同位素稀释高分辨气相色谱-高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中二噁英类物质的方法

摘要

本发明公开了一种同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中二噁英类物质的方法，具有以下步骤：①将咪鲜胺原药溶解在混合溶剂中，然后加入提取内标EPA 1613 LCS，接着用酸性硅胶吸附咪鲜胺，从而将二噁英类物质分离提取出来，得到提取液；②对提取液进行净化，得到净化液；③对净化液进行处理，得到样品溶液；④采用高分辨气相色谱‑高分辨双聚焦磁质谱联用仪测定样品溶液中的二噁英类物质。本发明的方法灵敏度高、准确度高、方便快捷，可用于咪鲜胺原药中二噁英类物质的定量检测，弥补了本领域的空白，具有重大意义。

权利要求

1.一种同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中二噁英类物质的方法，其特征在于具有以下步骤：①将咪鲜胺原药溶解在混合溶剂中，然后加入提取内标EPA 1613 LCS，接着用酸性硅胶吸附咪鲜胺，从而将二噁英类物质分离提取出来，得到提取液；所述混合溶剂为正己烷+二氯甲烷；所述正己烷与所述二氯甲烷的体积比为5∶1；所述酸性硅胶为44%硫酸‑中性硅胶；

②对步骤①得到的提取液进行净化，得到净化液；

③对步骤②得到的净化液进行处理，得到样品溶液；

④采用高分辨气相色谱‑高分辨双聚焦磁质谱联用仪测定步骤③得到的样品溶液中的二噁英类物质。

2.根据权利要求1所述的同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中二噁英类物质的方法，其特征在于：上述步骤①中，所述咪鲜胺原药与所述混合溶剂的重量体积比为1∶10～1∶50g/mL；所述咪鲜胺原药与所述酸性硅胶的重量比为1∶4～1∶6。

3.根据权利要求1或2所述的同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中二噁英类物质的方法，其特征在于：上述步骤②中所述净化为多层硅胶柱净化+活性炭硅胶柱净化。

4.根据权利要求3所述的同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中二噁英类物质的方法，其特征在于所述多层硅胶柱净化的装柱方法为干法装柱具体如下：从下到上依次装填玻璃棉、4g无水硫酸钠、3g中性硅胶、5g碱性硅胶、2g中性硅胶、10g酸性硅胶、2g中性硅胶、4g无水硫酸钠；所述多层硅胶柱净化的步骤如下：先用40mL正己烷淋洗多层硅胶柱，然后将步骤①得到的提取液转移到多层硅胶柱，再用120mL正己烷淋洗多层硅胶柱，收集淋洗液并浓缩，得到初净化液。

5.根据权利要求3所述的同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中二噁英类物质的方法，其特征在于所述活性炭硅胶柱净化的装柱方法为：在斜拉管一端垫一元硬币厚度玻璃棉，压实后装入1g活性炭硅胶，再垫入一元硬币厚度玻璃棉压实；所述活性炭硅胶柱净化的步骤如下：先用40mL正己烷淋洗活性炭硅胶柱，然后将多层硅胶柱净化得到的初净化液转移到活性炭硅胶柱上，再用25mL正己烷淋洗活性炭硅胶柱，接着用

40mL正己烷‑二氯甲烷混合溶剂淋洗活性炭硅胶柱，然后翻转活性炭硅胶柱，用60mL甲苯淋洗活性炭硅胶柱，收集该甲苯淋洗液并浓缩，得到净化液。

6.根据权利要求1或2所述的同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中二噁英类物质的方法，其特征在于：上述步骤③中所述处理是将步骤②得到的净化液用二氯甲烷定量转移至2mL全回收进样瓶中，然后用全自动氮空吹扫浓缩仪吹除多余的溶剂，浓缩至近干，接着添加0.5ng进样内标EPA 1613 ISS，最后用壬烷定容至25μL，作为样品溶液。

7.根据权利要求1或2所述的同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中二噁英类物质的方法，其特征在于上述步骤④中气相色谱条件设定如下：进样方式：不分流进样；

进样体积：1μL；

进样口温度：280℃；

载气：99.999%高纯氦气；

载气流量：1mL/min；

色谱柱：TR‑Dioxin‑5MS，规格60m×0.25mm×0.25μm；

升温程序：初始温度140℃，保持1min后以20℃/min的速度升温至200℃，停留1min后以

5℃/min的速度升温至220℃，停留16min后以5℃/min的速度升温至235℃，停留7min后以5℃/min的速度升温至310℃，停留10min。

8.根据权利要求1或2所述的同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中二噁英类物质的方法，其特征在于上述步骤④中质谱条件设定如下：离子源温度为260℃；传输线温度为280℃；电离模式为EI源，电子能量为45eV；检测模式为MID模式，质量校准物质为FC43，分辨率大于10000。

说明书

同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法测定咪鲜胺原药

中二噁英类物质的方法

技术领域

[0001] 本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法（HRGC‑HRMS）测定咪鲜胺原药中二噁英类物质的方法。

背景技术

[0002] 二噁英类物质主要包括75种多氯代二苯并‑对‑二噁英（简称PCDDs）和135种多氯代二苯并呋喃（简称PCDFs）。研究较多的二噁英类物质是17 种2,3,7,8‑氯代二噁英类，包括7种四～八氯代二苯并‑对‑二噁英和10种四～八氯代二苯并呋喃。其中，2,3,7,8‑四氯代二苯并‑对‑二噁英（简称2,3,7,8‑T4CDD）是目前所有已知化合物中毒性最强的二噁英单体（经口LD50仅为0.6μg/kg），且还有极强的致癌性（致大鼠肝癌剂量10 pg/g）和极低剂量的环境内分泌干扰作用在内的多种毒性作用。

[0003] 二噁英类物质属于持久性有机污染物，具有高毒性和生物聚集性等特点，对生态环境和人体健康产生较大危害。目前，针对水体、气体、固体废物、土壤和沉积物以及食品中的二噁英类物质检测，已有文献报道（参见文献1～文献5）。

[0004] 咪鲜胺（参见文献6）作为一种低毒杀菌剂，被广泛用于防治蔬菜瓜果的炭疽病、叶斑病、枯萎病等。目前，市售咪鲜胺原药大多是以2,4,6‑三氯苯酚为原料，依次与1,2‑二氯乙烷、丙胺、光气、咪唑等反应制得。该合成路线中会伴随以含氯化合物作为前驱体经缩合反应生成的二噁英类副产物，这些二噁英类物质通过咪鲜胺原药的生产和使用会扩散到生态环境中，造成一定程度的污染。

[0005] 因此，检测咪鲜胺原药中二噁英类物质是本领域急需解决的技术问题。目前，尚未发现咪鲜胺原药中二噁英类物质检测的相关文献报道。

[0006] 文献1：国家环境保护标准《HJ 77.1‑2008 水质 二噁英类的测定 同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法》，公开日2008年12月31日。

[0007] 文献2：国家环境保护标准《HJ 77.2‑2008 环境空气和废气 二噁英类的测定 同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法》，公开日2008年12月31日。

[0008] 文献3：国家环境保护标准《HJ 77.3‑2008 固体废物 二噁英类的测定 同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法》，公开日2008年12月31日。

[0009] 文献4：国家环境保护标准《HJ 77.4‑2008 土壤和沉积物 二噁英类的测定 同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法》，公开日2008年12月31日。

[0010] 文献5：国家标准《GB 5009.205‑2013 食品安全国家标准 食品中二噁英及其类似物毒性当量的测定》，公开日2013年11月29日。

[0011] 文献6：国家标准《GB 22623‑2008 咪鲜胺原药》，公开日2008年12月17日。

发明内容

[0012] 本发明的目的在于解决上述问题，提供一种灵敏度高、准确度高的同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中二噁英类物质的方法。

[0013] 实现本发明目的的技术方案是：一种同位素稀释高分辨气相色谱‑高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中二噁英类物质的方法，具有以下步骤：

[0014] ①将咪鲜胺原药溶解在混合溶剂中，然后加入提取内标EPA 1613 LCS，接着用酸性硅胶吸附咪鲜胺，从而将二噁英类物质分离提取出来，得到提取液；

[0015] ②对步骤①得到的提取液进行净化，得到净化液；

[0016] ③对步骤②得到的净化液进行处理，得到样品溶液；

[0017] ④采用高分辨气相色谱‑高分辨双聚焦磁质谱联用仪测定步骤③得到的样品溶液中的二噁英类物质。

[0018] 上述步骤①中，所述咪鲜胺原药与所述混合溶剂的重量体积比为1∶10～1∶50g/mL，优选为1∶30g/mL。

[0019] 上述步骤①中，所述混合溶剂为正己烷+二氯甲烷。

[0020] 申请人经过大量实验发现：混合溶剂中正己烷用量越少（低于5倍），吸附效果越差；正己烷用量越大（高于5倍），咪鲜胺的溶解性能越差。

[0021] 因此，本发明采用的混合溶剂中，正己烷与二氯甲烷的体积比为5∶1。

[0022] 上述步骤①中，所述咪鲜胺原药与所述酸性硅胶的重量比为1∶4～1∶6，优选为1∶5。

[0023] 上述步骤①中，所述酸性硅胶为44%硫酸‑中性硅胶。

[0024] 上述步骤②中所述净化为多层硅胶柱净化+活性炭硅胶柱净化。

[0025] 所述多层硅胶柱净化的装柱方法为干法装柱，具体如下：从下到上依次装填玻璃棉、4g无水硫酸钠、3g中性硅胶、5g碱性硅胶、2g中性硅胶、10g酸性硅胶、2g中性硅胶、4g无水硫酸钠。

[0026] 所述多层硅胶柱净化的步骤如下：先用40mL正己烷淋洗多层硅胶柱，然后将步骤①得到的提取液转移到多层硅胶柱，再用120mL正己烷淋洗多层硅胶柱，收集淋洗液并浓缩，得到初净化液。

[0027] 多层硅胶柱净化可以去除咪鲜胺原药提取液中的部分痕量杂质，例如咪鲜胺合成的原料2,4,6‑三氯苯酚、1,2‑二氯乙烷等。

[0028] 所述活性炭硅胶柱净化的装柱方法为：在斜拉管一端垫一元硬币厚度玻璃棉，压实后装入1g活性炭硅胶，再垫入一元硬币厚度玻璃棉压实。

[0029] 所述活性炭硅胶柱净化的步骤如下：先用40mL正己烷淋洗活性炭硅胶柱，然后将多层硅胶柱净化得到的初净化液转移到活性炭硅胶柱上，再用25mL正己烷淋洗活性炭硅胶柱，接着用40mL正己烷‑二氯甲烷（v/v=3∶1）混合溶剂淋洗活性炭硅胶柱【这两步淋洗液无二噁英类物质，因此无需收集】，然后翻转活性炭硅胶柱，用60mL甲苯淋洗活性炭硅胶柱，收集该甲苯淋洗液并浓缩，得到净化液。

[0030] 活性炭硅胶柱净化可以去除多氯联苯等干扰物质。

[0031] 上述步骤③中所述处理是将步骤②得到的净化液

[0032] 用二氯甲烷定量转移至2mL全回收进样瓶中，然后用全自动氮空吹扫浓缩仪吹除多余的溶剂，浓缩至近干，接着添加0.5ng进样内标EPA 1613 ISS，最后用壬烷定容至25μL，作为样品溶液。

[0033] 上述步骤④中所述气相色谱条件设定如下：

[0034] 进样方式：不分流进样。

[0035] 进样体积：1μL。

[0036] 进样口温度：280℃。

[0037] 载气：高纯氦气（99.999%）。

[0038] 载气流量：1mL/min。

[0039] 色谱柱：TR‑Dioxin‑5MS（60m×0.25mm×0.25μm）。

[0040] 升温程序：初始温度140℃，保持1min后以20℃/min的速度升温至200℃，停留1min后以5℃/min的速度升温至220℃，停留16min后以5℃/min的速度升温至235℃，停留7min后以5℃/min的速度升温至310℃，停留10min。

[0041] 上述步骤④中所述质谱条件设定如下：离子源温度为260℃；传输线温度为280℃；电离模式为EI源，电子能量为45eV；检测模式为MID模式（使用SIM法选择待测化合物的两个监测峰离子进行监测），质量校准物质为FC43，分辨率大于10000。

[0042] 本发明具有的积极效果：

[0043] （1）本发明经过大量实验发现采用酸性硅胶在一定比例的混合溶剂中能够完全将咪鲜胺吸附从而分离出去，进而可以对其中含有的二噁英类物质进行检测。

[0044] （2）本发明的方法对咪鲜胺原药中二噁英类物质的检出限均不超过0.1ng/kg，尤其是对2,3,7,8‑T4CDD的最低检出限可达0.01ng/kg，具有较高的灵敏度。

[0045] （3）本发明的方法同位素内标添加回收率在77%～146%范围内，具有较高的准确度高。

[0046] （4）本发明的方法二噁英类物质相对标准偏差为1.2%～15.8%，二噁英类物质检测结果分布规律与二噁英生成机理一致。

[0047] （5）本发明的方法灵敏度高、准确度高、方便快捷，可用于咪鲜胺原药中二噁英类物质的定量检测，弥补了本领域的空白，具有重大意义。

具体实施方式

[0048] 一、实验部分。

[0049] 1、试剂和材料。

[0050] 1.1、正己烷、二氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯等有机溶剂均为农残级试剂，浓缩10000倍不得检出二噁英类物质。

[0051] 1.2、氢氧化钠、浓硫酸、无水硫酸钠等均为优级纯试剂，使用前应进行空白检测。

[0052] 1.3、中性硅胶、活性炭硅胶均为日本关东化学市售成品，使用前应制作淋洗曲线确认分离结果。

[0053] 酸性硅胶为44%硫酸‑中性硅胶，配制方法参照文献1第5.22节44%硫酸硅胶。

[0054] 碱性硅胶为2%氢氧化钠‑中性硅胶，配制方法参照文献1第5.20节2%氢氧化钾硅胶。

[0055] 1.4、提取内标EPA 1613 LCS，包含15种同位素13C12标记的二噁英类物质【参见文献1附录B的例2】。

[0056] 进样内标EPA 1613 ISS，包含2种同位素13C12标记的二噁英类物质【参见文献1附录B的例2】。

[0057] 1.5、二噁英类标准物质来源于美国Cerilliant公司。

[0058] 2、仪器和设备。

[0059] 2.1、高分辨气相色谱‑高分辨双聚焦磁质谱联用仪，型号为Thermo DFS（美国热电）。

[0060] 2.2、电子天平，型号为YP10002（上海越平科学仪器有限公司）。

[0061] 2.3、强磁力平板搅拌器，型号为98‑2（巩义市予华仪器有限责任公司）。

[0062] 2.4、旋转蒸发器，型号为YRE‑201D（巩义市予华仪器有限责任公司）。

[0063] 2.5、全自动氮空吹扫浓缩仪，型号为YGC‑16A（天津艾维欧科技发展有限公司）。

[0064] 3、实验过程。

[0065] 3.1、称取10g咪鲜胺原药样品于500 mL圆底烧瓶中，加入300mL正己烷‑二氯甲烷（v/v=5∶1）混合溶剂，搅拌至完全溶解后，加入0.5 ng提取内标EPA 1613 LCS，再加入50g酸性硅胶【44%硫酸‑中性硅胶】，室温搅拌30min后静置分层，此时下层酸性硅胶呈微黄色，将上层无色透明溶液用无水硫酸钠小柱过滤，将滤液浓缩，得到提取液。

[0066] 3.2.1、多层硅胶柱净化。

[0067] 3.2.1.1、装柱：从下到上依次装填玻璃棉、4g无水硫酸钠、3g中性硅胶、5g碱性硅胶、2g中性硅胶、10g酸性硅胶、2g中性硅胶、4g无水硫酸钠。

[0068] 3.2.1.2、净化：先用40mL正己烷淋洗多层硅胶柱，然后将上述得到的提取液转移到多层硅胶柱，再用120mL正己烷淋洗多层硅胶柱，收集淋洗液并浓缩，得到初净化液。

[0069] 3.2.2、活性炭硅胶柱净化。

[0070] 3.2.2.1、装柱：在斜拉管一端垫一元硬币厚度玻璃棉，压实后装入1g活性炭硅胶，再垫入一元硬币厚度玻璃棉压实。

[0071] 3.2.2.2、净化：先用40mL正己烷淋洗活性炭硅胶柱，然后将多层硅胶柱净化得到的初净化液转移到活性炭硅胶柱上，再用25mL正己烷淋洗活性炭硅胶柱，接着用40mL正己烷‑二氯甲烷（v/v=3∶1）混合溶剂淋洗活性炭硅胶柱【这两步淋洗液无二噁英类物质，因此无需收集】，然后翻转活性炭硅胶柱，用60mL甲苯淋洗活性炭硅胶柱，收集该甲苯淋洗液并浓缩，得到净化液。

[0072] 3.3、将上述得到的净化液用二氯甲烷定量转移至2mL全回收进样瓶中，然后用全自动氮空吹扫浓缩仪吹除多余的溶剂，浓缩至近干，接着添加0.5ng进样内标EPA 1613 ISS，最后用壬烷定容至25μL，作为样品溶液。

[0073] 3.4、采用高分辨气相色谱‑高分辨双聚焦磁质谱联用仪测定上述得到的样品溶液中的二噁英类物质。

[0074] 气相色谱条件设定如下：

[0075] 进样方式为不分流进样，进样体积为1μL，进样口温度为280℃。

[0076] 载气为高纯氦气（99.999%），载气流量为1mL/min。

[0077] 色谱柱为TR‑Dioxin‑5MS（60m×0.25mm×0.25μm）。

[0078] 升温程序：初始温度140℃，保持1min后以20℃/min的速度升温至200℃，停留1min后以5℃/min的速度升温至220℃，停留16min后以5℃/min的速度升温至235℃，停留7min后以5℃/min的速度升温至310℃，停留10min。

[0079] 质谱条件设定如下：离子源温度为260℃；传输线温度为280℃；电离模式为EI源，电子能量为45eV；检测模式为MID模式（使用SIM法选择待测化合物的两个监测峰离子进行监测），质量校准物质为FC43，分辨率大于10000。

[0080] 二、结果与分析。

[0081] 1、提取方法的试验与选择。

[0082] 1.1、由于咪鲜胺原药熔点较低，只有46.5℃～49.3℃，故不能采用索氏提取法和加速溶剂提取法。

[0083] 1.2、由于咪鲜胺原药在水中溶解度很小，只有为34.4mg/L（25℃），也不能采用液液萃取法。

[0084] 1.3、申请人经过大量实验发现：酸性硅胶能够有效吸附咪鲜胺而不吸附二噁英类物质。

[0085] 但是，不同溶剂的吸附效果存在较大的差异。

[0086] 1.3.1、在乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷等单一溶剂中，酸性硅胶难以有效吸附咪鲜胺，处理前瓶底是油状液体，处理后瓶底仍然是油状液体。

[0087] 1.3.2、在等体积比（1∶1）的正己烷+二氯甲烷混合溶剂中，酸性硅胶仍然难以有效吸附咪鲜胺，处理前瓶底是油状液体，处理后瓶底仍然是油状液体。

[0088] 1.3.3、当正己烷与二氯甲烷体积比为5∶1时，能够完全有效吸附咪鲜胺，处理后瓶底没有油状液体（二噁英属于超痕量检测，量少到肉眼几乎看不见）。

[0089] 1.3.4、当正己烷与二氯甲烷体积比为10∶1时，难以完全溶解咪鲜胺原药。

[0090] 各种提取方法可行性结果见表1。

[0091] 表1

[0092]   提取方法 溶剂 是否可行1 索氏提取法 / 否
2 加速溶剂提取法 / 否
3 液液萃取法 / 否
4 酸性硅胶提取法 乙酸乙酯 否
5 酸性硅胶提取法 正己烷 否
6 酸性硅胶提取法 二氯甲烷 否
7 酸性硅胶提取法 正己烷‑二氯甲烷（v/v=1∶1） 否
8 酸性硅胶提取法 正己烷‑二氯甲烷（v/v=10∶1） 否
9 酸性硅胶提取法 正己烷‑二氯甲烷（v/v=5∶1） 是

[0093] 2、检出限。

[0094] 按照本发明的方法对检出限进行测定，结果见表2。

[0095] 测定步骤如下：在正己烷和二氯甲烷混合溶剂中添加二噁英类标准物质（添加量为四氯代二噁英类0.5 pg，五氯～七氯代二噁英类2.5 pg，八氯代二噁英类5.0 pg），然后进行与样品处理相同的提取、净化、仪器分析、定量计算。重复测定5次，计算测定值的标准偏差，取标准偏差的3倍作为方法检出限。

[0096] 表2

[0097]PCDDs 检出限（ng/kg） PCDFs 检出限（ng/kg）
2,3,7,8‑T4CDD 0.01 2,3,7,8‑T4CDF 0.03
1,2,3,7,8‑P5CDD 0.1 1,2,3,7,8‑P5CDF 0.1
1,2,3,4,7,8‑H6CDD 0.08 2,3,4,7,8‑P5CDF 0.1
1,2,3,6,7,8‑H6CDD 0.1 1,2,3,4,7,8‑H6CDF 0.1
1,2,3,7,8,9‑H6CDD 0.1 1,2,3,6,7,8‑H6CDF 0.1
1,2,3,4,6,7,8‑H7CDD 0.1 2,3,4,6,7,8‑H6CDF 0.1
O8CDD 0.1 1,2,3,7,8,9‑H6CDF 0.09
    1,2,3,4,6,7,8‑H7CDF 0.07
    1,2,3,4,7,8,9‑H7CDF 0.07
    O8CDF 0.1

[0098] 由表2可以看出：本发明的方法对2,3,7,8‑T4CDD的最低检出限为0.01ng/kg，其它16种2,3,7,8‑氯代二噁英类物质的检出限也都不超过0.1ng/kg，表明本发明的方法具有较高的灵敏度。

[0099] 3、回收率。

[0100] 按照本发明的方法对3个样品批次咪鲜胺原药（每批次做3个平行样）进行检测，共9个样品的提取内标物质回收率见表3。

[0101] 表3

[0102]

[0103] 由表3可以看出：本发明的方法回收率在77%～146%之间，其中，PCDFs回收率略好于PCDDs，总体回收率满足超痕量检测方法回收率要求，表明本发明的方法准确度高。

[0104] 4、精密度。

[0105] 按照本发明的方法对3个样品批次咪鲜胺原药（每批次做3个平行样）进行检测，实测质量浓度以及毒性当量（I‑TEQ）总量见表4。

[0106] 表4

[0107]

[0108] 由表4可以看出：实测质量浓度及毒性当量（I‑TEQ）总量相对标准偏差在1.2%～15.8%，低氯代二噁英类和高氯代二噁英类相对标准偏差均较低。

[0109] 另外，不同批次咪鲜胺原药中二噁英类物质的检测结果PCDDs比PCDFs含量高，二噁英类物质分布规律基本符合二噁英合成机理，即前驱物反应主要是生成PCDDs，从侧面验证了本方面的方法检测结果准确、可靠。