一种柑橘茎尖无激素培养方法

摘要

一种柑橘茎尖无激素培养方法，按以下步骤进行：（1）选取柑橘枝条制成外植体；（2）消毒后用无菌水清洗；（3）插入MS固体培养基中，培养获得长出新芽的枝条；（4）配制MT液体培养基溶液，蔗糖的质量浓度为7～8%；（5）新芽剥掉芽外部叶片，切取茎尖，接种于液体培养基中，初代培养；（6）选取枳壳或枳橙种子，剥去外种皮消毒后无菌水清洗；（7）接种到含有MS固体培养基的试管中，暗培养获得黄化小苗；（8）切出T形切口；将茎尖置于T形切口的中间，获得嫁接苗；（9）嫁接培养，至待接穗芽长至0.5～1cm时，二次嫁接于温室。本发明不使用激素，均能获得再生苗，显著提高了植物茎尖培养的效率，可在不同柑橘品种上广泛应用。

权利要求

1.一种柑橘茎尖无激素培养方法，其特征在于按以下步骤进行：（1）选取柑橘成年树枝条，剪去叶片，清洗表面尘土，然后切成6～7cm长的茎段；

（2）将茎段先用酒精消毒20～30s，再用次氯酸钠溶液消毒15～25min，然后用无菌水清洗，最后用无菌滤纸吸干表面水分，获得消毒茎段；

（3）消毒茎段插入MS固体培养基中，再置于培养箱中进行枝条培养10～15天，使茎段长出新芽；

（4）配制MT液体培养基溶液，其中蔗糖的质量浓度为7～8%，灭菌后分装；向培养皿中加入液体培养基溶液，制成液体培养基，用封口膜封好备用；

（5）茎段长出新芽后，取新芽剥掉芽外部叶片，用无菌刀片切取长度为0.15～0.25mm的茎尖；将茎尖接种于液体培养基中，再置于培养箱中进行初代培养25～40天；

（6）选取枳壳或枳橙种子，剥去外种皮，先用酒精消毒20～30s，再用次氯酸钠溶液消毒

15～25min，然后用无菌水清洗，获得消毒砧木种子；

（7）将消毒砧木种子接种到含有MS固体培养基的试管中，暗培养13～15天，获得高度为

6～9cm的黄化小苗；

（8）选取根颈直径≥2mm的黄化小苗，置于灭菌培养皿上，切去茎上部，在离茎上端 3～

5mm处切出T形切口；将完成初代培养的茎尖置于T形切口的中间，获得嫁接苗；

（9）将嫁接苗置于培养箱中进行嫁接培养，至待接穗芽长至0.5～1cm 时，再二次嫁接于温室。

2.根据权利要求1所述的一种柑橘茎尖无激素培养方法，其特征在于步骤（2）和（6）中，酒精的质量浓度为70～80%。

3.根据权利要求1所述的一种柑橘茎尖无激素培养方法，其特征在于步骤（2）和（6）中，次氯酸钠溶液的质量浓度为1～1.5%。

4.根据权利要求1所述的一种柑橘茎尖无激素培养方法，其特征在于步骤（2）和（6）中，无菌水清洗次数为3～5次。

5.根据权利要求1所述的一种柑橘茎尖无激素培养方法，其特征在于步骤（1）中，每个茎段上带有3～4个芽。

6.根据权利要求1所述的一种柑橘茎尖无激素培养方法，其特征在于步骤（3）和（9）中，培养箱的培养条件为光照强度1600～2200Lux，24小时之内的16小时的25±0.5℃光照和8小时的25±0.5℃黑暗组成。

7.根据权利要求1所述的一种柑橘茎尖无激素培养方法，其特征在于步骤（5）中，新芽剥掉芽外部叶片，用无菌刀片切取茎尖是在超净工作台中放置体视镜，在体视镜下完成。

8.根据权利要求1所述的一种柑橘茎尖无激素培养方法，其特征在于步骤（5）中，培养箱的培养条件为光照强度1600～2200Lux，24小时之内的16小时的40±0.5℃光照和8小时的30±0.5℃黑暗组成。

说明书

一种柑橘茎尖无激素培养方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物培养技术领域，特别涉及一种柑橘茎尖无激素培养方法。

背景技术

[0002] 茎尖培养是将茎尖分生组织无菌培养，可快速繁殖无性系、培养脱毒幼苗。目前广泛应用于种苗快速繁殖、品种改良和脱毒苗生产等。茎尖组织培养的再生植株遗传学稳定，特别适合用于常规繁育有困难的物种、童期长的树木或者需要脱毒的物种。

[0003] 茎尖培养常用MS、B5、White培养基等，再补加其它物质如营养成分、生长调节物质等来提高茎尖组织培养的成苗率。碳源一般为2～4%葡萄糖或者蔗糖，固化剂选用琼脂。植物激素的种类及浓度对于不同的植物品种各不相同，主要包括生长素（NAA或IAA），赤霉素（GA3等）和细胞分裂素（6‑BA、玉米素等），以促进茎尖生长和分化。茎尖培养分为普通茎尖培养和茎尖分生组织培养两种类型，茎尖培养的成活率与茎尖大小呈正相关。普通茎尖培养可取数毫米大小的茎尖或侧芽，而茎尖分生组织培养则要求取小于0.5mm的茎尖生长点，茎尖生长点指带有1～2个叶原基的生长锥。病毒引起的病害不同于真菌及细菌病害，不能采用杀菌剂和抗生素防治，生产上目前无法根治。病毒在植物体内分布不均匀，茎尖生长点因为无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以茎尖生长点几乎不含病毒。茎尖培养脱毒效果好，后代稳定，目前广泛应用。

[0004] 果树等木本植物茎尖培养的研究比草本植物要晚，因木本植物茎尖培养比较困难，其原因很多，但最主要的原因是未能掌握茎尖对养分的需求，特别是对激素的需求。例如，生长素浓度太低，茎尖生长太慢或者不生长，细胞逐渐老化变褐死亡；生长素浓度过高，接种后茎尖基部产生愈伤组织，易产生畸形芽或嵌合体，导致品种不能稳定遗传。因此，在实际操作中，人们要花费很多工夫来确定针对不同品种适用的激素种类和浓度。

[0005] 柑橘茎尖培养普遍采用MS培养基+植物激素进行，对于不同品种，激素种类和浓度不尽相同，需要操作者花费很大精力进行实验摸索针对不同品种的激素配方。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种柑橘茎尖无激素培养方法，采用不添加任何激素的高糖液体培养基，培养柑橘茎尖，柑橘茎尖培养后通过微芽嫁接可获得再生柑橘苗。

[0007] 本发明的方法按以下步骤进行：

[0008] （1）选取柑橘成年树枝条，剪去叶片，清洗表面尘土，然后切成6～7cm长的茎段；

[0009] （2）将茎段先用酒精消毒20～30s，再用次氯酸钠溶液消毒15～25min，然后用无菌水清洗，最后用无菌滤纸吸干表面水分，获得消毒茎段；

[0010] （3）消毒茎段插入MS固体培养基中，再置于培养箱中进行枝条培养10～15天，使茎段长出新芽；

[0011] （4）配制MT （Murashge and Tucker）液体培养基溶液，其中蔗糖的质量浓度为7～8%，灭菌后分装；向培养皿中加入液体培养基溶液，制成液体培养基，用封口膜封好备用；

[0012] （5）茎段长出新芽后，取新芽剥掉芽外部叶片，用无菌刀片切取度为0.15～0.25mm的茎尖；将茎尖接种于液体培养基中，再置于培养箱中进行初代培养25～40天；

[0013] （6）选取枳壳或枳橙种子，剥去外种皮，先用酒精消毒20～30s，再用次氯酸钠溶液消毒15～25min，然后用无菌水清洗，获得消毒砧木种子；

[0014] （7）将消毒砧木种子接种到含有MS固体培养基的试管中，暗培养13～15天，获得高度为6～9cm的黄化小苗；

[0015] （8）选取根颈直径≥2mm的黄化小苗，置于灭菌培养皿上，切去茎上部，在离茎上端 3～5mm处切出T形切口；将完成初代培养的茎尖置于T形切口的中间，获得嫁接苗；

[0016] （9）将嫁接苗置于培养箱中进行嫁接培养，至待接穗芽长至0.5～1cm 时，再二次嫁接于温室。

[0017] 上述的步骤（1）中，所述的柑橘成年树枝条的外观无明显病斑且长势较好。

[0018] 上述的步骤（2）和（6）中，酒精的质量浓度为70～80%。

[0019] 上述的步骤（2）和（6）中，次氯酸钠溶液的质量浓度为1～1.5%。

[0020] 上述的步骤（2）和（6）中，无菌水清洗次数为3～5次。

[0021] 上述的步骤（1）中，每个茎段上带有3～4个芽。

[0022] 上述的步骤（3）和（9）中，培养箱的培养条件为光照强度1600～2200Lux，24小时之内的16小时的25±0.5℃光照和8小时的25±0.5℃黑暗组成。

[0023] 上述的步骤（5）中，新芽剥掉芽外部叶片，用无菌刀片切取茎尖是在超净工作台中放置体视镜，在体视镜下完成。

[0024] 上述的步骤（4）中，灭菌后分装按100ml/瓶分装。

[0025] 上述的步骤（4）中，培养皿为灭菌后的直径60mm玻璃培养皿。

[0026] 上述的步骤（4）中，向培养皿中加入液体培养基溶液是在超净工作台中向若干个培养皿中加入液体培养基溶液。

[0027] 上述的步骤（4）中，每个培养皿的加入量为3ml。

[0028] 上述的步骤（5）中，培养箱的培养条件为光照强度1600～2200Lux，24小时之内的16小时的40±0.5℃光照和8小时的30±0.5℃黑暗组成。

[0029] 上述的步骤（6）中，选取饱满健康的枳壳或枳橙种子。

[0030] 上述的步骤（6）中，在超净工作台上进行消毒和清洗。

[0031] 上述的步骤（8）中，在超净工作台上进行切口和嫁接。

[0032] 上述的步骤（7）中，暗培养的条件为24小时的25±0.5℃无光照培养。

[0033] 本发明采用高糖MT培养基对木本植物柑橘进行茎尖培养，在高糖浓度下，茎尖不易褐化，生长速度适中，也不会产生愈伤组织，40±0.5℃处理用于钝化病毒不影响茎尖生长，保证了品种的遗传稳定性。

[0034] 本发明不使用激素，均能获得再生苗，显著提高了植物茎尖培养的效率，在爱媛28、莱维琳娜、春见、纽荷尔4个个柑橘品种均获得成功，说明该培养基适用于多个柑橘品种，未来可在不同柑橘品种上广泛应用。

[0035] 本发明的优点为：

[0036] （一）不需要受激素浓度的限制：

[0037] 柑橘茎尖培养通常用MS培养基和不同浓度激素组合，但因为不同品种茎尖对激素种类和浓度需求各不相同，导致操作者要不断摸索调整激素种类和浓度用于柑橘茎尖培养，费时又费力，不利于大规模推广，本发明利用高糖MT培养基，在高糖浓度下，茎尖不易褐化，生长速度适中，也不会产生愈伤组织，保证了品种的遗传稳定性；本发明已在四个柑橘品种上均获得成功，未来可在多个柑橘品种上广泛应用；

[0038] （二）降低了微芽嫁接的难度：

[0039] 柑橘微芽嫁接技术取0.15～0.25mm茎尖，再嫁接到黄化苗的微小切口处，对操作者在体视镜下的技术要求很高，也很费眼力，嫁接成活率较低；本发明取0.15～0.25mm茎尖，茎尖在高温（40±0.5℃）钝化病毒的条件下进行正常生长，0.25mm茎尖28天后可以生长到0.5mm，再进行微芽嫁接，操作难度明显降低，嫁接的成活率显著提高，可由50%提升至90%以上；

[0040] （三）在茎尖培养同时也可钝化病毒，显著节省生产成本：

[0041] 前人研究对带毒柑橘进行脱毒热处理是先选择无明显病班、品种纯正的健壮植株,栽于盆中,置于玻璃温室或者大型人工气候箱内40℃处理16 h、35℃处理8 h、变温处理1～2月；再在新生嫩枝上进行茎尖剥离和微芽嫁接；玻璃温室或人工气候室热处理这一步
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因处理植株数量较大，需建设面积10m以上的玻璃温室或人工气候室，建设成本高，且运行要消耗大量电能，成本代价高；本方法对柑橘茎尖培养同时开展高温病毒钝化处理，切取
0.15～0.25mm柑橘茎尖放置于60mm培养皿，所用液体培养基仅需3ml，热处理在普通培养箱中进行，一个200L容量培养箱可以同时处理几百个不同样品，这种培养方法将免去生产单位专门建设热处理玻璃温室或人工气候室，且节省大量电能消耗，使用培养基量少，该发明大量节约硬件设施建设和运行成本，更符合当前节能减排的环保要求；

[0042] （四）应用前景：

[0043] 目前对柑橘茎尖培养普遍采用的MS培养基+植物激素，不同品种对于激素种类和浓度不尽相同，需要操作者花费很大精力针对不同品种摸索激素配方；本发明采用高糖MT培养基分别对爱媛28、莱维琳娜、春见、纽荷尔四个柑橘品种进行茎尖培养和微芽嫁接，不使用激素，均能高效获得再生柑橘苗，显著提高柑橘茎尖培养效率；我们在茎尖培养同时采用昼夜交替热处理钝化病毒，可免去生产单位建设热处理玻璃温室（或大型人工气候室）和大量电能消耗；该方法显著节本节能增效，有利于柑橘育苗的规模化生产。

附图说明

[0044] 图1为本发明实施例1中长出新芽的枝条外观照片图；

[0045] 图2为本发明实施例1中初代培养后的茎尖外观照片图；其中A为培养3天，B为培养4周；

[0046] 图3为本发明实施例1中的黄化小苗外观照片图；

[0047] 图4为本发明实施例1中微芽嫁接和嫁接后接穗芽长至0.5cm的外观照片图；图中，左图为完成微芽嫁接的嫁接苗，右图为接穗芽长至0.5cm的嫁接苗。

具体实施方式

[0048] 本发明实施例中采用的柑橘的品种为爱媛28、莱维琳娜、春见和纽荷尔.[0049] 本发明实施例中培养成活率95%以上。

[0050] 本发明实施例中的柑橘成年树枝条的外观无明显病斑且长势较好。

[0051] 本发明实施例中选取饱满健康的枳壳或枳橙种子。

[0052] 本发明实施例中暗培养的条件为24小时的25±0.5℃无光照培养。

[0053] 实施例1

[0054] （1）选取柑橘成年树枝条，剪去叶片，清洗表面尘土，然后切成7cm长的茎段；每个茎段上带有4个芽；

[0055] （2）将茎段先用酒精消毒30s，再用次氯酸钠溶液消毒25min，然后用无菌水清洗，最后用无菌滤纸吸干表面水分，获得消毒茎段；酒精的质量浓度为70%；次氯酸钠溶液的质量浓度为1%；无菌水清洗次数为5次；

[0056] （3）消毒茎段插入MS固体培养基中，再置于培养箱中进行枝条培养15天，使茎段长出新芽；培养箱的培养条件为光照强度1600Lux，24小时之内的16小时的25±0.5℃光照和8小时的25±0.5℃黑暗组成；

[0057] 长出新芽的茎段外观照片如图1所示；

[0058] （4）配制MT液体培养基溶液，其中蔗糖的质量浓度为8%，灭菌后分装；向培养皿中加入液体培养基溶液，制成液体培养基，用封口膜封好备用；灭菌后分装按100ml/瓶分装；培养皿为灭菌后的直径60mm玻璃培养皿；向培养皿中加入液体培养基溶液是在超净工作台中向若干个培养皿中加入液体培养基溶液；每个培养皿的加入量为3ml；

[0059] （5）新芽剥掉芽外部叶片，用无菌刀片切取长度为0.25mm的茎尖；将茎尖接种于液体培养基中，再置于培养箱中进行初代培养40天；操作者剥去新芽外部叶片，用无菌刀片切取茎尖是在超净工作台中放置体视镜，在体视镜下进行操作；培养箱的培养条件为光照强度1600Lux，24小时之内的16小时的40±0.5℃光照和8小时的30±0.5℃黑暗组成；

[0060] 初代培养后的茎尖培养3天和4周分别如图2A和2B所示；

[0061] （6）选取枳壳，剥去外种皮，先用酒精消毒30s，再用次氯酸钠溶液消毒25min，然后用无菌水清洗，获得消毒砧木种子；酒精的质量浓度为70%；次氯酸钠溶液的质量浓度为1%；无菌水清洗次数为5次；在超净工作台上进行消毒和清洗；

[0062] （7）将消毒砧木种子接种到含有MS固体培养基的试管中，暗培养14天，获得高度为7～8cm的黄化小苗；

[0063] 黄化小苗暗培养4、8、12和14天的外观照片如图3所示；

[0064] （8）选取根颈直径≥2mm的黄化小苗，置于灭菌培养皿上，切去茎上部，在离茎上端 4mm处切出T形切口；将完成初代培养的茎尖置于T形切口的中间，获得嫁接苗；在超净工作台上进行切口；

[0065] （9）在超净工作台上将嫁接苗置于培养箱中进行嫁接培养，至待接穗芽长至0.8cm 时，再二次嫁接于温室；培养箱的培养条件为光照强度1600Lux，24小时之内的16小时的25±0.5℃光照和8小时的25±0.5℃黑暗组成；

[0066] 微芽嫁接和嫁接后接穗芽长至0.5cm的外观照片如图4所示。

[0067] 实施例2

[0068] 方法同实施例1，不同点在于：

[0069] （1）切成6cm长的茎段，每个茎段上带有3个芽；

[0070] （2）酒精消毒25s，次氯酸钠溶液消毒20min；酒精的质量浓度为75%；次氯酸钠溶液的质量浓度为1.3%；无菌水清洗次数为4次；

[0071] （3）茎段培养13天，培养箱的光照强度2000Lux；

[0072] （4）MT液体培养基溶液中蔗糖的质量浓度为7.5%；

[0073] （5）新芽剥掉芽外部叶片，用无菌刀片切取长度为0.2mm的茎尖，初代培养30天；培养箱的光照强度2000Lux；

[0074] （6）选取枳橙种子，酒精消毒25s，次氯酸钠溶液消毒20min；酒精的质量浓度为75%；次氯酸钠溶液的质量浓度为1.3%；无菌水清洗次数为4次；

[0075] （7）暗培养13天，获得高度为6～7cm的黄化小苗；

[0076] （8）在离茎上端 3mm处切出T形切口；

[0077] （9）至待接穗芽长至0.5cm 时二次嫁接；培养箱的光照强度2000Lux。

[0078] 实施例3

[0079] 方法同实施例1，不同点在于：

[0080] （1）切成6.5cm长的茎段，每个茎段上带有3个芽；

[0081] （2）酒精消毒20s，次氯酸钠溶液消毒15min；酒精的质量浓度为80%；次氯酸钠溶液的质量浓度为1.5%；无菌水清洗次数为3次；

[0082] （3）茎段培养10天，培养箱的光照强度2200Lux；

[0083] （4）MT液体培养基溶液中蔗糖的质量浓度为7%；

[0084] （5）新芽剥掉芽外部叶片，用无菌刀片切取长度为0.15mm的茎尖生长点，初代培养25天；培养箱的光照强度2200Lux；

[0085] （6）选取枳橙种子，酒精消毒20s，次氯酸钠溶液消毒15min；酒精的质量浓度为80%；次氯酸钠溶液的质量浓度为1.5%；无菌水清洗次数为3次；

[0086] （7）暗培养15天，获得高度为8～9cm的黄化小苗；

[0087] （8）在离茎上端5mm处切出T形切口；

[0088] （9）至待接穗芽长至1cm 时二次嫁接；培养箱的光照强度2200Lux。