山羊)。采集上述山羊个体组织样，采用磁珠法提取组织中的基因组DNA。

[0038] 1.2扩增含SNP位点的核苷酸片段

[0039] 根据NCBI数据库收录的CPVL基因座位的序列设计引物，包括正向引物F：5’‑GGCATCCGACTCCTTCCAAT‑3’，如SEQ  ID  NO.1所示；和反向引物R：5’‑CCCCAGGTTGATTGTGAGAA‑3’，SEQ ID NO.2所示，以1.1中的基因组DNA为模板，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO.3所示。

[0040] 该SNP位点位于PCR扩增片段(SEQ ID NO.3所示)的373bp处，此处碱基为T或C。

[0041] 其中PCR反应使用的扩增体系以50μl计为：100ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各1μl，10mmol/L dNTPs Mixture1μl，1.25U/25μl TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶1μl，2×PCR反应缓冲液25μl，余量为双蒸水。

[0042] 其中PCR反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃或60℃退火30s，72℃延伸1‑2min，共30‑35个循环；72℃保温2min。

[0043] 1.3检测PCR扩增片段，获得SNP标记

[0044] 对1.2中的PCR扩增产物进行测序检测，所述PCR扩增产物的第373bp处的基因型为所述SNP位点的基因型。三种基因型的测序峰图如图1所示。

[0045] 实施例2对223只山羊的CPVL基因座位的多态性位点进行扩大群体分析[0046] 1、利用T检验对来自不同地区的223只山羊(表1)进行检验分析，上述SNP位点在高温环境下山羊中的等位基因C的频率显著高于在常温(P<0.05)、极显著高于低温(P<0.01)和极低温(P<0.01)环境下山羊中的等位基因T的频率。验证了该处SNP位点的等位基因C与山羊耐热性状的相关性。

[0047] 2、利用Pearson相关性检验对所有群体中多态性位点的基因型频率和年平均温度进行相关性检验分析。在所有群体中，上述SNP位点CC基因型的频率与年平均温度(TMP，℃)间存在极显著的相关性(Pearson’s r＝0.7254，P<0.001)(图2)。进一步验证了该处SNP位点的等位基因C与山羊耐热性状的相关性。由表1和图2可以看出CC是耐热型山羊品种的优势基因型，而TC和TT是常温、低温和极低温环境山羊品种中的优势基因型。

[0048] 表1 SNP位点在不同温度环境下山羊品种中的基因型频率

[0049]

[0050]

[0051] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。