一种光响应型双功能磁性材料的制备方法及应用

摘要

本发明适用于磁性材料合成技术领域，提供了一种光响应型双功能磁性材料的制备方法，包括如下步骤（1）、合成二乙烯基苯和偶氮苯修饰的Fe3O4磁性微球magDVS‑Azo；步骤（2）、合成苯硼酸修饰的β－环糊精CD‑VBA；步骤（3）、合成磁性二乙烯基苯－偶氮苯－环糊精－苯硼酸主客体复合物magDVS‑Azo@CD‑VBA。本发明中的一种光响应型双功能磁性材料的制备方法及应用，本制备方法可靠，材料性能稳定，苯硼酸和二乙烯基苯的引入显著提高了磁性吸附材料对目标肽段的富集效率。采用该磁性材料作为分离预富集物质，适用于复杂生物样品（如细胞组织液）中糖基化肽段和棕榈酰化肽段的分析，证明了其在蛋白组学的分离和磁性固相萃取领域具有优良的应用潜能。

权利要求

1.一种光响应型双功能磁性材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1）、合成二乙烯基砜和偶氮苯修饰的Fe3O4磁性微球magDVS‑Azo；

所述步骤（1）拆分为如下步骤：

步骤（11）、称取1.35g的FeCl3·6H2O溶于75mL EG中，搅拌均匀后，加入3.60g NaAc继续搅拌至产生黄色粘稠溶液，将混合液移至高压水热反应釜中，在200 ℃条件下加热16h，得到相应的产物，产物依次经乙醇和纯水分别冲洗三次，磁吸分离得到Fe3O4微球；

步骤（12）、称取350mg Fe3O4微球均匀分散于含220mL乙醇、55mL水和1.4mL质量分数为

25wt%的NH3·H2O的混合溶剂中，充分混匀后，向混合液中加入1mL TEOS，室温下搅拌12h，磁吸分离得到硅烷化的磁性微球magTEOS；

步骤（13）、取100mg磁性微球magTEOS分散到30mL乙醇中，加入2.5mL TSD，室温下搅拌

1h，磁吸分离得到氨基化的磁性微球magTSD；

步骤（14）、称取100mg DVS、100mg Azo‑Cl、345mg EDC和243mg HOBT，依次加入到20mL DMF和600μL DIPEA的混合溶液中，充分混匀后，加入磁性微球magTSD，室温下搅拌24h，依次用DMF和纯水清洗产物，磁吸分离得到终产物magDVS‑Azo；

步骤（2）、合成苯硼酸修饰的β－环糊精CD‑VBA；

所述步骤（2）拆分为如下步骤：

步骤（21）、以β‑CD和对甲苯磺酰氯TsCL为原料，制备得到mono‑6‑OTs‑β‑CD；

步骤（22）、称取4.0g mono‑6‑OTs‑β‑CD和4.4 g硫脲在200mL 体积比为80:20的MeOH/H2O中，将其在70ºC条件下回流2天，得到6‑SH‑β‑CD；

步骤（23）、称取100mg 6‑SH‑β‑CD在20mL、50 mmol/L的吗啉乙基磺酸缓冲液5mg DMPA中活化30 min，将80mg VBA分散于得到的混合物中，在紫外线照射下照射6h，最后在60℃真空干燥后，得到β－环糊精CD‑VBA；

步骤（3）、合成磁性二乙烯基砜－偶氮苯－环糊精－苯硼酸主客体复合物magDVS‑Azo@CD‑VBA；

所述步骤（3）拆分为如下步骤：

步骤（31）、将10mg magDVS‑Azo和10mg CD‑VBA在纯水中密封，放入装有450nm紫外灯的培养箱中，在25℃黑暗条件下，孵育20min；

步骤（32）、将孵育的产物依次进行离心、洗涤和干燥，得到magDVS‑Azo@CD‑VBA。

2.一种如权利要求1所述制备方法制备的光响应型双功能磁性材料在糖基化蛋白组学和棕榈酰化蛋白组学分析中的应用。

说明书

一种光响应型双功能磁性材料的制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于磁性材料合成技术领域，尤其涉及一种光响应型双功能磁性材料的制备方法及应用。

背景技术

[0002] 作为生命体中最复杂、最重要的翻译后修饰(PTM)，蛋白质糖基化和棕榈酰化在特定生物过程中发挥着至关重要的作用。虽然糖基化蛋白质和棕榈酰化蛋白质在生物体细胞中广泛分布，但是，由于蛋白质的PTM过程中出现宏观不均一性与微观不均一性，通过质谱分析直接对其进行检测依旧面临着许多挑战，特异性强、操作简单、灵敏度高的糖基化肽段和棕榈酰化肽段的前处理平台已经成为研究热点。

[0003] 磁性固相萃取技术具备操作流程简单、磁响应能力强、易于实现快速分离等优点，目标肽段可以直接与磁性微球反应，非特异性吸附少，可以更好地达到富集纯化的目的，另外，磁性微球易于观测，可保证实验操作的重复性；但现有制备的磁性富集材料缺少活性位点、灵敏度低且富集能力单一。

[0004] 因此，针对以上现状，迫切需要开发一种光响应型双功能磁性材料的制备方法及应用，以克服当前实际应用中的不足。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的不足，本发明实施例的目的在于提供一种光响应型双功能磁性材料的制备方法及应用，以解决上述背景技术中的问题。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0007] 一种光响应型双功能磁性材料的制备方法，包括如下步骤：

[0008] 步骤(1)、合成二乙烯基苯和偶氮苯修饰的Fe3O4磁性微球magDVS‑Azo；

[0009] 步骤(2)、合成苯硼酸修饰的β－环糊精CD‑VBA；

[0010] 步骤(3)、合成磁性二乙烯基苯－偶氮苯－环糊精－苯硼酸主客体复合物magDVS‑Azo@CD‑VBA。

[0011] 作为本发明进一步的技术方案，所述步骤(1)可拆分为如下步骤：

[0012] 步骤(11)、称取1.35g的FeCl3·6H2O溶于75mLEG中，搅拌均匀后，加入3.60gNaAc继续搅拌至产生黄色粘稠溶液，将混合液移至高压水热反应釜中，在200℃条件下加热16h，得到相应的产物，产物依次经乙醇和纯水分别冲洗三次，磁吸分离得到Fe3O4微球；

[0013] 步骤(12)、称取350mgFe3O4微球均匀分散于含220mL乙醇、55mL水和1.4mLNH3·H2O(25wt％)的混合溶剂中，充分混匀后，向混合液中加入1mLTEOS，室温下搅拌12h，磁吸分离得到硅烷化的磁性微球magTEOS；

[0014] 步骤(13)、取100mg磁性微球magTEOS分散到30mL乙醇中，加入2.5mLTSD，室温下搅拌1h，磁吸分离得到氨基化的磁性微球magTSD；

[0015] 步骤(14)、称取100mgDVS、100mgAzo‑Cl、345mgEDC和243mgHOBT，依次加入到20mLDMF和600μLDIPEA的混合溶液中，充分混匀后，加入磁性微球magTSD，室温下搅拌24h，依次用DMF和纯水清洗产物，磁吸分离得到终产物magDVS‑Azo。

[0016] 作为本发明进一步的技术方案，所述步骤(2)可拆分为如下步骤：

[0017] 步骤(21)、以β‑CD和对甲苯磺酰氯TsCL为原料，制备得到mono‑6‑OTs‑β‑CD；

[0018] 步骤(22)、称取4.0gmono‑6‑OTs‑β‑CD和4.4g硫脲在200mLMeOH/H2O(80：20，v/v)中，将其在70℃条件下回流2天，得到6‑SH‑β‑CD；

[0019] 步骤(23)、称取100mg6‑SH‑β‑CD在20mL吗啉乙基磺酸缓冲液(50mmol L‑1)和5mgDMPA中活化30min，将80mgVBA分散于得到的混合物中，在紫外线照射下照射6h，最后在
60℃真空干燥后，得到β－环糊精CD‑VBA。

[0020] 作为本发明进一步的技术方案，所述步骤(3)可拆分为如下步骤：

[0021] 步骤(31)、将10mgmagDVS‑Azo和10mgCD‑VBA在纯水中密封，放入装有450nm紫外灯的培养箱中，在25℃黑暗条件下，孵育20min；

[0022] 步骤(32)、将孵育的产物依次进行离心、洗涤和干燥，得到magDVS‑Azo@CD‑VBA。

[0023] 作为本发明进一步的技术方案，在可见光下，偶氮苯分子为trans结构，形成magDVS‑Azo@CD‑VBA，此时，磁性纳米粒子外表面带有大量的苯硼酸基团，可以实现对糖基化肽的富集。

[0024] 作为本发明进一步的技术方案，在紫外光下，偶氮苯分子为cis结构，β‑CD与偶氮苯分子之间的主客体作用被破坏，CD‑VBA从磁性纳米粒子表面脱离，磁性纳米粒子外表面包覆DVS，DVS表面带有三硫基，可以实现对棕榈酰化肽的富集。

[0025] 作为本发明进一步的技术方案，一种光响应型双功能磁性材料在糖基化蛋白组学和棕榈酰化蛋白组学分析中的应用。

[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0027] 本发明利用β－环糊精与偶氮苯之间的主客体作用，设计能够在可见光与紫外光转换过程中实现可逆自组装/解组装的光响应磁性材料，然后在磁性材料表面修饰苯硼酸和二乙烯基苯分别用于糖基化肽段和棕榈酰化肽段的特异性识别，本发明所提供的制备方法可靠，材料性能稳定，苯硼酸和二乙烯基苯的引入显著提高了磁性吸附材料对目标肽段的富集效率。采用该磁性材料作为分离预富集物质，适用于复杂生物样品(如细胞组织液)中糖基化肽段和棕榈酰化肽段的分析，证明了其在蛋白组学的分离和磁性固相萃取领域具有优良的应用潜能。

[0028] 为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。

附图说明

[0029] 图1为本发明实施例1制备的magDVS‑Azo@CD‑VBA(a)和magDVS‑Azo(b)材料的扫描电镜图。

[0030] 图2为本发明实施例1制备的magDVS‑Azo@CD‑VBA和magDVS‑Azo材料的磁滞回线谱图。

[0031] 图3为本发明实施例1制备的magDVS‑Azo@CD‑VBA材料检测糖基化肽段的质谱图。

[0032] 图4为本发明实施例1制备的magDVS‑Azo材料检测棕榈酰化肽段的质谱图。

具体实施方式

[0033] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0034] 以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

[0035] 实施例1

[0036] 一种光响应型双功能磁性材料的制备方法，包括如下步骤：

[0037] 步骤(1)、合成二乙烯基苯和偶氮苯修饰的Fe3O4磁性微球magDVS‑Azo：

[0038] 以1.20gFeCl3·6H2O和3.60gNaAc溶于75mLEG，将混合液移至高压水热反应釜中，在200℃条件下加热16h，洗涤、分离、干燥得到Fe3O4微球；向含350mgFe3O4微球、220mL乙醇、55mL水和1.4mL氨水的混合液中加入1mLTEOS，室温下搅拌12h，洗涤、分离、干燥得到magTEOS；向含100mgmagTEOS的30mL乙醇中加入2.5mLTSD，室温下搅拌1h，洗涤、分离、干燥得到magTSD；向20mLDMF和600μLDIPEA的混合液中依次加入100mgDVS、200mgmagTSD、
100mgAzo‑Cl、345mgEDC和243mgHOBT，室温下搅拌24h，洗涤、分离和干燥得到magDVS‑Azo；

[0039] 步骤(2)、合成苯硼酸修饰的β－环糊精CD‑VBA：

[0040] 以β‑CD和TsCL为原料制备6‑OTs‑β‑CD；4.0g6‑OTs‑β‑CD和4.4g硫脲在200mL MeOH/H2O(80：20，v/v)中70℃回流2天，得到TCD；称取100mgTCD在20mL吗啉乙基磺酸缓冲液和5mgDMPA中活化30min，加入80mgVBA，紫外照射6h，洗涤、分离、干燥得到CD‑VBA；

[0041] 步骤(3)、合成磁性二乙烯基苯－偶氮苯－环糊精－苯硼酸主客体复合物magDVS‑Azo@CD‑VBA：

[0042] 将10mgmagDVS‑Azo和10mgCD‑VBA在纯水中密封，放入530nm紫外培养箱中，25℃黑暗孵育20min，离心、洗涤、干燥得到magDVS‑Azo@CD‑VBA。通过扫描电镜表征magDVS‑Azo@CD‑VBA材料。

[0043] 实施例2

[0044] 一种光响应型双功能磁性材料的制备方法，包括如下步骤：

[0045] 步骤(1)、合成二乙烯基苯和偶氮苯修饰的Fe3O4磁性微球magDVS‑Azo：

[0046] 以1.20gFeCl3·6H2O和3.60gNaAc溶于75mLEG，将混合液移至高压水热反应釜中，在200℃条件下加热6h，洗涤、分离、干燥得到Fe3O4微球；向含350mgFe3O4微球、220mL乙醇、55mL水和1.4mL氨水的混合液中加入1mLTEOS，室温下搅拌12h，洗涤、分离、干燥得到magTEOS；向含100mgmagTEOS的30mL乙醇中加入2.5mLTSD，室温下搅拌1h，洗涤、分离、干燥得到magTSD；向20mLDMF和600μLDIPEA的混合液中依次加入100mgDVS、200mgmagTSD、
100mgAzo‑Cl、345mgEDC和243mgHOBT，室温下搅拌24h，洗涤、分离和干燥得到magDVS‑Azo；

[0047] 步骤(2)、合成苯硼酸修饰的β－环糊精CD‑VBA：

[0048] 以β‑CD和TsCL为原料制备6‑OTs‑β‑CD；4.0g6‑OTs‑β‑CD和4.4g硫脲在200mL MeOH/H2O(80：20，v/v)中70℃回流2天，得到TCD；称取100mgTCD在20mL吗啉乙基磺酸缓冲液和5mgDMPA中活化30min，加入80mgVBA，紫外照射6h，洗涤、分离、干燥得到CD‑VBA；

[0049] 步骤(3)、合成磁性二乙烯基苯－偶氮苯－环糊精－苯硼酸主客体复合物magDVS‑Azo@CD‑VBA：

[0050] 将10mgmagDVS‑Azo和10mgCD‑VBA在纯水中密封，放入530nm紫外培养箱中，25℃黑暗孵育20min，离心、洗涤、干燥得到magDVS‑Azo@CD‑VBA。通过扫描电镜表征magDVS‑Azo@CD‑VBA材料。

[0051] 实施例3

[0052] 一种光响应型双功能磁性材料的制备方法，包括如下步骤：

[0053] 步骤(1)、合成二乙烯基苯和偶氮苯修饰的Fe3O4磁性微球magDVS‑Azo：

[0054] 以2.0gFeCl3·6H2O和4.0gNaAc溶于75mLEG，将混合液移至高压水热反应釜中，在200℃条件下加热16h，洗涤、分离、干燥得到Fe3O4微球；向含350mgFe3O4微球、220mL乙醇、
55mL水和1.4mL氨水的混合液中加入1mLTEOS，室温下搅拌12h，洗涤、分离、干燥得到magTEOS；向含100mgmagTEOS的30mL乙醇中加入2.5mLTSD，室温下搅拌1h，洗涤、分离、干燥得到magTSD；向20mLDMF和600μLDIPEA的混合液中依次加入100mgDVS、200mgmagTSD、
100mgAzo‑Cl、345mgEDC和243mgHOBT，室温下搅拌24h，洗涤、分离和干燥得到magDVS‑Azo；

[0055] 步骤(2)、合成苯硼酸修饰的β－环糊精CD‑VBA：

[0056] 以β‑CD和TsCL为原料制备6‑OTs‑β‑CD；4.0g6‑OTs‑β‑CD和4.4g硫脲在200mL MeOH/H2O(80：20，v/v)中70℃回流2天，得到TCD；称取100mgTCD在20mL吗啉乙基磺酸缓冲液和5mgDMPA中活化30min，加入80mgVBA，紫外照射6h，洗涤、分离、干燥得到CD‑VBA；

[0057] 步骤(3)、合成磁性二乙烯基苯－偶氮苯－环糊精－苯硼酸主客体复合物magDVS‑Azo@CD‑VBA：

[0058] 将10mgmagDVS‑Azo和10mgCD‑VBA在纯水中密封，放入530nm紫外培养箱中，25℃黑暗孵育20min，离心、洗涤、干燥得到magDVS‑Azo@CD‑VBA。通过扫描电镜表征magDVS‑Azo@CD‑VBA材料。

[0059] 实施例4

[0060] 一种光响应型双功能磁性材料的制备方法，包括如下步骤：

[0061] 步骤(1)、合成二乙烯基苯和偶氮苯修饰的Fe3O4磁性微球magDVS‑Azo：

[0062] 以1.20gFeCl3·6H2O和3.60gNaAc溶于75mLEG，将混合液移至高压水热反应釜中，在200℃条件下加热8h，洗涤、分离、干燥得到Fe3O4微球；向含350mgFe3O4微球、220mL乙醇、55mL水和1.4mL氨水的混合液中加入1mLTEOS，室温下搅拌12h，洗涤、分离、干燥得到magTEOS；向含100mgmagTEOS的30mL乙醇中加入2.5mLTSD，室温下搅拌1h，洗涤、分离、干燥得到magTSD；向20mLDMF和600μLDIPEA的混合液中依次加入100mgDVS、200mgmagTSD、
100mgAzo‑Cl、345mgEDC和243mgHOBT，室温下搅拌24h，洗涤、分离和干燥得到magDVS‑Azo；

[0063] 步骤(2)、合成苯硼酸修饰的β－环糊精CD‑VBA：

[0064] 以β‑CD和TsCL为原料制备6‑OTs‑β‑CD；4.0g6‑OTs‑β‑CD和4.4g硫脲在200mL MeOH/H2O(80：20，v/v)中70℃回流2天，得到TCD；称取100mgTCD在20mL吗啉乙基磺酸缓冲液和5mgDMPA中活化30min，加入80mgVBA，紫外照射6h，洗涤、分离、干燥得到CD‑VBA；

[0065] 步骤(3)、合成磁性二乙烯基苯－偶氮苯－环糊精－苯硼酸主客体复合物magDVS‑Azo@CD‑VBA：

[0066] 将10mgmagDVS‑Azo和10mgCD‑VBA在纯水中密封，放入530nm紫外培养箱中，25℃黑暗孵育20min，离心、洗涤、干燥得到magDVS‑Azo@CD‑VBA。通过扫描电镜表征magDVS‑Azo@CD‑VBA材料。

[0067] 实施例5

[0068] 一种光响应型双功能磁性材料的制备方法，包括如下步骤：

[0069] 步骤(1)、合成二乙烯基苯和偶氮苯修饰的Fe3O4磁性微球magDVS‑Azo：

[0070] 以1.20gFeCl3·6H2O和3.60gNaAc溶于75mLEG，将混合液移至高压水热反应釜中，在200℃条件下加热12h，洗涤、分离、干燥得到Fe3O4微球；向含350mgFe3O4微球、220mL乙醇、55mL水和1.4mL氨水的混合液中加入1mLTEOS，室温下搅拌12h，洗涤、分离、干燥得到magTEOS；向含100mgmagTEOS的30mL乙醇中加入2.5mLTSD，室温下搅拌1h，洗涤、分离、干燥得到magTSD；向20mLDMF和600μLDIPEA的混合液中依次加入100mgDVS、200mgmagTSD、
100mgAzo‑Cl、345mgEDC和243mgHOBT，室温下搅拌24h，洗涤、分离和干燥得到magDVS‑Azo；

[0071] 步骤(2)、合成苯硼酸修饰的β－环糊精CD‑VBA：

[0072] 以β‑CD和TsCL为原料制备6‑OTs‑β‑CD；4.0g6‑OTs‑β‑CD和4.4g硫脲在200mL MeOH/H2O(80：20，v/v)中70℃回流2天，得到TCD；称取100mgTCD在20mL吗啉乙基磺酸缓冲液和5mgDMPA中活化30min，加入80mgVBA，紫外照射6h，洗涤、分离、干燥得到CD‑VBA；

[0073] 步骤(3)、合成磁性二乙烯基苯－偶氮苯－环糊精－苯硼酸主客体复合物magDVS‑Azo@CD‑VBA：

[0074] 将10mgmagDVS‑Azo和10mgCD‑VBA在纯水中密封，放入530nm紫外培养箱中，25℃黑暗孵育20min，离心、洗涤、干燥得到magDVS‑Azo@CD‑VBA。通过扫描电镜表征magDVS‑Azo@CD‑VBA材料。

[0075] 具体实验例

[0076] 以实施例1～5制备的magTEOS、magDVS‑Azo@CD‑VBA、magDVS‑Azo三种材料对样品中的糖基化肽段和棕榈酰辅酶A标准样品进行检测。

[0077] 质谱条件：所有待测样品均用ABSciex5800型飞行时间质谱仪进行测试，选用正离子模式，基质采用含25mg/mLDHB的70％ACN+1％H3PO4溶液；

[0078] 测试前，取待测样品与DHB基质溶液各0.5μL，均匀混合后滴于质谱仪的靶板表面。质谱仪的其它参数设置如下：离子源温度110℃、电喷雾电压2.3kV、扫描范围1000～3500m/z、毛细管电压3500V和碰撞解离能量：10eV；

[0079] 样品制备：糖基化标准品、称取1mgHRP冻干粉标准品，溶解于1mLNH4HCO3缓冲溶液(50mmol/L)中，在100℃金属浴中加热10min使蛋白质发生热变性，随后冷却至室温，加入1mg/mLTrypsin(β‑casein：Trypsin＝50：1，w/w)，在37℃水浴中酶解16h，待样品溶液冷却至室温后，加入2μL甲酸终止酶解反应；

[0080] 棕榈酰化标准品：称取1mgOVA冻干粉标准品，酶解步骤如上，终止酶解后，在OVA酶解液中加入棕榈酰辅酶A(OVA：Palmityl‑CoA＝500：1)；

[0081] 富集过程：称取5mg磁性材料，用1mL纯水和溶剂A(50％ACN‑H2O+0.1％TFA)分别洗涤三次，再将其分散在1mL溶剂A中备用。

[0082] 本实验采用典型的MSPE前处理步骤，依次为上样、清洗和解析；

[0083] 首先，取20μL上述材料储备液加入到100μL样品溶液中(所需的不同浓度的样品均用溶剂A进行稀释)，用恒温振荡器在室温下振荡45min后，磁吸分离样品与材料，除去溶剂后，每次用100μL溶剂A对材料反复洗涤三次，以清洗去除非目标肽段；最后，在清洗过的材料中加入30μL洗脱液，在室温下振荡20min，磁吸分离材料并收集洗脱液以用于后续分析。

[0084] 试验分析结果

[0085]

[0086] 表1

[0087] 实验结果显示，在实施例的用料比例及操作条件下所合成的光响应型双功能磁性材料，对样品中糖基化肽段和棕榈酰化肽段的富集效果最好。

[0088] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。