石榴式凝胶球及其制备方法

摘要

本申请公开了一种石榴式凝胶球及其制备方法，涉及生物材料技术领域，石榴式凝胶球包括若干个丝素蛋白凝胶球内核和透明质酸钠凝胶骨架球，制备方法如下：步骤S1、将酸与丝素蛋白溶液混合均匀并进行间歇超声制得混合液；步骤S2、将混合液放置在烘箱进行温育，获取粘性混合液；步骤S3、将粘性混合液加入持续搅拌的分散质中孵育形成丝素蛋白凝胶球；步骤S4、依次将透明质酸钠溶液和交联剂加入步骤S3中包含丝素蛋白凝胶球的持续搅拌的分散质中交联4‑8h；步骤S5、除去未交联的透明质酸钠溶液，并进行水洗得到石榴式凝胶球。本申请的石榴式凝胶球具备优异的力学性能、可注射性、体内降解性以及较高的生物安全性，制备流程简单，易于规模化生产。

权利要求

1.一种石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，包括：

步骤S1、将酸与丝素蛋白溶液混合均匀并进行间歇超声制得混合液；

步骤S2、将所述混合液放置在烘箱进行温育，获取粘性混合液；

步骤S3、将所述粘性混合液加入持续搅拌的分散质中孵育形成丝素蛋白凝胶球；

步骤S4、依次将透明质酸钠溶液和交联剂加入步骤S3中包含丝素蛋白凝胶球的持续搅拌的分散质中交联4‑8h；

步骤S5、除去未交联的透明质酸钠溶液，并进行水洗得到石榴式凝胶球；

所述步骤S1中的酸为弱酸。

2.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的酸为柠檬酸。

3.如权利要求2所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸的质量浓度为0.2g/L‑500 g/L。

4.如权利要求2所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸的质量浓度为2 g/L ‑250 g/L。

5.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中丝素蛋白溶液的质量浓度为1 g/L ‑400 g/L。

6.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中丝素蛋白溶液的质量浓度为50 g/L ‑20 0 g/L。

7.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中间歇超声的总时长为1‑20min，振幅为5‑75%。

8.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中间歇超声的总时长为5min，振幅为75%。

9.如权利要求8所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述间歇超声包括五组，每组超声50s，间歇10s。

10.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中温育的温度为60℃，温育的时间为12‑20小时。

11.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中分散质为不溶于水的有机溶剂或油类物质。

12.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中分散质为医用级植物油或为医用级矿物油。

13.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中所述粘性混合液与所述分散质的体积比小于1。

14.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中所述粘性混合液与所述分散质的体积比为1：2‑1：10。

15.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中孵育的温度为25‑80℃。

16.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中孵育的温度为40‑60℃。

17.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中透明质酸钠溶液的质量浓度为1 g/L ‑100 g/L。

18.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中透明质酸钠溶液的质量浓度为20 g/L ‑80 g/L。

19.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述透明质酸钠溶液与所述分散质的体积比为1：2‑1：100000 。

20.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中的交联剂包括1,4‑丁二醇二缩水甘油醚，二环氧甘油醚，1,3‑二环氧甘油醚甘油，双酚A二缩水甘油醚，双酚A二缩水甘油醚衍生物，间苯二酚二缩水甘油醚，3,4‑羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚，新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种。

21.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中的交联剂为1,4‑丁二醇二缩水甘油醚。

22.如权利要求21所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述1,4‑丁二醇二缩水甘油醚的体积分数为0.01%‑2%。

23.如权利要求21所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述1,4‑丁二醇二缩水甘油醚的体积分数为0.01%‑0.5%。

24.如权利要求21所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液、所述透明质酸钠溶液和所述1,4‑丁二醇二缩水甘油醚的体积比为5 200:10 150:1 2。

~ ~ ~

25.如权利要求21所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液、透明质酸钠溶液和所述1,4‑丁二醇二缩水甘油醚的体积比为30:20:1。

26.如权利要求1所述的石榴式凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中通过过滤或离心除去未交联的透明质酸钠溶液。

27.一种应用权利要求1的制备方法制备的石榴式凝胶球，其特征在于，所述石榴式凝胶球包括若干个丝素蛋白凝胶球内核和透明质酸钠凝胶骨架球，所述透明质酸钠凝胶骨架球中均匀包裹所述若干个丝素蛋白凝胶球内核。

28.如权利要求27所述的石榴式凝胶球，其特征在于，所述丝素蛋白凝胶球内核的直径为0.1‑100μm。

29.如权利要求27所述的石榴式凝胶球，其特征在于，所述透明质酸钠凝胶骨架球的直径为1‑1000μm。

30.如权利要求27所述的石榴式凝胶球，其特征在于，所述丝素蛋白凝胶球内核通过物理交联形成。

31.如权利要求27所述的石榴式凝胶球，其特征在于，所述透明质酸钠凝胶骨架球通过加入交联剂进行化学交联形成。

32.如权利要求31所述的石榴式凝胶球，其特征在于，所述交联剂包括1,4‑丁二醇二缩水甘油醚，二环氧甘油醚，1,3‑二环氧甘油醚甘油，双酚A二缩水甘油醚，双酚A二缩水甘油醚衍生物，间苯二酚二缩水甘油醚，3,4‑羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚，新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种。

33.如权利要求31所述的石榴式凝胶球，其特征在于，所述交联剂为1,4‑丁二醇二缩水甘油醚。

34.如权利要求27所述的石榴式凝胶球，其特征在于，所述丝素蛋白凝胶球内核与所述透明质酸钠凝胶骨架球的质量比大于1。

说明书

石榴式凝胶球及其制备方法

技术领域

[0001] 本申请涉及生物材料技术领域，特别涉及一种石榴式凝胶球及其制备方法。

背景技术

[0002] 对于组织缺陷或欠美观的治疗手段从组织来源上可分为自体组织移植和人工填充材料两种；从植入手段上可分为开口式植入和注射填充两种。自体组织移植来源受限且对患者造成二次创伤，而近些年随着可降解生物材料的研究深入，人工填充材料的应用则前景广阔。另一方面，相比于开口式植入，注射填充法由于其创面小、操作简单、患者痛苦小等优势广泛应用于软组织创伤或手术切除后的填充和美容整形领域。

[0003] 人工填充材料从来源上可分为合成高分子材料和天然高分子材料。合成高分子材料可塑性较强，但其合成过程中使用大量有机溶剂，且其降解产物的生物毒性有待考证。天然高分子如胶原蛋白和透明质酸是动物体的主要细胞外结构蛋白，已被广泛应用于组织工程修复和医美整形填充，尤其是由透明质酸分子经化学交联形成的水凝胶产品，已在眼科、骨科、皮肤科等处获得广泛应用，可提供填充、修复、润滑等多种功能。然而，透明质酸水凝胶的临床应用尚存在待解决的问题。最突出的问题在于其化学交联，低交联度和非交联透明质酸在注射后数星期内即完全降解，需要频繁重新注射，且凝胶的力学性能较差，无法起到机体内稳定支撑和填充的目的；而高交联度透明质酸虽然具有较高的力学性能和较长的降解时间，但较高浓度的化学交联剂使用和残留也给机体组织带来较大的毒副作用。

[0004] 从天然蚕茧或蚕丝中提取的丝素蛋白也是一种结构蛋白，主要由丝胶蛋白和丝素蛋白两种蛋白质组成，外层包覆丝胶蛋白（Sericin），内层为丝素蛋白（Silk fibroin）。丝素蛋白含量为70   80%，由350 KD的H链、25 KD的L链和30 KD的P25组成。提取获得的丝素~蛋白具有独特的无规卷曲（silk I）到β‑折叠（silk II）结构变化和分子自组装特性，并可在此特性基础上通过物理交联的方式制备出凝胶、薄膜、海绵支架、微纳米颗粒等材料，用于药物缓控释、组织工程修复和固定化酶制备等领域。

[0005] 相比于胶原、几丁质、弹性蛋白和透明质酸等天然高分子材料，丝素蛋白可形成高晶体含量的凝胶，在缓慢降解方面更有优势，缓解了频繁注射和交联剂残留对人体造成的不适。尽管化学交联得到的凝胶的力学性能优异，但是在本质上未减少交联剂的使用，另外技术操作复杂，很难规模化生产。相比于经化学交联制备的胶原蛋白和透明质酸材料，物理交联的丝素蛋白材料内由于有大量的β‑折叠结晶体，因而力学性能表现为硬脆，缺少弹性，且表面粗糙。丝素蛋白经超声、高温、酸、醇等诱导形成的物理交联凝胶可作为体内填充材料展现出良好的生物相容性（无炎症和免疫反应），低毒性及较长的降解周期，但其注射性和与皮肤等软组织的力学匹配性不如透明质酸凝胶。

[0006] 丝素蛋白也可以通过传统化学交联剂（如BDDE）进行交联，进而提高材料的柔韧性和弹性。然而，由于其分子结构特点和表面暴露的BDDE反应基团较少，采用通常的碱性反应条件很难在水溶液中实现丝素蛋白的交联和凝胶制备，因而在实践中多数研究者采用反应基团暴露较多的聚合物（如透明质酸）与丝素蛋白共混后交联。但需使用多种交联剂（酪氨酸酶，碳化二亚胺等），且体内注射填充时存在安全隐患；降低化学交联剂使用浓度或不佳的反应条件会对凝胶的力学性能及降解时间造成影响。

[0007] 综上所述，现有技术的缺点包括：（1）纯透明质酸凝胶交联度低，力学性能差，体内降解速率快（数星期之内），无法起到稳定支撑和填充效果，因此需频繁重新注射。另外，频繁使用时的交联剂残留会给机体组织带来较大的毒副作用。（2）经物理交联的纯丝素蛋白凝胶高β‑折叠结晶体含量（接近50%）使得其硬脆，弹性差，且表面粗糙，医美注射填充受限；经化学交联的纯丝素蛋白凝胶的反应条件剧烈（高浓度溴化锂、高交联剂使用），尽管交联度高，但仍需通过添加透明质酸增强润滑提高注射性，无论是方法的制备还是生物安全性方面均有待考证。（3）丝素蛋白‑透明质酸钠交联双网络凝胶制备方法复杂，需使用多种交联剂（酪氨酸酶，碳化二亚胺等），且体内注射填充时存在安全隐患；降低化学交联剂使用浓度或不佳的反应条件会对凝胶的力学性能及降解时间造成影响；此外，简单地将少量丝素蛋白颗粒混悬包埋在透明质酸凝胶中并不能解决降解速率过快的问题，且不规则形状丝素蛋白颗粒的引入会影响凝胶的注射性和润滑性。

发明内容

[0008] （一）申请目的

[0009] 鉴于上述问题，本申请的目的在于选择生物相容性优异的原材料，通过创新简化的制备方法制备具有优异力学性能和可注射性能、高生物相容性和安全性，且易于规模化生产的医美填充、药物缓释用的石凝胶产品。

[0010] （二）技术方案

[0011] 本申请公开了一种石榴式凝胶球，其特征在于，所述石榴式凝胶球包括若干个丝素蛋白凝胶球内核和透明质酸钠凝胶骨架球，所述透明质酸凝钠胶骨架球均匀包裹所述若干个丝素蛋白凝胶球内核。

[0012] 在一种可能的实施方式中，所述丝素蛋白凝胶球内核的直径为0.1‑100μm。

[0013] 在一种可能的实施方式中，所述透明质酸钠凝胶骨架球的直径为1‑1000μm。

[0014] 在一种可能的实施方式中，所述丝素蛋白凝胶球内核通过物理交联形成。

[0015] 在一种可能的实施方式中，所述透明质酸钠凝胶骨架球通过加入交联剂进行化学交联形成。

[0016] 在一种可能的实施方式中，所述交联剂包括1,4‑丁二醇二缩水甘油醚，二环氧甘油醚，1,3‑二环氧甘油醚甘油，双酚A二缩水甘油醚，双酚A二缩水甘油醚衍生物，间苯二酚二缩水甘油醚，3,4‑羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚，新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种。

[0017] 在一种可能的实施方式中，所述交联剂为1,4‑丁二醇二缩水甘油醚。

[0018] 在一种可能的实施方式中，所述丝素蛋白凝胶球内核与所述透明质酸钠凝胶骨架球的质量比大于1。

[0019] 作为本申请的第二方面，本申请还公开了一种石榴式凝胶球的制备方法，包括以下步骤：

[0020] 步骤S1、将酸与丝素蛋白溶液混合均匀并进行间歇超声制得混合液；

[0021] 步骤S2、将所述混合液放置在烘箱进行温育，获取粘性混合液；

[0022] 步骤S3、将所述粘性混合液加入持续搅拌的分散质中孵育形成丝素蛋白凝胶球；

[0023] 步骤S4、依次将透明质酸钠溶液和交联剂加入步骤S3中包含丝素蛋白凝胶球的持续搅拌的分散质中交联4‑8h；

[0024] 步骤S5、除去未交联的透明质酸钠溶液，并进行水洗得到石榴式凝胶球。

[0025] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S1中的酸为弱酸。

[0026] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S1中的酸为柠檬酸。

[0027] 在一种可能的实施方式中，所述柠檬酸的质量浓度为0.2g/L‑500g/L。

[0028] 在一种可能的实施方式中，所述柠檬酸的质量浓度为2g/L‑250g/L。

[0029] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S1中丝素蛋白溶液的质量浓度为1g/L‑400g/L。

[0030] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S1中丝素蛋白溶液的质量浓度为50g/L‑200g/L。

[0031] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S1中间歇超声的总时长为1‑20min，振幅为5‑75%。

[0032] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S1中间歇超声的总时长为5min，振幅为75%。

[0033] 在一种可能的实施方式中，所述间歇超声包括五组，每组超声50s，间歇10s。

[0034] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S2中温育的温度为60℃，温育的时间为12‑20小时。

[0035] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S3中分散质为不溶于水的有机溶剂或油类物质。

[0036] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S3中分散质为医用级植物油或医用级矿物油。

[0037] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S3中所述粘性混合液与所述分散质的体积比小于1。

[0038] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S3中所述粘性混合液与所述分散质的体积比为1：2‑1：10。

[0039] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S3中孵育的温度为25‑80℃。

[0040] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S3中孵育的温度为40‑60℃。

[0041] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S4中交联时间为6h。

[0042] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S4中透明质酸钠溶液的质量浓度为1g/L‑100g/L。

[0043] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S4中透明质酸钠溶液的质量浓度为20g/L‑80g/L。

[0044] 在一种可能的实施方式中，所述透明质酸钠与分散质的体积比为1：2‑1：100000。

[0045] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S4中的交联剂包括1,4‑丁二醇二缩水甘油醚，二环氧甘油醚，1,3‑二环氧甘油醚甘油，双酚A二缩水甘油醚，双酚A二缩水甘油醚衍生物，间苯二酚二缩水甘油醚，3,4‑羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚，新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种。

[0046] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S4中的交联剂为1,4‑丁二醇二缩水甘油醚。

[0047] 在一种可能的实施方式中，所述1,4‑丁二醇二缩水甘油醚的体积分数为0.01%‑2%。

[0048] 在一种可能的实施方式中，所述1,4‑丁二醇二缩水甘油醚的体积分数为0.01%‑0.5%。

[0049] 在一种可能的实施方式中，所述丝素蛋白溶液、所述透明质酸钠溶液和所述1,4‑丁二醇二缩水甘油醚的体积比为5 200:10 150:1 2。~ ~ ~

[0050] 在一种可能的实施方式中，所述丝素蛋白溶液、所述透明质酸钠溶液和所述1,4‑丁二醇二缩水甘油醚的体积比为30:20:1。

[0051] 在一种可能的实施方式中，所述步骤S5中通过过滤或离心除去未交联的透明质酸钠溶液。

[0052] （三）有益效果

[0053] 本申请公开的石榴式凝胶球及其制备方法，具备以下有益效果：

[0054] 1）独特的石榴式凝胶球赋予其优异的力学性能、弹性、可注射性和体内降解性。复合凝胶球中的分散相为若干通过物理交联形成的高β‑折叠含量的丝素蛋白凝胶球内核，能显著延缓体内降解时间；连续相为通过化学交联形成的高弹性的透明质酸钠凝胶骨架球，可赋予凝胶优异的可注射性和润滑性，且双相凝胶中各组分基质含量可灵活调控，进而控制凝胶的交联度和厚度从而实现降解速率的可控性。

[0055] 2）生物安全性得到保证。石榴式凝胶球是以物理交联的丝素蛋白凝胶球为主体（大于50wt%），在确保凝胶球在临床应用中具有理想的填充和修复效果的前提下，大幅度减少了BDDE等交联剂的使用，从而减少交联剂残留对人体的毒副作用。

[0056] 3）制备流程简单，易于规模化生产。在酸性和超声双刺激条件下可加快丝素蛋白形成凝胶，分散质的引入可制备均匀分散的凝胶球，且其中的酸性介质可为下一步丝素蛋白凝胶球表面透明质酸钠化学交联提供反应微环境，具有一举两得的作用。可方便地生产制备和实施过程控制。

附图说明

[0057] 以下参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释和说明本申请，而不能理解为对本申请的保护范围的限制。

[0058] 图1是本申请公开的石榴式凝胶球制备方法的流程示意图。

[0059] 图2是本申请实施例1中公开的从油相中获取并经过除油风干后的石榴式凝胶球显微镜图。

[0060] 图3是本申请实施例1中公开的的石榴式凝胶球显微镜图。

[0061] 图4是本申请实施例2中公开的直接从油相中获取的石榴式凝胶球显微镜图。

[0062] 图5是本申请实施例3中公开的直接从油相中获得的石榴式凝胶球显微镜图。

[0063] 图6是本申请实施例4公开的从直接从油相中制备得到的石榴式凝胶球显微镜图。

[0064] 图7是本申请实施例5公开的经洗涤处理溶胀后得到的石榴式凝胶球显微镜图。

[0065] 图8是本申请实施例5公开的经100滤网过筛的石榴式凝胶球显微镜图。

[0066] 图9是本申请实施例5公开的经60℃烘箱风干的石榴式凝胶球显微镜图。

[0067] 图10是本申请实施例5公开的经60℃烘箱风干又加水溶胀的石榴式凝胶球显微镜图。

[0068] 图11是本申请实施例5公开的石榴式凝胶球经26G针头注射后的石榴式凝胶球显微镜图。

[0069] 图12是本申请实施例5公开的石榴式凝胶球经26G针头注射后的石榴式凝胶球显微镜局部放大形貌图。

[0070] 图13是本申请实施例1公开的石榴式凝胶球应力随压缩距离的变化曲线图。

[0071] 图14是本申请实施例1公开的石榴式凝胶球推注力随时间变化的曲线图。

[0072] 图15是本申请实施例5公开的石榴式凝胶球推注力随时间变化的曲线图。

具体实施方式

[0073] 为使本申请实施的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行更加详细的描述。

[0074] 下面详细描述本申请公开的一种石榴式凝胶球。

[0075] 石榴式凝胶球包括若干个丝素蛋白凝胶球内核和透明质酸钠凝胶骨架球，所述透明质酸钠凝胶骨架球均匀包裹所述若干个丝素蛋白凝胶球内核。且所述丝素蛋白凝胶球内核与所述透明质酸钠凝胶外壳的质量比大于1。

[0076] 其中，内核为若干个通过物理交联形成的高β‑折叠含量的丝素蛋白凝胶球，利用透明质酸钠加入交联剂进行化学交联在丝素蛋白凝胶球内核表面形成透明质酸钠凝胶骨架球，均匀包裹若干个丝素蛋白凝胶球内核。

[0077] 在一种实施方式中，丝素蛋白凝胶球内核的直径为0.1‑100μm，透明质酸钠凝胶骨架球的直径为1‑1000μm。

[0078] 在一种实施方式中，所述交联剂包括1,4‑丁二醇二缩水甘油醚，二环氧甘油醚，1,3‑二环氧甘油醚甘油，双酚A二缩水甘油醚，双酚A二缩水甘油醚衍生物，间苯二酚二缩水甘油醚，3,4‑羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚，新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种。

[0079] 作为优选，所述交联剂为1,4‑丁二醇二缩水甘油醚，即BDDE。

[0080] 下面参考图1详细描述本申请公开的一种石榴式凝胶球的制备方法，如图1所示：包括以下步骤S1至步骤S5。

[0081] 步骤S1、将酸与丝素蛋白溶液混合均匀并进行间歇超声制得混合液。

[0082] 具体的，制备丝素蛋白溶液，置于反应容器中，添加一定浓度的酸，在室温下混匀，随后进行间歇超声。

[0083] 其中，步骤S1中的添加的酸为弱酸，包括柠檬酸、草酸、醋酸等；

[0084] 作为优选，所述步骤S1中添加的酸为柠檬酸，且所述柠檬酸的浓度为0.02‑50%（W/V），表示柠檬酸的质量浓度为2g/L‑250g/L，作为进一步优选，柠檬酸的浓度为0.2‑25%(W/V)，表示柠檬酸的质量浓度为2g/L‑250g/L。

[0085] 步骤S1中丝素蛋白溶液的浓度为0.1‑40%（W/V），表示丝素蛋白溶液的质量浓度为1g/L‑400 g/L；优选为5‑20%（W/V），表示丝素蛋白溶液的质量浓度为50g/L‑200g/L。

[0086] 步骤S1中间歇超声的总时长为1‑20min，优选为5min，振幅为5‑75%，优选为75%；当间歇超声的总时长为5min时，间歇超声包括五组，每组超声50s，间歇10s。

[0087] 在一个实施例中，丝素蛋白溶液的制备流程为：

[0088] 称取60g生丝和25.44g的无水碳酸钠备用，量取12L的去离子水倒入不锈钢桶中，并用电磁炉加热。在去离子水即将沸腾时，加入称量好的无水碳酸钠，继续加热并搅拌至沸腾，使得无水碳酸钠充分溶解，再加入称量好的生丝，保持沸腾煮90min，每隔5min搅拌一次，以溶解生丝表面的丝胶，将脱胶后的生丝用去离子水揉搓4遍，使得生丝表面的丝胶充分清除，最后将脱胶丝中的水分拧干，置于通风橱过夜干燥。

[0089] 将干燥的脱胶蚕丝称取25g放到盛有9.3M的100mL溴化锂的烧杯中，并用玻璃棒搅动润湿，锡箔纸封口后，将烧杯放置在60℃烘箱中加热4小时以促进脱胶蚕丝溶解，紧接着，将全部溶解后的丝素蛋白、溴化锂共混液倒入截留分子量为3500Da的透析袋中，并用透析夹固体两端，将装有丝素蛋白、溴化锂共混液的透析袋放入盛有20L去离子水的塑料桶中，使用涡流振动器不断在容器底部振动以加快溴化锂的溶出，透析时间为72小时，总共换水9‑10次。待溴化锂去除干净后，将丝素蛋白溶液放置于离心机中并在转速为9000 rpm和4℃低温条件下下反复离心两次，最后得到干净的丝素蛋白溶液，放置于4℃冰箱保存。

[0090] 进一步通过称重法测定丝素蛋白溶液浓度，即取称重皿称重记为W1，在皿中加入VmL蚕丝素蛋白溶液后放入60℃烘箱中干燥6小时后再次称重并标记为W2。依据下列公式计算出丝素蛋白溶液的浓度（W/V）。

[0091] 浓度=（W2‑W1）/ V×100%

[0092] 步骤S2、将所述混合液放置在烘箱进行温育，获取粘性混合液。

[0093] 步骤S1制成混合液后，再将超声处理后的共混液放置在60℃的烘箱温育，12‑20小时后变成粘度明显增大的混合液体后再进入步骤S3。

[0094] 需要说明过的是，丝素蛋白具有自组装特性。在超声及酸性条件下，丝素蛋白溶液可由初始的澄清透明溶液逐渐变为粘度较大的液体（即进行温育，温育的整个过程持续12‑20小时左右）。我们定义将共混液倒置后不能流动为固态凝胶，此时的粘稠液体离完全不能流动的的凝胶态的时间要小于1小时，以便后续再分散到油相中能形成凝胶球。

[0095] 步骤S3、将所述粘性混合液加入持续搅拌的分散质中孵育形成丝素蛋白凝胶球。

[0096] 具体的，将步骤S2获取的粘性混合液以小于分散质的体积加入连续搅拌的分散质中，在连续搅拌的分散质中均匀分散为油‑水乳液，再孵育至丝素蛋白液滴形成若干凝胶球。

[0097] 在一种实施方式中，所述步骤S3中分散质为不溶于水的有机溶剂或油类物质，优选为医用级植物油或医用级矿物油。

[0098] 在一种实施方式中，所述步骤S3中所述粘性混合液与所述分散质的体积比小于1，优选的，混合液与所述分散质的体积比为1：2‑1：10。

[0099] 在一种实施方式中，所述步骤S3中孵育的温度为25‑80℃，优选的为40‑60℃。

[0100] 在连续搅拌的条件下，通过油包水（即分散质包裹粘性混合液）的方式使得酸性丝素蛋白液滴能均匀地分散在分散质中，且在一定温度的孵育下，丝素蛋白分子在剪切力作用下逐渐自组装形成固态网络状的凝胶球（物理交联）。在酸性条件下（pH=3.8‑4.0），丝素蛋白溶液靠近其等电点附近，无同种电荷互相排斥的影响，此时丝素蛋白分子最不稳定，溶解度最小，最易受内外部环境刺激而自组装聚集进而形成果冻样凝胶。因此在此过程中，酸的混入有助于诱导丝素蛋白凝胶进行化学交联。pH=3.8‑4.0条件下最有利于丝素蛋白溶液形成凝胶，但只是目的之一。本申请加酸的第二个目的是要凝胶处于酸性环境，为后续的透明质酸钠交联提供反应微环境，所以丝素蛋白溶液的pH是要低于3.8的，经测定，共混液的pH约为1.5。

[0101] 步骤S4、依次将透明质酸钠溶液和交联剂加入步骤S3中包含丝素蛋白凝胶球的持续搅拌的分散质进行交联4‑8h。

[0102] 具体的，向步骤S3中包含有丝素蛋白凝胶球的持续搅拌的分散质中加入透明质酸钠溶液，待搅拌分散均匀后，继续加入交联剂，并在一定温度下进行搅拌，诱导透明质酸钠分子在形成的丝素蛋白凝胶球表面交联直到凝胶球的尺寸不再变化。

[0103] 在一种实施方式中，所述步骤S4中交联的时间优选为6h。

[0104] 在一种实施方式中，所述步骤S4中透明质酸钠溶液的浓度为0.1‑10%（W/V），表示透明质酸钠溶液的质量浓度为1g/L‑100g/L；优选的为2‑8%（W/V），表示透明质酸钠溶液的质量浓度为20g/L‑80g/L。

[0105] 在一种实施方式中，所述步骤S4中的交联剂包括1,4‑丁二醇二缩水甘油醚，二环氧甘油醚，1,3‑二环氧甘油醚甘油，双酚A二缩水甘油醚，双酚A二缩水甘油醚衍生物，间苯二酚二缩水甘油醚，3,4‑羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚，新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种，优选的为1,4‑丁二醇二缩水甘油醚。

[0106] 在一种实施方式中，1,4‑丁二醇二缩水甘油醚的浓度为0.01‑2% (V/V)，V/V表示物质浓度，即1,4‑丁二醇二缩水甘油醚的体积分数为0.01%‑2%，优选的为0.01‑0.5%(V/V)，即1,4‑丁二醇二缩水甘油醚的体积分数为0.01%‑0.5%。

[0107] 在一种实施方式中，透明质酸钠与分散质的体积比为1：2‑1：100000。

[0108] 需要说明的是，在此过程中，上述制备的含有酸的丝素蛋白凝胶球中的酸性介质可在搅拌的过程中不断扩散到交联剂与透明质酸钠的共混液中，为诱导丝素蛋白凝胶球外层的透明质酸钠化学交联提供反应微环境。随着扩散的持续，交联的透明质酸钠层逐渐增厚，而交联层的厚度和交联度通过改变透明质酸钠浓度和反应时间进行调控。具体的，可通过增加单位体积水相中透明质酸钠的含量来增加交联层的厚度，可通过控制BDDE交联剂的添加量和反应时间来控制交联层的交联度（也就是说在同样含量的透明质酸钠和酸性微环境条件下，在一定的范围内，透明质酸钠凝胶的交联度会随着交联剂用量的增多而提升的。）另外，一定范围内，透明质酸钠凝胶的交联度也会受反应时间影响，也可通过弱酸的含量来控制，这个控制过程酸性条件是动态变化的。

[0109] 在一种实施方式中，所述丝素蛋白溶液、透明质酸钠溶液和1,4‑丁二醇二缩水甘油醚的体积比为5 200:10 150:1 2，优选体积比为30:20:1。~ ~ ~

[0110] 步骤S5、除去未交联的透明质酸钠溶液，并通过水洗得到石榴式凝胶球。

[0111] 具体的，通过过滤或离心去除多余的，未交联的透明质酸钠溶液，再进行水洗得到石榴式凝胶球。

[0112] 下面通过具体实施例及图2‑图12进行详细说明本申请公开的具备核壳结构的石榴式凝胶球的制备方法。

[0113] 实施例1

[0114] （1）丝素蛋白溶液的制备

[0115] ①丝素蛋白溶液的配置

[0116] 称取60g生丝和25.44g的无水碳酸钠备用，量取12L的去离子水倒入不锈钢桶中，并用电磁炉加热。在去离子水即将沸腾时，加入称量好的无水碳酸钠，继续加热并搅拌至沸腾，使得无水碳酸钠充分溶解，再加入称量好的生丝，保持沸腾煮90min，每隔5min搅拌一次，以溶解生丝表面的丝胶。将脱胶后的生丝用去离子水揉搓4遍，使得生丝表面的丝胶充分清除，最后将脱胶丝中的水分拧干，置于通风橱过夜干燥。

[0117] 将干燥的脱胶蚕丝称取25g放到盛有9.3M的100mL溴化锂的烧杯中，并用玻璃棒搅动润湿，锡箔纸封口后。将烧杯放置在60℃烘箱中加热4小时以促进脱胶蚕丝溶解。紧接着，将全部溶解后的丝素蛋白、溴化锂共混液倒入截留分子量为3500Da的透析袋中，并用透析夹固体两端。将装有丝素蛋白、溴化锂共混液的透析袋放入盛有20L去离子水的塑料桶中，使用涡流振动器不断在容器底部振动以加快溴化锂的溶出，透析时间为72小时，总共换水9‑10次。待溴化锂去除干净后，将丝素蛋白溶液放置于离心机中并在转速为9000rpm和4℃低温条件下下反复离心两次，最后得到干净的丝素蛋白溶液。

[0118] ②丝素蛋白溶液浓度的测定

[0119] 进一步通过称重法测定丝素蛋白溶液浓度，即取称重皿称重记为W1，在皿中加入VmL蚕丝素蛋白溶液后放入60℃烘箱中干燥6小时后再次称重并标记为W2。依据下列公式计算出丝素蛋白溶液的浓度（W/V）。

[0120] 浓度=（W2‑W1）/ V×100%

[0121] 经计算得到浓度为7.5%（W/V）的丝素蛋白溶液，即7.5份质量的丝素蛋白溶解在100mL的水中，并将其放置于4℃冰箱保存。

[0122] （2）酸性丝素蛋白凝胶球（内核）的制备

[0123] 将20ml的7.5%（W/V）的丝素蛋白溶液与10mL，12.6%（W/V）的柠檬酸溶液混合均匀后，经超声波细胞粉碎机进行超声处理，振幅75%，间歇超声（超声50s，停10s），超声共计5 min；再将超声处理后的混合液放置在60℃的烘箱温育，12‑20小时后变成粘度明显增大的乳白色液体后（即将成胶，成胶时间应小于1小时）再加入150mL含有1%Span80（V/V）的大豆油中（60℃），并在磁力搅拌器下搅拌1小时（1000 r/min，60℃）；可获得丝素蛋白凝胶球内核。

[0124] （3）石榴式凝胶球的制备

[0125] 向（2）中加入20ml，4%（W/V）的透明质酸钠溶液，经60℃的磁力水浴锅中搅拌10 分钟混合均匀后，再逐滴加入1mL浓度为1%（W/V）的BDDE（1,4‑丁二醇二缩水甘油醚），继续在60℃水浴锅中继续搅拌6 小时，其中丝素蛋白、透明质酸钠、BDDE三者的体积比范围为5~
200:10 150:1 2，优选的体积比为30:20:1，最终得到核壳结构的石榴式凝胶球。
~ ~

[0126] （4）石榴式凝胶球的洗涤

[0127] 将（3）中制备得到的凝胶球悬浮液室温静置2小时后倒去上清液，加入50mL的乙酸乙酯溶液充分悬浮，经高速均质机在10000rpm/分钟条件下均质1分钟，静置5分钟后去除乙酸乙酯，分别经纯乙醇、50%乙醇洗涤3次，紧接着加入0.25M的氢氧化钠调节pH至中性后再用去离子水洗3次，去除大豆油、柠檬酸、游离透明质酸钠、BDDE等物质，最终得到干净的石榴式凝胶球，获取的石榴式凝胶球如图3所示。

[0128] 实施例2

[0129] 实施例2中使用的丝素蛋白溶液的制备方法及浓度同实施例1，且石榴式凝胶球的洗涤也同实施例1，获取的石榴式凝胶球如图4。

[0130] （1）酸性丝素蛋白凝胶球（内核）的制备

[0131] 将20mL 的7.5%（W/V）的丝素蛋白溶液与10mL，12.6%（W/V）的柠檬酸溶液混合均匀后，经超声波细胞粉碎机进行超声处理，振幅75%，间歇超声（超声50s，停10s），超声共计5 分钟；再将超声处理后的混合液放置在60℃的烘箱温育，12‑20小时后变成粘度明显增大的乳白色液体后（即将成胶，成胶时间应小于1小时）再加入150mL含有1% Span80（V/V）的大豆油中（60℃），并在磁力搅拌器下搅拌1小时（1000 r/min，60℃）；可获得丝素蛋白凝胶球。

[0132] （2）石榴式凝胶球的制备

[0133] 向（1）中加入300mL的的分散质，其中所述分散质包括油酸乙酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等，经60℃的磁力水浴锅中搅拌混合均匀后，继续加入20ml，4%（W/V）的透明质酸钠溶液，搅拌10 分钟混合均匀后，再逐滴加入1mL（密度1g/mL）的BDDE，在30‑60℃的磁力水浴锅中继续搅拌6小时，最终得到石榴式凝胶球。

[0134] 实施例2的石榴式凝胶球，在制备过程中，在制得丝素蛋白凝胶球后再次加入分散质，增加了油相的体积，获取粒径范围为1‑500μm的石榴式凝胶球。

[0135] 实施例3

[0136] 实施例3中使用的丝素蛋白溶液的制备方法及浓度同实施例1，且石榴式凝胶球的洗涤也同实施例1，获取的石榴式凝胶球如图5。

[0137] （1）酸性丝素蛋白凝胶球（内核）的制备

[0138] 将20mL 的7.5%（W/V）的丝素蛋白溶液与10mL，12.6%（W/V）的柠檬酸溶液混合均匀后，经超声波细胞粉碎机进行超声处理，振幅75%，间歇超声（超声50s，停10s），超声共计5分钟；再将超声处理后的混合液放置在60℃的烘箱温育，12‑20小时后变成粘度明显增大的乳白色液体后（即将成胶，成胶时间应小于1小时）再加入150mL含有1% Span80（V/V）的大豆油中（60℃），并在磁力搅拌器下搅拌1小时（1000 r/min，60℃）；可获得丝素蛋白凝胶球。

[0139] （2）石榴式凝胶球的制备

[0140] 向（1）中加入300 mL的分散质，其中所述分散质包括油酸乙酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等经60℃的磁力水浴锅中搅拌混合均匀后，继续加入20g，4%的透明质酸钠溶液搅拌10 分钟混合均匀后，再向其逐滴加入1mL（密度1g/mL）的BDDE，在60℃‑90℃水浴锅中继续搅拌6小时，最终得到石榴式凝胶球。

[0141] 实施例4

[0142] 实施例4中使用的丝素蛋白溶液的制备方法及浓度同实施例1，且石榴式凝胶球的洗涤也同实施例1，获取的石榴式凝胶球如图6。

[0143] （1）酸性丝素蛋白凝胶球（内核）的制备

[0144] 将20mL的7.5%（W/V）的丝素蛋白溶液与10mL，12.6%（W/V）的柠檬酸溶液混合均匀后，经超声波细胞粉碎机进行超声处理，振幅75%，间歇超声（超声50s，停10s），超声共计5分钟；再将超声处理后的共混液放置在60℃的烘箱温育，20小时后混合液的粘度明显增大（即将成胶，成胶时间应小于1h）再加入300mL含有1% Span80（V/V）的大豆油中（60℃），并在磁力搅拌器下搅拌1小时（1000 r/min，60℃）；可获得丝素蛋白凝胶球。

[0145] （2）石榴式凝胶球的制备

[0146] 向（1）中加入600mL的分散质，其中所述分散质包括油酸乙酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等，经60℃的磁力水浴锅中搅拌混合均匀后，继续加入40g，2%的透明质酸钠溶液并在搅拌转速3000rpm/min，搅拌时间10分钟的条件下搅拌混合均匀，再向其逐滴加入1mL的BDDE，在60℃水浴锅中继续搅拌4小时，最终得到核壳结构的石榴式凝胶球。

[0147] 实施例5

[0148] 在一个实施例中，实施例5中的石榴式凝胶球洗涤干净后如图7，石榴式凝胶球的注射过程如下：将（1）中的石榴式凝胶球悬浮液先经超声分散（振幅50%，超声30s），再经100目滤网过筛得到尺寸相对均一的凝胶球，如图8，放置60℃烘箱干燥后如图9，称量125mg干燥固体凝胶球后，用注射器吸取5mL的纯水溶液悬浮溶胀后，如图10，再加入125mg透明质酸钠干粉混合研磨均匀后灌装至1mL的注射器中，并用26G针头注射，如图11‑图12。

[0149] 下面通过实验数据和图13‑图15说明本申请实施例制备的凝胶球的性能参数，回弹性实验：

[0150] 将上述实施例1方法制备的石榴式凝胶球，通过质构仪（TMS‑PRO，美国）进行压缩弹性评估。加载速度为30mm/min，压缩型变量为60%。当凝胶球被压缩到原始高度的40%时停止压缩然后释放压力，当压力传感器回复到起始位置时再次压缩，重复进行压缩释放75个循环。采用Origin软件对支架60%应变内的线性区域进行拟合，所得拟合的直线斜率就是凝胶球的压缩模量，经拟合后该石榴式凝胶器球的压缩模量为1.09kPa。另外，当应变为60%时，相比于第1次压缩循环，应力依然达到50%以上，且经75次循环压缩后的曲线与10次的依然重叠在一起，说明石榴式凝胶球具有优异的回弹性，见图13。

[0151] 可注射性实验：

[0152] 将上述实施例1方法制备的石榴式凝胶球用滤纸尽可能吸去凝胶球表面水分，用烘干称重法测定凝胶球中的透明质酸和丝素蛋白的总含量。将凝胶球装入1mL注射器中，使用质构仪及压力为50N的测压元件，将含有凝胶球的26G针头的注射器以10mL/min的速度垂直施加压力，使凝胶球穿过针，记录注射力随时间的变化。由图14可知，含固量为8wt%（干重/湿重）的石榴式凝胶球可通过26G针头直接注射出来，整个过程的推注力在25N以下，可注射性良好。

[0153] 将实施例5中的石榴式凝胶球装入1mL注射器中，使用质构仪及压力为50N的测压元件，将含有凝胶球的26G针头的注射器以10mL/min的速度垂直施加压力，使凝胶球穿过针，记录注射力随时间的变化。由图15可知，含固量为2.5wt%（干重/湿重）的石榴式凝胶球可通过26G针头直接注射出来，且整个过程的推注力均在8N以下，可注射性优异。

[0154] 在本文中，“第一”、“第二”等仅用于彼此的区分，而非表示它们的重要程度及顺序等。

[0155] 本文中的模块的划分仅仅是一种逻辑功能的划分，在实际实现时可以有其他的划分方式，例如多个模块可以结合或集成于另一个系统中。作为分离部件说明的模块在物理上可以是分开的，也可以是不分开的。

[0156] 以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。