小分子抑制剂BAY87-2243在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途

摘要

本发明提供了小分子抑制剂BAY87‑2243在制备治疗乙型肝炎病毒感染的药物中的用途。本发明使用不同的稳定产生乙型肝炎病毒(HBV)的肝癌细胞系或HBV感染的人原代肝细胞通过不同浓度的BAY87‑2243体外处理实验证明了BAY87‑2243能显著抑制HBV转录和复制以及有效降低cccDNA表达水平。

权利要求

1.小分子抑制剂BAY87‑2243在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途；所述BAY87‑2243为HIF‑1特异性抑制剂。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是降低乙肝表面抗原产生水平的药物。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是降低乙肝e抗原产生水平的药物。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是抑制乙型肝炎病毒转录的药物。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是抑制乙型肝炎病毒DNA复制的药物。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是降低乙型肝炎病毒cccDNA表达水平的药物。

7.根据权利要1～6任一项所述的用途，其特征在于，所述药物是以小分子抑制剂BAY87‑2243为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

8.根据权利要7所述的用途，其特征在于，所述制剂为口服制剂。

9.根据权利要8所述的用途，其特征在于，所述口服制剂为颗粒剂、溶液剂、丸剂、膏剂或片剂。

说明书

小分子抑制剂BAY87‑2243在制备治疗乙型肝炎的药物中的

用途

技术领域

[0001] 本发明涉及小分子抑制剂BAY87‑2243在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途背景技术

[0002] 乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的以肝脏病变为主的一种传染病。临床上以食欲减退、恶心、上腹部不适、肝区痛、乏力为主要表现。部分患者可有黄疸发热和肝大伴有肝功能损害。有些患者可慢性化，甚至发展成肝硬化，少数可发展为肝癌。

[0003] 目前核苷(酸)类似物和干扰素治疗慢性HBV感染的效果十分有限，只有少数患者能实现“功能性治愈”。要实现慢性乙肝病毒感染治愈的关键在于必须彻底清除宿主肝细胞内共价闭合环状DNA(cccDNA)，它是HBV转录复制的模板和病毒基因储存库，也是慢乙肝患者停药后复发的关键诱因。目前临床上仍缺乏有效清除cccDNA的药物，因此寻找和开发有效清除乙肝病毒cccDNA的药物具有良好的临床应用前景。

[0004] 小分子抑制剂BAY87‑2243是一种有效的选择性hypoxia‑inducible factor‑1(HIF‑1)抑制剂。目前有研究报道其通过干扰线粒体功能抑制肿瘤细胞增殖，可用治疗肺癌等癌症，也有报道研究，其对肠道黏膜屏障(IMB)功能有积极影响，可用于治疗脓毒症。目前还没有BAY87‑2243用于治疗乙型肝炎的报道。

发明内容

[0005] 为解决上述问题，本发明提供了小分子抑制剂BAY87‑2243在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途；所述BAY87‑2243为HIF‑1特异性抑制剂。

[0006] 进一步地，所述药物是降低乙肝表面抗原产生水平的药物。

[0007] 进一步地，所述药物是降低乙肝e抗原产生水平的药物。

[0008] 进一步地，所述药物是抑制乙型肝炎病毒转录的药物。

[0009] 进一步地，所述药物是抑制乙型肝炎病毒DNA复制的药物。

[0010] 进一步地，所述药物是降低乙型肝炎病毒cccDNA表达水平的药物。

[0011] 进一步地，所述药物是以小分子抑制剂BAY87‑2243为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

[0012] 更进一步地，所述制剂为口服制剂；所述口服制剂为颗粒剂、溶液剂、丸剂、膏剂或片剂。

[0013] 本发明小分子抑制剂BAY87‑2243在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途，经试验证明小分子抑制剂BAY87‑2243能显著抑制HBV转录和复制，以及有效降低cccDNA表达水平，使彻底消除乙肝患者病毒携带状态成为可能，最终实现抗病毒治疗的目标，具备实际推广应用前景。

[0014] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0015] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0016] 图1BAY87‑2243处理对HBsAg/HBeAg分泌的研究数据统计图(A:不同浓度BAY87‑2243处理对HepAD38细胞毒性以及分泌HBsAg的影响,B:不同浓度BAY87‑2243处理对HepG2.2.15细胞毒性以及分泌HBsAg的影响,C:不同浓度BAY87‑2243处理对HepAD38细胞毒性以及分泌HBeAg的影响,D:不同浓度BAY87‑2243处理对HepG2.2.15细胞毒性以及分泌HBeAg的影响)

[0017] 图2BAY87‑2243处理对HBV转录和复制水平以及HBV cccDNA表达水平影响的研究数据统计图(A:BAY87‑2243处理对HepAD38细胞内HBV总RNA表达水平的影响,B:BAY87‑2243处理对HepAD38细胞内HBVpgRNA表达水平的影响,C:BAY87‑2243处理对HepAD38细胞内HBVDNA复制水平的影响,D:BAY87‑2243处理对HepAD38细胞内HBVcccDNA表达水平的影响)图3在HBV感染的人原代肝细胞中，BAY87‑2243处理对HBV转录和复制水平以及HBV cccDNA表达水平影响的统计图(A:BAY87‑2243处理对HBsAg分泌的影响,B：BAY87‑2243处理对HBeAg分泌的影响,C:BAY87‑2243处理对HBV总RNA表达水平的影响,D:BAY87‑2243处理对HBVpgRNA表达水平的影响,E：BAY87‑2243处理对细胞内HBVDNA表达水平的影响,F:BAY87‑2243处理对细胞内HBV cccDNA表达水平的影响)

具体实施方式

[0018] 实施例1 BAY87‑2243对稳定产生HBV的肝癌细胞中HBsAg/HBeAg分泌的影响研究[0019] 首先，将8×104个/孔HepG2.215和HepAD38细胞分别接种于48孔板。在细胞铺板后第二天，使用不同浓度梯度(0.01‑100nM)的BAY87‑2243分别处理细胞。在BAY87处理细胞72h后，对48孔板加入Cell Counting Kit‑8试剂(MedChemExpress，HY‑K0301)，通过多功能酶标仪在450nm波长下检测细胞吸光度的变化。此外，收集细胞上清液使用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法；上海科华，SI0910113)和乙型肝炎病毒E抗原检测试剂盒(酶联免疫法；上海科华，20163400144)分别检测细胞上清中分泌的HBsAg和HBeAg水平。具体酶标仪检测结果和ELISA试剂盒检测结果见图1A‑D。从图结果可见：BAY87‑2243浓度在
100nM时内对细胞毒性的影响较小，且较低浓度(<0.1nM)的BAY87‑2243能有效抑制HBsAg和HBeAg分泌。

[0020] 实施例2 BAY87‑2243对HepAD38细胞中HBV转录和复制水平以及HBV cccDNA表达水平的影响研究

[0021] 将3×105个/孔HepAD38细胞接种于12孔板，第二天用不同浓度梯度(1、2或4nM)的BAY87处理72h，然后使用Trizol试剂(Invitrogen，15596026)提取细胞内总RNA，使用One‑TMstep Realtime RT‑qPCR试剂盒[One Step TB PrimeScript  RT‑PCR Kit II(Perfect Real Time)，TaKaRa，RR086]检测细胞内HBV total RNA(图2A)和pgRNA(图2B)的表达水平。从图结果可见：不同浓度的BAY87‑2243处理能显著降低细胞内HBV总RNA和pgRNA表达水平，说明BAY87‑2243能有效抑制细胞内HBV转录。

[0022] 将6×105个/孔HepAD38细胞接种于6孔板，第二天用不同浓度梯度(1、2或4nM)的BAY87‑2243处理72h，裂解细胞并提取细胞内被核衣壳包裹的HBV DNA，通过Southern blot方法检测BAY87‑2243对细胞内HBV DNA复制水平的影响。具体结果见图2C。从图结果可见：不同浓度的BAY87‑2243处理均能显著降低细胞内HBV DNA复制水平，提示BAY87‑2243能有效抑制细胞内HBVDNA复制。

[0023] 将6×105个/孔HepAD38细胞接种于6孔板，第二天用不同浓度梯度(1、2或4nM)的BAY87‑2243处理96h。然后用PBS洗细胞2次，裂解细胞过夜，用酚氯仿抽提DNA，最后将得到的cccDNA用T5核酸外切酶进行酶切反应，用Realtime qPCR( Probe qPCR Master Mix，promega，A6101)检测细胞内HBV cccDNA表达水平。具体结果见图2D。从图结果可见：不同浓度的BAY87‑2243处理均能显著降低细胞内HBV cccDNA表达水平，提示BAY87‑2243可有效降低细胞内HBVcccDNA表达水平。

[0024] 实施例3 BAY87‑2243对HBV感染的人原代肝细胞中HBV转录和复制水平以及HBV cccDNA表达水平影响的研究

[0025] 将商品化的人原代细胞按5×105个/孔接种于12孔板，在细胞铺板后第二天，将细胞与含有HBV病毒颗粒(MOI：1000)的William's E完全培养基孵育；在HBV感染24h后，将细胞用PBS洗3次，然后用不同浓度梯度(2nM和4nM)的BAY87‑2243连续处理6天。收集细胞上清液，然后使用(乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)和乙型肝炎病毒E抗原检测试剂盒(酶联免疫法)分别收集细胞上清后检测细胞上清中分泌的HBsAg和HBeAg水平，具体结果见图3A‑B；从图结果可见：BAY87‑2243能有效抑制HBsAg和HBeAg分泌。

[0026] 对如图3A‑B相同处理的细胞用PBS洗细胞2次，然后使用Trizol试剂提取细胞内总RNA，使用One‑step Realtime RT‑qPCR试剂盒检测细胞内HBV total RNA(图3C)和pgRNA(图3D)的表达水平。从图结果可见：不同浓度的BAY87‑2243处理能显著降低肝细胞内HBV总RNA和pgRNA表达水平，说明BAY87‑2243能有效抑制人原代肝细胞内HBV转录。

[0027] 对如图3A‑B相同处理的细胞用PBS洗细胞2次，裂解细胞并用酚‑氯仿抽提细胞内TM被核衣壳包裹的HBV DNA，通过Realtime qPCR(TB  Premix Ex Taq  II(Tli RNaseH Plus)，TaKaRa，RR820)检测BAY87‑2243对细胞内HBV DNA表达水平的影响。具体结果见图3E。从图结果可见：BAY87‑2243处理能显著降低细胞内HBV DNA表达水平，提示BAY87‑2243能有效抑制人原代肝细胞内HBVDNA复制。

[0028] 对如图3A‑B相同处理的细胞用PBS洗细胞2次，裂解细胞然后用酚氯仿抽提DNA，最后将得到的cccDNA用T5核酸外切酶进行酶切反应，用Realtime qPCR( Probe qPCR Master Mix，promega，A6101)检测细胞内HBV cccDNA表达水平。具体结果见图3F。从图结果可见：BAY87‑2243处理能显著降低细胞内HBV cccDNA表达水平，提示BAY87‑2243可有效降低人原代肝细胞内HBV cccDNA表达水平。

[0029] 综上，本发明经一系列试验证明小分子抑制剂BAY87‑2243能显著抑制HBV转录和复制，以及有效降低cccDNA表达水平，使彻底消除乙肝患者病毒携带状态成为可能，最终实现抗病毒治疗的目标，具备实际推广应用前景。