一种牛传染性鼻气管炎病毒的快速定量检测方法

摘要

本发明涉及牛传染性鼻气管炎病毒的检测，具体涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的快速定量检测方法。本发明提供用于检测IBRV的荧光微球免疫层析试纸条，包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包被有荧光微球标记的IBRV多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上设有检测线，所述检测线上包被有IBRV单克隆抗体，所述IBRV单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.45040的杂交瘤细胞分泌。该试纸条可对感染牛的眼鼻分泌物、精液以及阴道分泌物中的IBRV进行定性或定量检测，具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确性高、检测速度快的优点，整个检测在15min内即可完成。

权利要求

1.用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的荧光微球免疫层析试纸条，包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫上包被有荧光微球标记的牛传染性鼻气管炎病毒多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上设有检测线，所述检测线上包被有牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体，所述牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.45040的杂交瘤细胞分泌。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球标记的牛传染性鼻气管炎病毒多克隆抗体中，荧光微球与牛传染性鼻气管炎病毒多克隆抗体的质量比为8:1 15:1。

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3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的包被浓度为450 550μg/mL。

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4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述结合垫上还包被有荧光微球标记的鸡IgY；所述硝酸纤维素膜上还设有与所述检测线间隔一定距离的质控线，所述质控线上包被有羊抗鸡IgY抗体。

5.根据权利要求4所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球标记的鸡IgY中，荧光微球与鸡IgY的质量比为8:1 15:1；所述羊抗鸡IgY抗体的包被浓度为500 650 μg/mL。

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6.制备权利要求1‑5任一所述的试纸条的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将荧光微球标记的牛传染性鼻气管炎病毒多克隆抗体包被于玻璃纤维素膜上，得到结合垫；

（2）用权利要求1中所述的牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体在硝酸纤维素膜上进行划线包被，得到检测线；

（3）将样品垫、步骤（1）得到的结合垫、步骤（2）得到的硝酸纤维素膜、吸水垫沿层析方向依次搭接粘贴在底板上。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光微球标记的牛传染性鼻气管炎病毒多克隆抗体中，荧光微球与牛传染性鼻气管炎病毒多克隆抗体的质量比为8:1 15:1。

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8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的包被浓度为450 550 μg/mL。

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9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）还包括将荧光微球标记的鸡IgY包被于所述玻璃纤维素膜上；所述步骤（2）还包括用羊抗鸡IgY抗体在所述硝酸纤维素膜上与所述检测线间隔一定距离进行划线包被，得到质控线。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述荧光微球标记的鸡IgY中，荧光微球与鸡IgY的质量比为8:1 15:1；所述羊抗鸡IgY抗体的包被浓度为500 650 μg/mL。

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说明书

一种牛传染性鼻气管炎病毒的快速定量检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及牛传染性鼻气管炎病毒的检测，具体涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的快速定量检测方法。

背景技术

[0002] 牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV）又名牛疱疹病毒Ⅰ型（Bovine herpesvirus‑1, BHV‑1），属疱疹病毒科，是牛的一种重要的病原，可引起牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR）。牛传染性鼻气管炎是一种热性、急性且潜伏性极强的传染病。自1995年Miller首次在美国报道该病以来，IBR已呈现出全球性流行的态势，这给世界养牛业造成了巨大的经济损失。IBRV的主要危害性在于病毒在侵入宿主后，可潜伏感染于宿主的三叉神经节中，当机体抵抗力弱或受到应激因素刺激，病毒会被激活、增殖并向环境中释放，导致该病在牛群中传播，给该病的防控带来了巨大的挑战。鉴于其危害性，世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类传染病，我国亦将其列为二类传染病。病原诊断是评估免疫效果、监测牛群健康与传染病流行的必要手段。

[0003] 为有效防控牛传染性鼻气管炎，现已开发出多种IBRV诊断技术，主要可概括为病原学诊断和血清学检测。血清学检测技术用于检测IBRV抗体，包括中和试验和ELISA等。而IBRV病原诊断方法主要是病毒分离与实时荧光PCR法，此类方法特异性高，但是存在操作复杂，需要一定的检测设备、时间以及高水平的检验人员进行操作等缺点，无法在奶牛场进行快速诊断。免疫层析技术具备操作简便、快速、灵敏、特异等特点，非常适合养殖场和检疫部门使用，被广泛应用于临床样品的检测中。

[0004] 荧光微球标记的免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线（包被抗体或抗原）和质控线（抗抗体）的条状纤维层析材料为固定相，样品液为流动相，荧光微球标记抗体或抗原固定于结合垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原，例如蛋白、病毒、致病菌等，通常采用双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心。目前，还未见到用于检测IBRV的荧光微球标记的免疫层析试纸条的相关报道。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是实现牛传染性鼻气管炎病毒的快速定性和定量检测。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测IBRV的荧光微球免疫层析试纸条，包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包被有荧光微球标记的IBRV多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上设有检测线，所述检测线上包被有IBRV单克隆抗体，所述单克隆抗体的名称为1C2，由保藏编号为CGMCC No. 45040的杂交瘤细胞分泌。

[0007] 上述试纸条中，所述荧光微球标记的IBRV多克隆抗体中，荧光微球与IBRV多克隆抗体的质量比可为8:1 15:1。~

[0008] 上述试纸条中，所述IBRV单克隆抗体的包被浓度可为450 550 μg/mL。~

[0009] 上述试纸条中，所述结合垫上还包被有荧光微球标记的鸡IgY；所述硝酸纤维素膜上还设有与所述检测线间隔一定距离的质控线，所述质控线上包被有羊抗鸡IgY抗体。

[0010] 上述试纸条中，所述荧光微球标记的鸡IgY中，荧光微球与鸡IgY的质量比为8:1~15:1；所述羊抗鸡IgY抗体的包被浓度为500 650 μg/mL。
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[0011] 本发明还提供制备任一所述的试纸条的方法，其特征在于，包括如下步骤：

[0012] （1）将荧光微球标记的IBRV多克隆抗体包被于玻璃纤维素膜上，得到结合垫；

[0013] （2）用IBRV单克隆抗体1C2在硝酸纤维素膜上进行划线包被，得到检测线；

[0014] （3）将样品垫、步骤（1）得到的结合垫、步骤（2）得到的硝酸纤维素膜、吸水垫沿层析方向依次搭接粘贴在底板上。

[0015] 上述方法中，所述荧光微球标记的IBRV多克隆抗体中，荧光微球与IBRV多克隆抗体的质量比可为8:1 15:1。~

[0016] 上述方法中，所述IBRV单克隆抗体的包被浓度为450 550 μg/mL。~

[0017] 上述方法中，所述步骤（1）还包括将荧光微球标记的鸡IgY包被于所述玻璃纤维素膜上；所述步骤（2）还包括用羊抗鸡IgY抗体在所述硝酸纤维素膜上与所述检测线间隔一定距离进行划线包被，得到质控线。

[0018] 上述方法中，所述荧光微球标记的鸡IgY中，荧光微球与鸡IgY的质量比为8:1 15:~
1；所述羊抗鸡IgY抗体的包被浓度为500 650 μg/mL。
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[0019] 本发明的荧光微球免疫层析试纸条不仅能够快速检出样品中的IBRV，还能对IBRV进行定量。该试纸条的检测原理为：将样品液滴加在样品垫上，样品液在毛细作用下朝着吸水垫流动，溶解结合垫上的荧光微球标记的IBRV多克隆抗体，若样品液中含有IBRV，则IBRV与荧光微球标记的IBRV多克隆抗体发生特异性结合，形成复合物A（荧光微球‑多抗‑IBRV）；复合物A随着样品液继续朝着吸水垫流动，当流动到硝酸纤维素膜上的检测线（T线）时，复合物A与T线上的IBRV单克隆抗体1C2发生特异性结合，形成复合物B（荧光微球‑多抗‑IBRV‑单抗1C2），复合物B聚集在T线上，在紫外光下产生荧光条带；当样品液流动到硝酸纤维素膜上的质控线（C线）时，溶解在样品液中的游离的荧光微球标记的鸡IgY与C线上的羊抗鸡IgY抗体发生特异性结合，形成复合物C（荧光微球‑鸡IgY‑羊抗鸡IgY），复合物C聚集在C线上，在紫外光下产生荧光条带。

[0020] 根据荧光条带的有无即可判断样品中是否含有IBRV，若T线没有条带，C线有条带，则判定为IBRV阴性；若T线和C线均有条带，则判定为IBRV阳性；若C线没有条带，则判定为无效。如果想要对样品中的IBRV进行定量，只需将显色后的试纸条放入荧光免疫层析分析仪中扫描，读取T线荧光信号和C线荧光信号的比值（T/C值）。将样品的T/C值带入标准曲线，即2 6
可计算出样品中的IBRV含量。经实验证明，当IBRV的TCID50为10~10 之间时，与其对应的T/
0.7427x 2
C值呈现良好的指数关系，回归方程为y=0.0044e ，R=0.8823，相关性良好。

[0021] 本发明的荧光微球免疫层析试纸条具有以下优点：

[0022] （1）可定量：该试纸条能够对样品中的IBRV进行准确定量，实现了方便快捷的IBRV定量检测，将IBRV定量检测从实验室拓宽到养殖场和检疫现场；

[0023] （2）敏感性高：该试纸条针对IBRV的最低检测限为8.58×101TCID50；

[0024] （3）特异性强：该试纸条只与IBRV发生特异性反应，与其他病毒和细菌无反应；

[0025] （4）稳定性好：该试纸条在4℃或室温（22 25℃）下保存12个月后，检测IBRV的敏感~性与特异性没有明显变化；

[0026] （5）准确性高：针对本课题组保存的50份牛的鼻拭子样品、阴道拭子样品和精液，该试纸条和细胞病毒分离方法的检测结果的总符合率达到100%。

[0027] （6）检测速度快：采用本发明的试纸条对样品中的IBRV进行定性或定量检测，15min内即可完成。

[0028] 分泌所述IBRV单克隆抗体的杂交瘤细胞的保藏信息如下：

[0029] 生物材料（株）：1C2

[0030] 分类命名：杂交瘤细胞

[0031] 保藏日期：2022年02月15日

[0032] 保藏编号：CGMCC No. 45040

[0033] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

[0034] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

[0035] 图1为纯化的1B6单克隆抗体的SDS‑PAGE检测结果。1为蛋白分子marker，2‑8为洗脱液，9为流穿峰，10为洗杂峰。

[0036] 图2为纯化的1C2单克隆抗体的SDS‑PAGE检测结果。1为蛋白分子marker，2‑8为洗脱液，9为流穿峰，10为洗杂峰。

[0037] 图3为纯化的2C4单克隆抗体的SDS‑PAGE检测结果。1和7为蛋白分子marker，2为腹水原液，3为流穿峰，4‑5为洗杂峰，6和8为浓缩的2C4单克隆抗体溶液。

[0038] 图4为纯化的3F9单克隆抗体的SDS‑PAGE检测结果。1为蛋白分子marker，2‑7为洗脱液，8为流穿峰，9为洗杂峰。

[0039] 图5为单抗免疫原性的Western blot检测结果。

[0040] 图6为抗体的荧光微球标记效果。A为单抗1B6‑荧光微球复合物，B为单抗1C2‑荧光微球复合物，C为单抗3F9‑荧光微球复合物，D为单抗2C4‑荧光微球复合物，E为IBRV多抗‑荧光微球复合物。

[0041] 图7为荧光微球免疫层析试纸条的结构及检测方法示意图。1‑4依次为样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫。

[0042] 图8为荧光微球免疫层析试纸条的外壳组装。

[0043] 图9为荧光微球免疫层析试纸条检测IBRV的特异性评价。1‑5依次为牛传染性鼻气管炎病毒Bartha Nu/67、牛病毒性腹泻/黏膜病毒ISO39、牛冠状病毒J1109、牛轮状病毒J0721、大肠杆菌DH5α的细胞培养物的检测结果。

[0044] 图10为荧光微球免疫层析试纸条检测IBRV的敏感性评价。1为阴性样品（PBS）的检6 5 4 3
测结果，2‑8依次为8.58×10TCID50、8.58×10TCID50、8.58×10TCID50、8.58×10TCID50、
2 1
8.58×10TCID50、8.58×10TCID50、8.58TCID50的IBRV病毒液的检测结果。

具体实施方式

[0045] 下面结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

[0046] 病毒：牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）Bartha Nu/67标准株由北京市农林科学院畜禽疫病研究中心提供，为已知的牛疱疹病毒Ⅰ型毒株，已在文献Xu J, Zhang X, Zhou S, Shen J, Yang D, Wu J, Li X, Li M, Huang X, Sealy JE, Iqbal M, Li Y. A DNA aptamer efficiently inhibits the infectivity of Bovine herpesvirus 1 by blocking viral entry. Sci Rep. 2017 Sep 18;7(1):11796. doi: 10.1038/s41598‑017‑10070‑1. PMID: 28924154; PMCID: PMC5603541.中公开。牛病毒性腹泻/黏膜病毒ISO39、牛冠状病毒J1109、牛轮状病毒J0721，由北京市农林科学院畜禽疫病研究中心提供。
以上病毒本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

[0047] 动物：6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠、SPF兔均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

[0048] 细胞：MDBK细胞、High Five细胞、SP2/0骨髓瘤细胞、大肠杆菌DH5α由北京市农林科学院畜禽疫病研究中心提供，上述细胞均可商购获得。

[0049] 试剂：HAT培养基购自Sigma‑Aldrich，产品编号为H0262。HT培养基购自Sigma‑Aldrich，产品编号为H0137。DMEM培养基、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司。PEG6000、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钾购自北京索莱宝科技有限公司。N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）购自Sigma公司。

[0050] 耗材：样品垫、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC底板、试纸条外壳均购自上海金标生物科技有限公司。

[0051] PBS：称取磷酸氢二钠（含12个结晶水）2.9g、磷酸二氢钾 0.2g、氯化钠8g、氯化钾0.2g，加入1000ml纯化水搅拌溶解。

[0052] 实施例3中用于符合率检测的50份牛的鼻拭子样品、阴道拭子样品和精液样品由北京市农林科学院畜禽疫病研究中心提供。

[0053] 若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和条件均为本领域常规实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

[0054] 实施例1. IBRV单克隆抗体和IBRV多克隆抗体的获得

[0055] 1. IBRV病毒的纯化

[0056] 准备好单层生长的MDBK细胞，以MOI=1的比例加入IBRV（Bartha Nu/67标准株）感作1h，随后加入含2%（v/v）FBS的DMEM培养基，37℃培养2‑3天。当细胞CPE（致细胞病变效应）达到80%左右时，将其放于‑80℃冰箱中反复冻融三次，离心收集上清液（病毒液）。采用蔗糖梯度密度离心法对病毒液进行浓缩和纯化，步骤如下：

[0057] （1）剪适当长度的透析袋MD25（北京索莱宝科技有限公司），置于500 mL洗液（2%NaCO3+1mmol/L EDTA）中，煮沸10min。

[0058] （2）用去离子水清洗透析袋后，置于500 mL 1mmol/L EDTA•2Na（pH8.0）中，煮沸10min。

[0059] （3）冷却后用去离子水清洗透析袋，然后浸入50%乙醇中，置于4℃待用。

[0060] （4）用去离子水将预处理过的透析袋里外清洗后置于适宜槽中。向透析袋内加入病毒液，用夹子夹住透析袋的两端。

[0061] （5）用适量PEG6000将透析袋覆盖，直至病毒液浓缩至20 30 mL左右。~

[0062] （6）吸出病毒液，用5 mL PBS清洗透析袋内部，将吸附在透析袋内壁上的病毒洗脱下来，合并入浓缩的病毒液中。

[0063] （7）将浓缩的病毒液于5000 r/min（4500×g）离心30 min，收集上清。

[0064] （8）制备蔗糖梯度管，利用长针头向高速离心管中从上至下依次加入浓度分别为20%、40%、60%的蔗糖溶液各5mL，最后缓慢加入上一步收集的上清。

[0065] （9）于35000 r/min（54200×g）超速离心2 h，使用注射器小心吸取40%蔗糖和60%蔗糖分层处的病毒条带。用10 mL PBS溶解沉淀，得到纯化的IBRV病毒液，分装后保存于‑70℃备用。

[0066] 重组gD蛋白的制备

[0067] 取10 mL重组杆状病毒rBac‑gD接种100 mL 处于对数生长期的High Five细胞，置于27℃摇床中，140 rpm悬浮培养。rBac‑gD为本实验室前期制备的重组杆状病毒，其含有能够表达重组gD蛋白的重组穿梭杆粒Bacmid‑gD。rBac‑gD的制备方法记载在申请号为2021104031189，申请日为2021年04月14日，发明名称为“用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的中和抗体的阻断ELISA试剂盒及其应用”的中国发明专利中。在此通过引用将该专利的全部内容合并到本文中。

[0068] 取30 mL 重组杆状病毒rBac‑gD接种300 mL High Five细胞，置于27℃摇床中，140 rpm悬浮培养72h。将细胞培养液于12000 rpm离心30 min，收集上清，利用His‑镍柱（Qiagen，70971）进行蛋白纯化。在4℃条件下，用5倍柱体积（约50 mL）的ddH2O低流速置换出His‑镍柱中的20%乙醇。过2倍柱体积（约20mL）的0.2M NiCl2至读数稳定。过5倍柱体积的ddH2O洗去未结合的Ni离子。过5倍柱体积的lysis buffer（20mM Tris，0.5M NaCl，pH8.0）平衡His‑镍柱。4℃条件下将细胞培养上清过夜循环过His‑镍柱，上样前留样，流出液留样。
用含20 mM咪唑的lysis buffer，洗至OD280吸收值稳定，留样。用含50 mM咪唑的lysis buffer，洗至OD280吸收值稳定，留样，加入终浓度为1%的PMSF。用含400 mM咪唑的lysis buffer，洗至OD280吸收值稳定，留样，加入终浓度为1%的PMSF。依次加入5倍柱体积的ddH2O、EDTA溶液（0.5M）、ddH2O、NaOH溶液（0.5M）、ddH2O和20%乙醇处理Ni柱。

[0069] 通过SDS‑PAGE检测蛋白的纯化结果。将对应单一条带的样品置于50mL的蛋白浓缩管中，加入终浓度为1 mM的DTT，于4℃，2900 rpm离心直至溶液剩至2 mL左右时，得到浓缩后的重组gD蛋白溶液。

[0070] 单克隆抗体的获得

[0071] （1）动物免疫

[0072] 将纯化的IBRV病毒液（Bartha Nu/67标准株）与等体积弗氏完全佐剂（Sigma‑Aldrich，F5881）混合并乳化完全后，对6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠进行首次免疫，免疫剂量为50 µg/只。首次免疫2周后，将等体积的IBRV病毒液（Bartha Nu/67标准株）与弗氏不完全佐剂（Sigma‑Aldrich，F5506）充分乳化后，进行第2次、第3次和第4次免疫，免疫剂量为50 µg/只，每次免疫间隔2周。

[0073] （2）血清效价的测定

[0074] 利用第3次免疫后的小鼠阳性血清建立杂交瘤筛选的间接ELISA方法，用棋盘法进行最佳抗原包被浓度和最佳阳性血清稀释度的标定。间接ELISA方法如下：

[0075] 包被：将浓缩后的重组gD蛋白溶液分别稀释为5 μg/ml、2.5 μg/ml、1.25 μg/ml、0.625 μg/ml、0.3125 μg/ml、0.1562 μg/ml，按照每孔100 μL加入酶标板，酶标板最后一行加入PBST作为抗原阴性对照，37℃孵育1h后，4℃过夜。

[0076] 封闭：用洗板机洗板5次后，每孔加入300 μL采用PBST配制的5%的脱脂奶，37℃封闭2 h。

[0077] 孵一抗：用PBST对第3次免疫后的小鼠的阳性及阴性血清进行稀释；洗板后加入稀释的血清，100 μL/孔，37℃孵育1 h。

[0078] 孵二抗：用PBST将HRP标记的山羊抗小鼠IgG（Sigma‑Aldrich，A9309）进行1:10000倍稀释，洗板后加入稀释的二抗，100 μL/孔，37℃孵育1 h。

[0079] 显色：洗板后加入TMB显色液（Solarbio，PR1210），100 μL/孔，37℃避光反应15 min，然后加入50 μL 2M硫酸终止反应。读取450 nm波长处的吸光值（OD450nm）。

[0080] 选取OD450nm值最接近1.0的孔所对应的抗原浓度和血清稀释度为最佳抗原包被浓度和最佳阳性血清稀释度。第4次免疫后一周进行小鼠眼球采血，采用最佳抗原包被浓度和最佳阳性血清稀释度，按照上述间接ELISA方法测定小鼠血清效价。选择效价最高的两只小鼠，于细胞融合前3天进行腹腔加强免疫，免疫剂量为50 µg/只。

[0081] （3）细胞融合和筛选

[0082] 无菌环境下取加强免疫后的BALB/c小鼠的脾脏研制成脾细胞悬液，将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照5:1的细胞数量比进行融合，融合后铺于6块96孔细胞培养板，用含有20%胎牛血清的HAT培养基（Sigma‑Aldrich，H0262）进行选择性培养，7‑12d逐步换用HT培养基（Sigma‑Aldrich，H0137）。融合后第10天，用IBRV作为包被抗原，按照上述间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行初步筛选，IBRV的包被量为500 ng/孔。隔2天重复检测一次，筛选出对IBRV为抗体阳性的孔。将6块板中所有检测结果为强阳性的孔的融合细胞转到48孔板进行扩大培养，同时选择5个ELISA值高的孔进行第一次亚克隆。按照同样的方法再进行2次亚克隆，直到阳性率为100%。获得了4株能稳定分泌IBRV单克隆抗体（IBRV单抗）的杂交瘤细胞株，编号分别为1B6、1C2、2C4、3F9。

[0083] （4）腹水制备与单克隆抗体纯化

[0084] 向6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠的腹腔注射1 mL高压灭菌的液体石蜡致敏，7天6
后腹腔注射1.0×10 个长势良好的杂交瘤细胞。每天观察小鼠腹腔变化，待其胀至行动不便时，进行腹水采集。单克隆抗体纯化：取与腹水等体积的Binding Buffer（Thermo Fisher, 货号：21019）与腹水混合均匀，10000g离心20min，收集上清，利用0.22μm滤膜进行过滤。过滤后使用Protein A/G纯化柱（Thermo Fisher, 货号：TF266548）进行纯化，用5倍柱体积Binding Buffer过柱子后将过滤后的上清进行过柱，过柱后液体留样。用10倍柱体积的Binding Buffer洗杂，过5倍柱体积Elution Buffer（Thermo Fisher, 货号：21027）进行洗脱，洗脱过程监测OD280数值，当数值变化时收集液体，每毫升液体加入100μl PBS。
SDS‑PAGE检测IBRV单抗的纯化结果（图1‑4）。

[0085] 单克隆抗体的免疫原性检测

[0086] 将纯化的重组gD蛋白溶液与蛋白上样缓冲液混匀，煮沸后进行SDS‑PAGE，经常规湿转的方法将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜上。PVDF膜用5%的脱脂奶室温封闭2 h；加纯化的IBRV单克隆抗体（使用PBST按照1:1000稀释），室温孵育2 h，膜用PBST洗5次，每次5min；加HRP标记的山羊抗小鼠IgG（Sigma，A9309）（使用PBST按照1:10000稀释），25℃孵育2h，膜用PBST洗5次，每次5min；化学发光并拍照。结果如图5所示，纯化的IBRV单抗1B6、1C2、2C4、3F9均能与重组gD蛋白发生特异性反应。

[0087] 多克隆抗体的制备

[0088] 将上述纯化的IBRV病毒液与等体积的弗氏完全佐剂（Sigma‑Aldrich，F5881）混合并充分乳化后，对SPF兔进行首次免疫，免疫剂量为0.5mg/只。首次免疫2周后，将纯化的IBRV病毒液与等体积的弗氏不完全佐剂（Sigma‑Aldrich，F5506）混合并充分乳化后，进行第2次、第3次和第4次免疫，每次每只免疫1mg，免疫间隔2周。共免疫三只兔，经四次免疫后，采血，分离血清，获得IBRV多克隆抗体（IBRV多抗）。每组取10 mL兔血清，利用Protein A/G纯化柱（Thermo Fisher, 货号：TF266548）进行抗体纯化。步骤如下：将血清与binding buffer（Thermo Fisher, 货号：21019）等体积混合，4℃，10000rpm离心30min，采用0.45um滤膜过滤；于4℃条件下，用5倍柱体积的binding buffer（约50mL）置换含有2%叠氮化钠的ddH2O，样品上柱，用5倍柱体积的binding buffer洗杂，用5倍柱体积的Elution buffer（Thermo Fisher, 货号：21027）洗脱，收集的洗脱液加入100μL PBS，直至OD280的数值基本无变化。依次使用5倍柱体积的Elution buffer、5倍柱体积的含有2%的叠氮化钠的ddH2O处理柱子。通过SDS‑PAGE检测IBRV多抗的纯化结果，并使用核酸蛋白浓度分析仪（Nanodrop，Denovix DS‑11+）测定抗体浓度。

[0089] 实施例2. 用于检测IBRV的荧光微球免疫层析试纸条的制备

[0090] 1. 抗体的荧光微球标记

[0091] 分别对实施例1中纯化的IBRV单抗、IBRV多抗和鸡IgY（南京瀚睿生物公司，T111101M）进行荧光微球标记，步骤如下：

[0092] (a)取100μl荧光微球（苏州为度生物公司，FT0100CA，10mL）加入900μl标记缓冲液混匀，16000rpm离心10min，弃去上清。

[0093] (b)加入1mL标记缓冲液重悬荧光微球，16000rpm离心10min，弃去上清。

[0094] (c)称取NHS和EDC，分别用标记缓冲液（现用现配）溶解；取10μl NHS溶液（20mg/ml）加入到清洗后的荧光微球中，快速混匀，然后取5μl EDC溶液（20mg/ml）加入到荧光微球中，快速混匀；室温孵育20min。

[0095] (d)将活化后的荧光微球于17000rpm离心20min，弃掉上清，重复离心一次，弃掉上清后，向其中加入1000μl标记缓冲液重悬荧光微球。

[0096] (e)取0.1mg抗体于2ml离心管中，加入1mL步骤(d)所得的荧光微球悬浮液（含1mg 荧光微球），快速混匀后，室温孵育2h，得到抗体‑荧光微球复合物。

[0097] (f)向抗体‑荧光微球复合物中加入100μl封闭液，室温孵育1h。

[0098] (g)离心，弃掉上清。加入1000μl重悬液重悬抗体‑荧光微球复合物。

[0099] (h)重复一次步骤(g)。

[0100] (i)离心，弃掉上清。用1000μl重悬液重悬抗体‑荧光微球复合物，即得。

[0101] 上述荧光微球标记实验所使用的溶液的配方如下：

[0102] 标记缓冲液：称取9.762g MES，用1L蒸馏水溶解，调节PH至6.0。

[0103] 封闭液：称取20mg BSA，用1mL终浓度为100mM的乙醇胺溶液充分溶解。

[0104] 重悬液：称取1.21g Tris和5g BSA，量取5mL Tween‑20，用1L蒸馏水溶解。

[0105] 使用喷金仪将获得的抗体‑荧光微球复合物分别喷在玻璃纤维素膜上，在紫外光下检查荧光微球标记效果（图6）。

[0106] 结合垫的包被

[0107] 对获得的抗体‑荧光微球复合物及鸡IgY‑荧光微球复合物进行超声处理15~20min。将超声处理后的抗体‑荧光微球复合物（80 120 μg/mL）与鸡IgY‑荧光微球复合物~
（80 120 μg/mL）按照3:1的体积比充分混匀后均匀地涂于玻璃纤维素膜上。将涂好抗体‑荧~
光微球复合物的玻璃纤维素膜置于37℃干燥16h，得到结合了抗体‑荧光微球复合物的结合垫。

[0108] 膜的包被

[0109] 将未标记的单抗1B6、单抗1C2、单抗2C4、单抗3F9、IBRV多抗分别稀释为0.5 mg/mL。将羊抗鸡IgY（南京瀚睿生物公司，T111201M）稀释为0.5 mg/mL。使用三维平面划膜仪（上海金标生物科技有限公司，HM3030）将未标记的抗体和羊抗鸡IgY包被在硝酸纤维素膜（NC膜）上。具体为：将稀释的单抗或多抗以1μL/cm的喷样量在NC膜上划线得到检测线（T线），将稀释的羊抗鸡IgY以1μL/cm的喷样量在NC膜上划线得到质控线（C线）。将划线后的NC膜置于40℃干燥16h。

[0110] 试纸条组装

[0111] 按照图7所示的试纸条结构，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴到PVC底板上，相邻的部件之间相互重叠2 mm，制成大板。然后利用切条机（上海金标生物科技有限公司，ZQ2402）将大板切成4 mm宽的试纸条，装上塑料的试纸条外壳（上海金标生物科技有限公司），用铝箔袋密封包装。试纸条外壳上设有样品孔和观察窗，样品孔的下方为样品垫，观察窗的下方为硝酸纤维素膜上检测线和质控线的位置。

[0112] 抗体配对筛选

[0113] 将结合了不同的抗体‑荧光微球复合物的结合垫与包被了不同抗体的NC膜进行组合，按照上述方法组装成试纸条。抗体组合如表1所示。

[0114] 表1 各试纸条上的抗体组合

[0115] 试纸条编号 结合垫上的抗体 NC膜T线上的抗体1 IBRV多抗 1B6
2 IBRV多抗 1C2
3 IBRV多抗 3F9
4 IBRV多抗 2C4
5 IBRV多抗 IBRV多抗
6 1C2 1C2
7 1C2 1B6
8 1C2 3F9
9 1C2 2C4
10 1C2 IBRV多抗
11 1B6 1C2
12 1B6 1B6
13 1B6 3F9
14 1B6 2C4
15 1B6 IBRV多抗
16 3F9 1C2
17 3F9 1B6
18 3F9 3F9
19 3F9 2C4
20 3F9 IBRV多抗
21 2C4 1C2
22 2C4 1B6
23 2C4 3F9
24 2C4 2C4
25 2C4 IBRV多抗

[0116] 通过双抗夹心方法进行抗体配对试验。具体如下：将8.58×107TCID50的IBRV病毒液按照1:10稀释，取80 μl稀释的病毒液滴加到各试纸条的样品垫上，10min之内在紫外光下观察结果。以样品稀释液（PBS）作为阴性对照。若T线没有条带，C线有条带，则判定为阴性；若T线和C线均有条带，则判定为阳性；若C线没有条带，则判定为无效。

[0117] 结果表明，只有结合垫上包被IBRV多抗‑荧光微球复合物、T线上包被1C2单抗的2号试纸条的T线有清晰的条带出现，其余试纸条的T线无条带或条带颜色很浅。因此，2号试纸条可准确检出IBRV病毒。以下实验采用2号试纸条进行。

[0118] 试纸条的定性检测方法

[0119] 向上述2号试纸条的样品孔中加入40μl待检样品液，之后再加入等体积的样品稀释液（PBS），反应10min后，采用紫外灯照射，观察条带显色情况，随即进行结果判定。

[0120] 结果判定标准：

[0121] 阳性：若C线和T线均显色，则待检样品液中含有IBRV病毒；

[0122] 阴性：若C线显色，T线不显色，则待检样品液中不含IBRV病毒；

[0123] 可疑：若C线显色，T线若隐若现或颜色很浅，则结果不确定，需重新检测；

[0124] 无效：若C线不显色，则检测无效。

[0125] 试纸条的定量检测方法

[0126] 半数组织细胞感染量（TCID50）的测定是OIE推荐的用于测定感染性牛传染性鼻气管炎病毒含量的经典方法。

[0127] 标准曲线建立：取107TCID50、106TCID50、105TCID50、104TCID50、103TCID50、102TCID50、1 0
10TCID50、10TCID50的IBRV病毒液各1份，用上述2号试纸条分别进行检测，每份样品重复检测10次。具体为：向2号试纸条的样品孔中加入IBRV病毒液40μl，之后再加入等体积的样品稀释液（PBS），反应10min后，采用紫外灯照射，将显色后的试纸条用荧光免疫层析分析仪（型号FIC‑H1）读取T线荧光信号和C线荧光信号的比值（即T/C值）。将T/C值的平均值作为CUT‑OFF值，建立标准曲线。依据检测体系中待测病毒的浓度与荧光免疫层析分析仪读取的T/C值在一定条件下具有相关性，以病毒的lg(TCID50)为横坐标，荧光免疫层析分析仪读取
2 6
的T/C值为纵坐标作图，建立标准曲线。结果显示，当TCID50为10~10 之间时，与其对应的T/
0.7427x 2
C值呈现良好的指数关系，回归方程为y=0.0044e ，R=0.8823，相关性良好（图7）。

[0128] 样品检测：向2号试纸条的样品孔中加入待检样品液40μl，之后再加入等体积的样品稀释液（PBS），反应10min后，用紫外灯照射，将显色后的试纸条放入荧光免疫层析分析仪中扫描，读取T/C值。将待检样品液的T/C值带入标准曲线，计算出待检样品液中的IBRV含量。

[0129] 表2 定量检测方法的结果判定标准

[0130] T/C值 病毒感染力（TCID50） 结果判定T/C<0.02 TCID50<200 ±/‑
0.020.03T/C>0.3 TCID50>100000 +

[0131] 实施例3. 用于检测IBRV的荧光微球免疫层析试纸条的性能验证

[0132] 1. 特异性检测

[0133] 用实施例2中制备的2号试纸条对牛传染性鼻气管炎病毒Bartha Nu/67（8.58×6  6 
10 TCID50）、牛病毒性腹泻/黏膜病毒ISO39（6.32×10 TCID50）、牛冠状病毒J1109（2.19×
6  6 
10 TCID50）、牛轮状病毒J0721（7.59×10 TCID50）、大肠杆菌DH5α的细胞培养物进行特异性检测。向试纸条的样品孔中加入40μl待检病毒液，之后再加入等体积的样品稀释液（PBS），反应10min后，用紫外灯照射，观察条带显色情况。

[0134] 结果如图9所示，本发明的荧光微球免疫层析试纸条只能与牛传染性鼻气管炎病毒发生特异性反应，与其他病毒和细菌无反应，特异性强。

[0135] 敏感性检测

[0136] 将8.58×107TCID50的IBRV病毒进行10倍倍比稀释，每个梯度取样品80μl，用实施例2中制备的2号试纸条进行检测。具体为：向试纸条的样品孔中加入80μl样品，反应10min后，用紫外灯照射，将显色后的试纸条放入荧光免疫层析分析仪中读取T线荧光信号和C线荧光信号的比值（T/C值），根据实施例2中表2所示的判定标准判定结果。结果如表3和图101
所示，本发明的荧光微球免疫层析试纸条的最低检出限为8.58×10TCID50，敏感性高。

[0137] 表3 荧光微球标记的免疫层析试纸条对标准样品的检测结果

[0138] IBRV浓度 T/C值 结果判定 定性判定6
8.58×10TCID50 0.668 + +
5
8.58×10TCID50 0.514 + +
4
8.58×10TCID50 0.295 + +
3
8.58×10TCID50 0.175 + +
2
8.58×10TCID50 0.093 + ±
1
8.58×10TCID50 0.022 + ‑
8.58TCID50 0.019 ‑ ‑
NC 0.017 ‑ ‑

[0139] NC表示阴性样品（PBS），“+”表示IBRV阳性，“‑”表示IBRV阴性，“±”表示可疑。

[0140] 稳定性检测

[0141] 将实施例2中制备的2号试纸条分别储存于4℃及室温（22 25℃）下，分别于储存后~2
1个月、3个月、6个月、9个月、12个月取出，用浓度为8.58×10TCID50的IBRV病毒液检测不同温度下不同保存期的试纸条的敏感性，用健康牛的鼻拭子检测不同温度下不同保存期的试纸条的特异性。采用定性检测方法进行检测。结果如表4和5所示，本发明的荧光微球免疫层析试纸条在4℃及室温下保存12个月后，其敏感性与特异性没有明显变化，稳定性良好。

[0142] 表4 试纸条在室温下的稳定性评价

[0143]  在22 25℃下的储存时间（月）1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12~
敏感性 + + + + + + + + + + ± ‑
特异性 ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑

[0144] 表中“+”表示IBRV阳性，“‑”表示IBRV阴性，“±”表示可疑。

[0145] 表5 试纸条在4℃下的稳定性评价

[0146]在4℃下的储存时间（月） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
敏感性 + + + + + + + + + + + +
特异性 ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑

[0147] 表中“+”表示IBRV阳性，“‑”表示IBRV阴性。

[0148] 符合率检测

[0149] 取本课题组保存的背景清晰的50份牛的鼻拭子样品、阴道拭子样品和精液样品，分别使用实施例2中制备的2号试纸条以及常规的细胞病毒分离方法进行平行对比试验，以确定本发明的试纸条检测方法与细胞病毒分离方法的符合率。试纸条检测方法同实施例2中试纸条的定量检测方法。细胞病毒分离方法参见“王延涛. 牛传染性鼻气管炎病毒分离鉴定及其单克隆抗体制备[D]. 黑龙江八一农垦大学，2008年.”中记载的病毒分离方法。

[0150] 结果如表6所示，30份经细胞病毒分离方法确认阳性的样品和20份经细胞病毒分离方法确认阴性的样品，用本发明的荧光微球免疫层析试纸条进行检测，显色后的试纸条放入荧光免疫层析分析仪中读取T线荧光信号和C线荧光信号的比值（T/C值），将T/C值带入0.7427x
标准曲线（y=0.0044e ），计算出样品液中的IBRV含量。符合率为100%。

[0151] 表6 本发明的试纸条检测结果与细胞病毒分离结果的符合性比较

[0152] 样品 细胞病毒 本发明的试纸条检病毒含量 样品 细胞病毒 本发明的试纸条检病毒含量编号 分离结果 测结果（T/C值） （lgTCID50) 编号 分离结果 测结果（T/C值） （lgTCID50)1 + 0.870 7.12 26 + 0.611 6.64
2 + 0.759 6.93 27 + 0.521 6.43
3 + 0.360 5.93 28 + 0.726 6.87
4 + 0.590 6.60 29 + 0.720 6.86
5 + 0.280 5.59 30 + 0.680 6.79
6 + 0.292 5.65 31 ‑ 0.013 0.00
7 + 0.548 6.50 32 ‑ 0.012 0.00
8 + 0.660 6.75 33 ‑ 0.009 0.00
9 + 0.640 6.71 34 ‑ 0.015 0.00
10 + 0.434 6.18 35 ‑ 0.016 0.00
11 + 0.254 5.46 36 ‑ 0.019 0.00
12 + 0.296 5.67 37 ‑ 0.010 0.00
13 + 0.515 6.41 38 ‑ 0.017 0.00
14 + 0.175 4.96 39 ‑ 0.018 0.00
15 + 0.490 6.35 40 ‑ 0.013 0.00
16 + 0.584 6.58 41 ‑ 0.013 0.00
17 + 0.260 5.49 42 ‑ 0.019 0.00
18 + 0.476 6.31 43 ‑ 0.014 0.00
19 + 0.710 6.84 44 ‑ 0.015 0.00
20 + 0.720 6.86 45 ‑ 0.012 0.00
21 + 0.610 6.64 46 ‑ 0.019 0.00
22 + 0.570 6.55 47 ‑ 0.017 0.00
23 + 0.680 6.79 48 ‑ 0.012 0.00
24 + 0.390 6.04 49 ‑ 0.013 0.00
25 + 0.410 6.11 50 ‑ 0.015 0.00