一种促进白腐真菌定向产酶降解塑料污染物的方法

摘要

本发明公开了一种促进白腐真菌定向产酶降解塑料污染物的方法，涉及固废处理技术领域。本发明公开了一种促进白腐真菌定向产LiP/MnP降解塑料污染物的方法，包括以下步骤：(1)将所述白腐真菌在定向产LiP/MnP的培养基中培养至对数生长期，得到白腐真菌培养物；(2)将消毒处理后的塑料污染物放入所述白腐真菌培养物中，继续培养10d以上；所述塑料污染物为PS塑料或PLA塑料。本发明利用定向产LiP和MnP的培养基，使白腐真菌产生LiP或MnP，通过将生长到对数期的白腐真菌培养物与塑料污染物进行共培养，实现了对塑料污染物的降解。

权利要求

1.一种白腐真菌降解塑料污染物的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将所述白腐真菌在培养基中培养至对数生长期，得到白腐真菌培养物；

（2）将消毒处理后的塑料污染物放入所述白腐真菌培养物中，继续培养40d以上；所述塑料污染物为PS塑料或PLA塑料；

所述白腐真菌为厚毛平革菌（P. chrysosporium）；

所述培养基的成分为：10 g/L葡萄糖、0.5 g/L酒石酸铵、2 g/L磷酸二氢钾、0.5 g/L七水硫酸镁、0.1 g/L二水氯化钙、1 g/L吐温80、0.001 g/L VB1和70 mL/L微量元素液，pH为

4.5；

所述微量元素液的成分为：1.5 g/L氨三乙酸、0.5 g/L七水硫酸镁、1 g/L氯化钠、0.1 g/L七水硫酸亚铁、0.1 g/L硫酸钴、0.1 g/L一水硫酸锌、0.1 g/L五水硫酸铜、0.01 g/L十二水合硫酸铝钾、0.01 g/L二水钼酸钠和0.01 g/L硼酸。

2.根据权利要求1所述的白腐真菌降解塑料污染物的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述培养的条件为：35℃，150 rpm。

说明书

一种促进白腐真菌定向产酶降解塑料污染物的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及固废处理技术领域，特别是涉及一种促进白腐真菌定向产酶降解塑料污染物的方法。

背景技术

[0002] 近年来，塑料污染对环境的污染问题，引起了广泛关注。塑料由于其化学、物理和生物惰性和耐用性被广泛使用，大约50％的塑料在一次性使用后被丢弃，使得塑料在环境中堆积占用大量土地，也给土壤水体和大气带来潜在危害。针对石油基塑料在环境中难以降解这一问题，大量的可生物降解塑料被研发出来并广泛用于超市购物袋、一次性吸管等。但是，对于“可生物降解”这一词的ASTM和ISO标准都强调在高温、高湿、高生物量的堆肥环境中进行并对塑料的形态没有限制性要求，显然这一降解条件与实际环境差异较大。目前，越来越多的研究报道已被广泛商用的可生物降解塑料在自然环境(淡水、海水、空气、土壤)乃至低温堆肥环境中短时间内(1年～3年)几乎未表现出降解现象。

[0003] 专利US20150203666A1提供了一种塑料降解组合物，用于在塑料制造期间使用的添加剂形式的塑性降解的组合物。该组合物由预定量的庚烷，纤维素，甲基铼三氧化物，丁基化羟基甲苯和多酚氧化酶组成。可以选择性地编程添加剂以使塑料在预定时间开始分解，似乎能生产易于降解的塑料解决未来塑料堆积问题，但目前环境中已有大量不含有降解组合物的塑料存在。

[0004] 专利US20160280881A1提供了一种塑料降解方法，其原理是将聚烯烃塑料，如聚乙烯，聚丙烯，聚甲基戊烯等与酶(水解酶)或者微生物结合，提供一种组合物提升聚烯烃塑料的甲烷化程度。这减轻了传统塑料的使用压力，但聚烯烃类塑料仅仅是热塑性树脂中的小部分，对其他热塑性塑料如聚苯乙烯、聚氨酯等以及热固性塑料的效果没有提及。

[0005] 聚苯乙烯(PS)是指由苯乙烯单体经自由基加聚反应合成的聚合物，它是一种无色透明的热塑性塑料，具有高于100℃的玻璃转化温度，因此经常被用来制作各种需要承受开水的温度的一次性容器，以及一次性泡沫饭盒等。聚乳酸(PLA)，又称聚丙交酯，是以乳酸为主要原料聚合得到的聚酯类聚合物，是一种新型的生物降解材料。研究一种能够有效降解聚苯乙烯和聚乳酸塑料的生物降解技术，对降低环境污染具有重要的意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种促进白腐真菌定向产酶降解塑料污染物的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明利用定向产LiP或MnP的培养基，使白腐真菌产生LiP或MnP，通过将生长到对数期的白腐真菌培养物与塑料污染物进行共培养，实现了对塑料污染物的降解。

[0007] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0008] 本发明提供一种促进白腐真菌定向产LiP降解塑料污染物的方法，包括以下步骤：

[0009] (1)将所述白腐真菌在定向产LiP的培养基中培养至对数生长期，得到白腐真菌培养物；

[0010] (2)将消毒处理后的塑料污染物放入所述白腐真菌培养物中，继续培养10d以上；所述塑料污染物为PS塑料或PLA塑料。

[0011] 进一步地，所述白腐真菌为厚毛平革菌。

[0012] 进一步地，所述定向产LiP的培养基包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L酒石酸铵、2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L七水硫酸镁、0.1g/L二水氯化钙、1g/L吐温80、0.001g/LVB1和70mL/L微量元素液，pH为4.5。

[0013] 进一步地所述量元素液的成分包括：1.5g/L氨三乙酸、0.5g/L七水硫酸镁、1g/L氯化钠、0.1g/L七水硫酸亚铁、0.1g/L硫酸钴、0.1g/L一水硫酸锌、0.1g/L五水硫酸铜、0.01g/L十二水合硫酸铝钾、0.01g/L二水钼酸钠和0.01g/L硼酸。

[0014] 进一步地，在步骤(2)中，所述培养的条件为：35℃，150rpm。

[0015] 本发明还提供一种促进白腐真菌定向产MnP降解塑料污染物的方法，包括以下步骤：

[0016] (1)将所述白腐真菌在定向产MnP的培养基中培养至对数生长期，得到白腐真菌培养物；

[0017] (2)将消毒处理后的塑料污染物放入所述白腐真菌培养物中，继续培养10d以上；所述塑料污染物为PS塑料或PLA塑料。

[0018] 进一步地，所述白腐真菌为厚毛平革菌。

[0019] 进一步地，所述定向产LiP的培养基包括：10g/L葡萄糖、0.2g/L酒石酸铵、2.0g/L磷酸二氢钾、0.15g/L一水硫酸锰、0.5g/L七水硫酸镁、0.1g/L二水氯化钙、1g/L吐温80、0.01g/LVB1和70mL/L微量元素液，pH为5.0。

[0020] 进一步地，所述量元素液的成分包括：1.5g/L氨三乙酸、0.5g/L七水硫酸镁、1g/L氯化钠、0.1g/L七水硫酸亚铁、0.1g/L硫酸钴、0.1g/L一水硫酸锌、0.1g/L五水硫酸铜、0.01g/L十二水合硫酸铝钾、0.01g/L二水钼酸钠和0.01g/L硼酸。

[0021] 进一步地，在步骤(2)中，所述培养的条件为：35℃，150rpm。

[0022] 厚毛平革菌(P.chrysosporium)作为白腐真菌的典型菌种，具有丰富的胞内和胞外酶系。胞内酶系包括主要存在内质网中的细胞色素P450家族，环氧化酶(I期)，铁转移酶(II期)酶以及能够催化脂肪族、脂环类和方向类分子代谢的单加氧酶，这些复杂的酶系相互作用，使厚毛平革菌抵御微塑料污染毒害。细胞外酶系包括水解酶和氧化还原酶。其中水解酶能够降解木质素等复杂结构污染物，氧化还原酶包括锰过氧化物酶(MnP)、木质素过氧化物酶(LiP)、过氧化氢酶(CAT)和漆酶(Lac)。其中LiP和MnP目前研究的最多也是氧化还原能力最强的两种酶。MnP由一个丙酸血红素和两个氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)以及Mn中心离子通过丙酸基团彼此连接，在H2O2存在条件下能够迅速形成卟啉π阴阳离子自由基和羟基‑铁基中心自由基，随后Mn(II)中心离子脱去自由水形成强氧化性的Mn(III)离子，其作为活性位点对多种污染物具有低专一性的氧化作用。木质素酶同样是一种非专一性的、以3+
自由基为基础的链反应过程。LiP是一系列含Fe 、卟啉环和血红素辅基的同工酶，可利用H2O2氧化富含电子的酚型或非酚型芳香化合物。在通过电子传递体攻击底物时，能从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子，将其氧化成自由基，随后产生一系列的自由基链式反应。

[0023] 本发明公开了以下技术效果：

[0024] 本发明利用定向产LiP或MnP的培养基，使白腐真菌产生LiP或MnP，通过将生长到对数期的白腐真菌培养物分别与可生物降解塑料PLA和不可生物降解的石油基塑料PS进行共培养，发现两种塑料都有不同程度的降解效果。两种酶都能引起PS聚合物键的断裂并引入羟基，在40d的降解周期内，LiP使PS质量损失43.9％，而MnP使PS质量损失34.8％。相比于PS的降解，LiP和MnP对PLA的降解效率高，降解效果好。40d后，经LiP处理的PLA质量损失达71.6％；而在MnP作用下，PLA在20d就能达到较好的去除效果。FTIR进一步验证了塑料膜被氧化。

[0025] 本发明所采用的方法具有相当的经济性，不产生额外污染，方法简单有效。

附图说明

[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0027] 图1为定向产LiP的培养基中，两种塑料膜PS和PLA的质量损失情况；

[0028] 图2为定向产MnP的培养基中，两种塑料膜PS和PLA的质量损失情况；

[0029] 图3为在产LiP的培养基中处理40d后，PS(A)和PLA(B)膜表面官能团变化；

[0030] 图4为在产MnP的培养基中处理40d后，PS(A)和PLA(B)膜表面官能团变化；

[0031] 图5为LiP体外处理PS塑料膜11*6h后的红外数据；

[0032] 图6为LiP体外处理PLA塑料膜11*6h后的红外数据；

[0033] 图7为Kirk培养基中，两种塑料膜PS和PLA的质量损失情况。

具体实施方式

[0034] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0035] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0036] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0037] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

[0038] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0039] 以下实施例中的厚毛平革菌(P.chrysosporium)购自中国典型培养物保藏中心(武汉，中国)，原始保藏编号BKMF1767，CCTCC保藏编号为AF96007。

[0040] 实施例1

[0041] 1、对数生长期厚毛平革菌的培养

[0042] (1)优选的定向产LiP的培养基的成分为(L‑1)：10g葡萄糖，0.5g酒石酸铵，2g磷酸二氢钾，0.5g七水硫酸镁，0.1g二水氯化钙，1g吐温80，0.001gVB1，70mL微量元素液，pH为4.5。

[0043] (2)优选的定向产MnP的培养基的成分为(L‑1)：10g葡萄糖，0.2g酒石酸铵，2.0g磷酸二氢钾，0.15g一水硫酸锰，0.5g七水硫酸镁，0.1g二水氯化钙，1g吐温80，0.01gVB1，70mL微量元素液，pH调节为5.0。

[0044] (3)微量元素液的成分(L‑1)：1.5g氨三乙酸，0.5g七水硫酸镁，1g氯化钠，0.1g七水硫酸亚铁，0.1g硫酸钴，0.1g一水硫酸锌，0.1g五水硫酸铜，0.01g十二水合硫酸铝钾，0.01g二水钼酸钠，0.01g硼酸。

[0045] (4)取出4℃保存的厚毛平革菌培养皿于37℃的恒温培养箱中活化30min，然后将6
活化好的孢子加入无菌水中，形成孢子悬浮液，并利用浊度仪调节至浓度为2.0×10cfu·‑1
mL 。取1mL孢子悬浮液分别接种到250mL定向产LiP和定向产MnP的液体培养基中，恒温振荡培养箱中于35℃、150rpm条件下培养3天，厚毛平革菌即进入对数生长期。

[0046] 2、两种塑料膜的灭菌

[0047] 规则的塑料薄膜在吐温80/漂白剂/水(7:10:983，v/v)的新鲜溶液中搅拌，每个样品30min；然后用无菌镊子取出每个薄膜，转移到装有无菌水的有盖烧杯中，并在室温下搅拌60min；然后将薄膜无菌转移到静置的70％(v/v)乙醇溶液中并放置30min。将塑料薄膜在40℃(温度过高塑料膜变形，过低难以烘干)下干燥过夜，然后使其平衡至室温并称重记录。
消毒的薄膜在4℃储存。

[0048] 3、接种塑料膜

[0049] 在操作台中分别将消毒的塑料膜PLA(5×5cm，厚度0.25mm)和PS(5×5cm，厚度0.2mm)，分别放入进入对数生长期的定向产LiP的培养基和产MnP的培养基中。随后在培养箱中35℃，150rpm摇瓶培养。每10d为一个周期，取样称重，再次消毒后进入下一个周期的培养。第四个降解周期结束，测定实验组与对照组塑料膜官能团变化。

[0050] 图1为产LiP的培养基中，两种塑料膜的质量损失情况。可以发现在前20d，两种塑料膜的质量损失较少；20d后，塑料膜质量损失加速，且相同条件下可生物降解塑料PLA的质量损失更多。在降解的前20d，两种塑料膜都保持较高的强度，塑料模致密，生物利用性差，故质量损失较小；20d的生物作用与震荡之后，塑料膜受到损伤，产生碎裂，生物利用加快，质量损失加剧；随着降解的进一步进行，塑料的降解塑料进一步加速。对于可生物降解塑料，降解之后的产物更易被生物利用，同时其强度相对于传统石油及塑料更低，导致质量损失速度快，损失率高。实验表明，LiP对可生物降解塑料PLA和传统石油基塑料都具有不同程度的降解效果，40d后PS的质量损失达到了43.9％，PLA的质量损失达71.6％。

[0051] 图2为产MnP的培养基中，两种塑料膜的质量损失情况。与在产LiP培养基中不同的是，在降解周期的前20d，PLA就出现了较大幅度的降解，第10d时质量损失已经大于30％，在第20d时，PLA质量损失已经接近100％。相反地，在降解周期的前10d，传统石油基塑料PS几乎看不到质量损失，质量损失接近0。10d之后，PS质量损失加速。在降解第40d时，PS的质量损失为34.8％。实验表明，MnP对两种塑料都有不同程度的降解效果。对于PLA，降解周期的前半段(前20d)，就能够实现相当程度的质量损失(接近100％)。

[0052] 图3为在产LiP的培养基中处理40d后，PS(图3A)和PLA(图3B)膜表面官能团变化。为了进一步论证两种塑料膜的降解，除了进行塑料膜质量损失记录之外，对40d后的两种塑料膜进行收集。洗涤烘干后，采用FTIR进行表面官能团变化表征。LiP引起的两种塑料膜表面官能团变化如图3所示，左侧为PS，右侧为PLA。从左侧PS的官团变化图中可以看到，‑1 ‑1
3024cm 和2921cm 分别代表加甲基和亚甲基的伸缩振动，两处吸收峰明显增强，也说明出‑1
现了链的断裂。从图3中可以看到，在波长>3000cm 的一个较宽范围内，LiP处理40d的PS膜相对对照组产生了吸收峰，表明降解后的塑料膜表面有大量端羟基产生，说明PS和PLA均出‑1
现了聚合物链的断裂，3200～3500cm 位置有较强的宽吸收带，说明羟基与多分子缔合。

[0053] 聚乳酸分子链中存在酯基，降解过程终酯基随机断裂，产生具有端羟基和端羧基的聚合物分子链。产生的羧基会对水解产生催化作用，促进PLA内部降解而出现自催化降解。随着PLA主链的断裂，其分子量和光学性能迅速下降，生成大量的低聚物和乳酸单体等产物，随后乳酸再被进一步降解生成小分子产物(CO2和H2O)。PLA的质量损失随时间延长而增大。

[0054] 图4为在产MnP的培养基中处理40d后，PS(图4A)和PLA(图4B)膜表面官能团变化。‑1
类似地，在3000～3500cm 位置出现宽的端羟基吸收峰，说明MnP对两种塑料也有相当的降解能力。对比图3和图4可以看到，在相同的降解周期内，MnP对PLA官能团影响比LiP对PLA的氧化效果更明显，相同周期内，MnP处理后的PLA膜出现了更大端羟基吸收峰。

[0055] 综上所述，白腐真菌产生的LiP和MnP对可生物降解塑料PLA和传统生物基塑料都有不同程度的降解效果。两种酶都能引起PS聚合物键的断裂并引入羟基，在40d的降解周期内，LiP使PS质量损失43.9％，而MnP使PS质量损失34.8％。相比于PS的降解，LiP和MnP对PLA的降解效率高，降解效果好。40d后，经LiP处理的PLA质量损失达71.6％；而在MnP作用下，PLA在20d就能达到较好的去除效果。FTIR进一步验证了塑料膜被氧化。

[0056] 对比例1

[0057] 构建9mL的LiP酶酶活体系，分别对PS、PLA进行体外降解。

[0058] 如表1所示，采用藜芦醇、酒石酸、LiP、过氧化氢构建了体外酶活体系，通过调整藜芦醇、酒石酸配比得到最高酶活反应体系；在酶活最高的配比下(表1中实验组1的体外酶活体系)探索了4个循环0h，2h，4h，6h的酶活性，如表2所示，相应时间段酶活在可接受范围内波动，认为酶在6h反应过程中无明显失活现象。随后的反应循环只对反应0h，6h酶活进行监测。

[0059] 表1

[0060]

[0061]

[0062] 表2

[0063]

[0064] 图5‑6是LiP体外处理两种塑料膜11*6h后的红外数据，均未发现新的官能团产生。体外的酶降解体系实验表明，体外酶降解体系相对于生长介质中的酶降解体系降解效果差。

[0065] 对比例2

[0066] 采用Kirk培养基对厚毛平革菌进行培养，具体成分为：11.098g葡萄糖，1.641g无水乙酸钠，0.221g酒石酸铵，0.2g磷酸二氢钾，0.05g七水硫酸镁，0.01g氯化钙，0.5mL维生素液，1mL无机溶液。厚毛平革菌生长至对数生长期时，接种灭菌的塑料膜，未接种菌作为对照。每7d收集样品称重，获得如图7所示的质量曲线。结合图7和图1‑2可以看出，相对于Kirk培养基，使用本发明的定向产LiP和MnP的培养基能够有效降解PS和PLA。

[0067] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。