一种延缓衰老的复合发酵物及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202210483369.7
文献号 : CN114931537B
文献日 : 2023-05-02
发明人 : 何敬愉 , 潘丹阳 , 陈慧芳 , 陈英杰
申请人 : 广州环亚化妆品科技股份有限公司
摘要 :
本发明属于化妆品技术领域，公开了一种延缓衰老的复合发酵物及其制备方法和应用。该复合发酵物的制备方法包括步骤：将原料与卵磷脂、甘油混合，高压均质，得到复合原液；将复合原液和发酵菌株混合，发酵，得到复合发酵物；原料包括人参、灵芝、黑松茸、石斛、丹参、地黄、枸杞中的两种或两种以上；发酵菌株包括枯草芽孢杆菌、红曲霉菌、酿酒酵母中的一种或一种以上。本发明通过将高压均质和定向微生物发酵技术进行有机结合，在高压均质过程辅以卵磷脂和甘油，可以使植物细胞充分破碎，充分释放，提高原料的利用效率，高压均质得到的复合原液作为后续的发酵基质，通过微生物的生物转化能力，可制备得到具有显著延缓衰老功效的复合发酵物。
权利要求 :
1.一种复合发酵物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将原料与卵磷脂、甘油混合，高压均质，得到复合原液；
将所述复合原液和发酵菌株混合，发酵，得到所述复合发酵物；
所述原料选用人参和灵芝；
或所述原料选用人参、灵芝和石斛；
或所述原料选用人参、灵芝、石斛和枸杞；
或所述原料选用人参、灵芝、石斛、丹参和枸杞；
或所述原料选用人参、灵芝、石斛、丹参和地黄；
或所述原料选用人参、灵芝、石斛、丹参、地黄和枸杞；
或所述原料选用人参、灵芝、黑松茸、石斛、丹参、地黄和枸杞；
所述高压均质的压力为20‑100MPa；
所述发酵菌株由枯草芽孢杆菌、红曲霉菌、酿酒酵母中的一种或一种以上组成。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述高压均质的温度为25‑50℃，所述高压均质的时间为5‑40min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在进行所述发酵前，还加入培养基和水。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述复合原液、所述发酵菌株、所述培养基和所述水的用量比为(1‑500g)：(0.01‑10mL)：1g：(1‑500g)。
5 9
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵菌株的浓度为10 ‑10CFU/mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的温度为20‑45℃，所述发酵的时间为12‑120h。
7.一种复合发酵物，其特征在于，采用权利要求1‑6任一项所述的制备方法制备而成。
8.权利要求7所述的复合发酵物在制备化妆品中的应用。
9.一种化妆品，其特征在于，包括权利要求7所述的复合发酵物以及化妆品中可接受的辅料，所述复合发酵物占所述化妆品的质量百分比为0.01‑80％。
10.根据权利要求9所述的化妆品，其特征在于，所述复合发酵物占所述化妆品的质量百分比为0.05‑20％。
说明书 :
一种延缓衰老的复合发酵物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于化妆品技术领域，特别涉及一种延缓衰老的复合发酵物及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 近年来，人们对延缓皮肤衰老的需求日益强烈，有关抗皮肤衰老的研究逐渐深入，针对皮肤衰老机制，各类抗衰老活性物质不断问世。随着科学的不断发展，天然植物中的活性成分及其功效被不断挖掘。目前，获取天然植物中的活性成分，通常采用水浸提法或醇浸提法，这些传统提取方法存在收率低，耗能高的问题，且得到的提取物的效果并不明显；还有些厂家采用超临界CO2萃取进行提取，但是设备要求高，成本高。
发明内容
[0003] 本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种延缓衰老的复合发酵物及其制备方法和应用，通过在高压均质过程辅以卵磷脂和甘油，使细胞充分破碎，提高有效成分溶出率，并且和微生物发酵技术进行有机结合，使得本发明复合发酵物具有显著的延缓衰老的功效。
[0004] 本发明的第一方面提供一种复合发酵物的制备方法，包括以下步骤：
[0005] 将原料与卵磷脂、甘油混合，高压均质，得到复合原液；
[0006] 将所述复合原液和发酵菌株混合，发酵，得到所述复合发酵物；
[0007] 所述原料包括人参、灵芝、黑松茸、石斛、丹参、地黄、枸杞中的两种或两种以上；
[0008] 所述高压均质的压力为20‑100MPa；
[0009] 所述发酵菌株包括枯草芽孢杆菌、红曲霉菌、酿酒酵母中的一种或一种以上。
[0010] 与传统提取技术相比，现代微生物发酵技术发展也给植物提取带来了新的启示。结合现代发酵工程而形成的植物活性成分提取技术，可以开发出兼具植物和微生物双重特色的原料。研究表明，微生物在生长过程中可以产生很多生物活性成分包括多种酶、小分子化合物等，这些物质是优良的护肤原料。植物经过微生物发酵处理后，其产物含有更出色、更有效的皮肤保护作用；将这些产物通过科学的方法复配运用，能够增强皮肤组织细胞活性，促进皮肤组织细胞新陈代谢，改善皮肤组织微循环，使皮肤焕发健康状态。本发明以人参、灵芝、黑松茸、石斛、丹参、地黄、枸杞中的两种或两种以上的组合为原料，通过将高压均质和定向微生物发酵技术进行有机结合，在高压均质过程辅以卵磷脂和甘油，可以使植物细胞充分破碎，使细胞内的各种组分快速、充分释放，提高原料的利用效率，高压均质得到的复合原液作为后续的发酵基质，通过微生物的生物转化能力，可制备得到具有显著延缓衰老功效的复合发酵物。
[0011] 本发明所用原料的功效如下：
[0012] 人参具有美白消斑、去皱抗衰、润肤驻颜的功效，主要含有人参皂苷和人参多糖。
[0013] 灵芝具有增强气色、去皱抗衰的功效，主要含有三萜类、多糖类、多肽类和挥发油成分。
[0014] 枸杞具有悦容增颜、祛斑润肤的功效，主要含有黄酮类、生物碱、多糖和维生素。
[0015] 黑松茸和石斛含有丰富的多糖和生物碱类成分，有很好的清除自由基能力和保湿的功效。
[0016] 丹参含有大量的酚酸类成分，有很强的抗氧化和促进血液循环的功效。
[0017] 地黄含有环烯醚萜类成分，具有很好的消炎功效。
[0018] 优选地，所述高压均质的温度为25‑50℃，所述高压均质的时间为5‑40min。更为优选地，所述高压均质的温度为30‑45℃，所述高压均质的压力为40‑100MPa，所述高压均质的时间为10‑30min。
[0019] 优选地，所述复合发酵物的制备方法，包括以下步骤：
[0020] 将人参、灵芝、黑松茸、石斛、丹参、地黄、枸杞与卵磷脂、甘油、水混合，高压均质，得到复合原液；
[0021] 将所述复合原液和发酵菌株混合，发酵，得到所述复合发酵物；
[0022] 所述高压均质的压力为20‑100MPa；
[0023] 所述发酵菌株包括枯草芽孢杆菌、红曲霉菌、酿酒酵母中的一种或一种以上；
[0024] 所述人参、灵芝、黑松茸、石斛、丹参、地黄、枸杞、卵磷脂、甘油和离子水的用量比为(0.01‑50g)：(0.01‑50g)：(0.01‑50g)：(0.01‑50g)：(0.01‑50g)：(0.01‑50g)：(0.01‑50g)：(0.01‑50g)：1g：(1‑1000g)。更为优选地，所述人参、灵芝、黑松茸、石斛、丹参、地黄、枸杞、卵磷脂、甘油和离子水的用量比为(0.01‑1g)：(0.01‑1g)：(0.01‑1g)：(0.01‑1g)：
(0.01‑1g)：(0.01‑1g)：(0.01‑1g)：(0.01‑1g)：1g：(1‑100g)。
(0.01‑1g)：(0.01‑1g)：(0.01‑1g)：(0.01‑1g)：1g：(1‑100g)。
[0025] 优选地，在进行所述发酵前，还加入培养基和水。
[0026] 优选地，所述复合原液、所述发酵菌株、所述培养基和所述水的用量比为(1‑500g)：(0.01‑10mL)：1g：(1‑500g)。
[0027] 优选地，所述发酵菌株的浓度为105‑109CFU/mL。
[0028] 优选地，所述发酵的温度为20‑45℃，所述发酵的时间为12‑120h。更为优选地，所述发酵的温度为25‑40℃，所述发酵的时间为12‑84h。
[0029] 本发明的第二方面提供一种复合发酵物，其采用本发明所述的制备方法制备而成。
[0030] 本发明的第三方面提供本发明所述的复合发酵物在制备化妆品中的应用。
[0031] 基于上述应用，本发明还提供了一种化妆品，其包括本发明所述的复合发酵物以及化妆品中可接受的辅料，所述复合发酵物占所述化妆品的质量百分比为0.01‑80％。
[0032] 优选地，所述化妆品中可接受的辅料包括乳化剂、保湿剂、增稠剂、防腐剂中的一种或多种。
[0033] 优选地，所述复合发酵物占所述化妆品的质量百分比为0.05‑20％。
[0034] 相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
[0035] 本发明通过将高压均质和定向微生物发酵技术进行有机结合，以人参、灵芝、黑松茸、石斛、丹参、地黄、枸杞中的两种或两种以上的组合为原料，在高压均质过程辅以卵磷脂和甘油，可以使植物细胞充分破碎，使细胞内的各种组分快速、充分释放，提高原料的利用效率，高压均质得到的复合原液作为后续的发酵基质，通过微生物的生物转化能力，可制备得到具有显著延缓衰老功效的复合发酵物。
[0036] 本发明制得的复合发酵物具有很高的DPPH自由基清除率(高达87.52％)，可以降低人皮肤成纤维细胞(HDF)中衰老细胞的数量，降低HDF中基质金属蛋白酶‑1(MMP‑1)mRNA的相对表达量、提高I型胶原蛋白(COL‑I)mRNA的相对表达量，对UV照射后的人永生化角质形成细胞(HaCat)具有保护作用、促进细胞生长，具有显著的抗衰老功效，同时可以降低UV照射后HaCat细胞产生的炎症因子IL‑1β和TNF‑α的含量，具有抗炎功效。
具体实施方式
[0037] 为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
[0038] 以下实施例中所用的原料、试剂或仪器如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
[0039] 实施例1
[0040] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0041] 将人参10g、灵芝10g、黑松茸5g、石斛5g、丹参5g、地黄5g、枸杞5g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0042] 将100g复合原液、2mL枯草芽孢杆菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g LB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵48h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0043] 实施例2
[0044] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0045] 将人参10g、灵芝10g、石斛10g、丹参5g、地黄5g、枸杞5g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0046] 将100g复合原液、2mL枯草芽孢杆菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g LB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵48h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0047] 实施例3
[0048] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0049] 将人参10g、灵芝10g、石斛10g、丹参5g、地黄10g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0050] 将100g复合原液、2mL枯草芽孢杆菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g LB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵48h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0051] 实施例4
[0052] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0053] 将人参10g、灵芝10g、石斛10g、丹参5g、枸杞10g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0054] 将100g复合原液、2mL枯草芽孢杆菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g LB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵48h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0055] 实施例5
[0056] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0057] 将人参15g、灵芝10g、石斛10g、枸杞10g、卵磷脂10g、甘油35g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为100MPa，均质时间为15min，即得复合原液；
[0058] 将100g复合原液、2mL枯草芽孢杆菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g LB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵48h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0059] 实施例6
[0060] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0061] 将人参15g、灵芝15g、石斛10g、卵磷脂5g、甘油55g、去离子水300g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为100MPa，均质时间为15min，即得复合原液；
[0062] 将100g复合原液、2mL枯草芽孢杆菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g LB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵48h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0063] 实施例7
[0064] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0065] 将人参20g、灵芝20g、卵磷脂5g、甘油55g、去离子水300g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为25min，即得复合原液；
[0066] 将100g复合原液、2mL枯草芽孢杆菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g LB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵48h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0067] 实施例8
[0068] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0069] 将人参10g、灵芝10g、黑松茸5g、石斛5g、丹参5g、地黄5g、枸杞5g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0070] 将100g复合原液、1mL红曲霉菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g PDB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵30h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0071] 实施例9
[0072] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0073] 将人参10g、灵芝10g、石斛10g、丹参5g、地黄5g、枸杞5g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0074] 将100g复合原液、1mL红曲霉菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g PDB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵30h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0075] 实施例10
[0076] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0077] 将人参10g、灵芝10g、石斛10g、丹参5g、地黄10g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0078] 将100g复合原液、1mL红曲霉菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g PDB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵30h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0079] 实施例11
[0080] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0081] 将人参10g、灵芝10g、石斛10g、丹参5g、枸杞10g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0082] 将100g复合原液、1mL红曲霉菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g PDB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵30h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0083] 实施例12
[0084] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0085] 将人参15g、灵芝10g、石斛10g、枸杞10g、卵磷脂10g、甘油35g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为100MPa，均质时间为15min，即得复合原液；
[0086] 将100g复合原液、1mL红曲霉菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g PDB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵30h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0087] 实施例13
[0088] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0089] 将人参15g、灵芝15g、石斛10g、卵磷脂5g、甘油55g、去离子水300g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为100MPa，均质时间为15min，即得复合原液；
[0090] 将100g复合原液、1mL红曲霉菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g PDB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵30h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0091] 实施例14
[0092] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0093] 将人参20g、灵芝20g、卵磷脂5g、甘油55g、去离子水300g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为25min，即得复合原液；
[0094] 将100g复合原液、1mL红曲霉菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g PDB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵30h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0095] 实施例15
[0096] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0097] 将人参10g、灵芝10g、黑松茸5g、石斛5g、丹参5g、地黄5g、枸杞5g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0098] 将100g复合原液、1mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、2g PDB培养基和100g去离子水混合，在32℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0099] 实施例16
[0100] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0101] 将人参10g、灵芝10g、石斛10g、丹参5g、地黄5g、枸杞5g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0102] 将100g复合原液、1mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、2g PDB培养基和100g去离子水混合，在32℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0103] 实施例17
[0104] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0105] 将人参10g、灵芝10g、石斛10g、丹参5g、地黄10g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0106] 将100g复合原液、1mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、2g PDB培养基和100g去离子水混合，在32℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0107] 实施例18
[0108] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0109] 将人参10g、灵芝10g、石斛10g、丹参5g、枸杞10g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0110] 将100g复合原液、1mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、2g PDB培养基和100g去离子水混合，在32℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0111] 实施例19
[0112] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0113] 将人参15g、灵芝10g、石斛10g、枸杞10g、卵磷脂10g、甘油35g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为100MPa，均质时间为15min，即得复合原液；
[0114] 将100g复合原液、1mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、2g PDB培养基和100g去离子水混合，在32℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0115] 实施例20
[0116] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0117] 将人参15g、灵芝15g、石斛10g、卵磷脂5g、甘油55g、去离子水300g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为100MPa，均质时间为15min，即得复合原液；
[0118] 将100g复合原液、1mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、2g PDB培养基和100g去离子水混合，在32℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0119] 实施例21
[0120] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0121] 将人参20g、灵芝20g、卵磷脂5g、甘油55g、去离子水300g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为25min，即得复合原液；
[0122] 将100g复合原液、1mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、2g PDB培养基和100g去离子水混合，在32℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0123] 对比例1(与实施例1的区别在于采用常规水煎煮)
[0124] 一种复合提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0125] 将人参10g、灵芝10g、黑松茸5g、石斛5g、丹参5g、地黄5g、枸杞5g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，在100℃下加热提取2h，过滤，收集滤液，得到复合提取物。
[0126] 对比例2(与实施例1的区别在于将枯草芽孢杆菌菌液替换为去离子水)
[0127] 本对比例与实施例1相比，区别在于将枯草芽孢杆菌菌液替换为去离子水，且加入量相同，其他组分、添加量以及制备方法与实施例1相同。
[0128] 对比例3(与实施例1的区别在于未添加卵磷脂和甘油)
[0129] 本对比例与实施例1相比，区别在于采用等量的去离子水代替卵磷脂和甘油，其他组分、添加量以及制备方法与实施例1相同。
[0130] 对比例4(与实施例1的区别在于将卵磷脂替换为大豆油)
[0131] 本对比例与实施例1相比，区别在于将卵磷脂替换为大豆油，且加入量相同，其他组分、添加量以及制备方法与实施例1相同。
[0132] 对比例5(与实施例1的区别在于将甘油替换为丁二醇)
[0133] 本对比例与实施例1相比，区别在于将甘油替换为丁二醇，且加入量相同，其他组分、添加量以及制备方法与实施例1相同。
[0134] 对比例6(与实施例1的区别在于采用单一原料)
[0135] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0136] 将人参45g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0137] 将100g复合原液、2mL枯草芽孢杆菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g LB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵48h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0138] 对比例7(与实施例8的区别在于采用单一原料)
[0139] 将枸杞45g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0140] 将100g复合原液、1mL红曲霉菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4gPDB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵48h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0141] 对比例8(与实施例15的区别在于采用单一原料)
[0142] 将灵芝45g、卵磷脂5g、甘油40g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0143] 将100g复合原液、1mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、2gPDB培养基和100g去离子水混合，在30℃下发酵48h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0144] 对比例9(与实施例1的区别在于卵磷脂和甘油的添加顺序不同)
[0145] 一种复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
[0146] 将人参10g、灵芝10g、黑松茸5g、石斛5g、丹参5g、地黄5g、枸杞5g、去离子水310g混合后，再加入高压均质机中，均质温度为40℃，均质压力为80MPa，均质时间为20min，即得复合原液；
[0147] 将100g复合原液、2mL枯草芽孢杆菌菌液(浓度为107CFU/mL)、4g LB培养基、卵磷脂5g、甘油40g和100g去离子水混合，在30℃下发酵48h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30min，在转速为5000rpm/min下，离心30min，取离心后的上清液，得到复合发酵物。
[0148] 试验例1：红细胞溶血性评价
[0149] 红细胞溶血实验基本原理是通过测定血红蛋白溶出量及变性程度来评价化学品对眼组织细胞的损伤。
[0150] 以实施例1‑21和对比例1‑9制备的样品进行红细胞溶血实验，本实验依照欧洲替代方法验证中心(ECVAM)的RBC实验测试方法及分级标准。其中HD50为50％红细胞发生溶血时的样品浓度，DI为蛋白质变性指数，L/D为HD50与DI的比值。评价标准见表1；评价结果见表2。
[0151] 表1
[0152] L/D 分级L/D>100 无刺激性
1010.1L/D≤0.1 重度刺激性
10
[0153] 表2
[0154]样品 分级 样品 分级
实施例1 无刺激性 实施例16 无刺激性
实施例2 无刺激性 实施例17 无刺激性
实施例3 无刺激性 实施例18 无刺激性
实施例4 无刺激性 实施例19 无刺激性
实施例5 无刺激性 实施例20 无刺激性
实施例6 无刺激性 实施例21 无刺激性
实施例7 无刺激性 对比例1 微刺激性
实施例8 无刺激性 对比例2 无刺激性
实施例9 无刺激性 对比例3 无刺激性
实施例10 无刺激性 对比例4 无刺激性
实施例11 无刺激性 对比例5 无刺激性
实施例12 无刺激性 对比例6 无刺激性
实施例13 无刺激性 对比例7 无刺激性
实施例14 无刺激性 对比例8 无刺激性
实施例15 无刺激性 对比例9 无刺激性
实施例1 无刺激性 实施例16 无刺激性
实施例2 无刺激性 实施例17 无刺激性
实施例3 无刺激性 实施例18 无刺激性
实施例4 无刺激性 实施例19 无刺激性
实施例5 无刺激性 实施例20 无刺激性
实施例6 无刺激性 实施例21 无刺激性
实施例7 无刺激性 对比例1 微刺激性
实施例8 无刺激性 对比例2 无刺激性
实施例9 无刺激性 对比例3 无刺激性
实施例10 无刺激性 对比例4 无刺激性
实施例11 无刺激性 对比例5 无刺激性
实施例12 无刺激性 对比例6 无刺激性
实施例13 无刺激性 对比例7 无刺激性
实施例14 无刺激性 对比例8 无刺激性
实施例15 无刺激性 对比例9 无刺激性
[0155] 由表2可知，除了对比例1有微刺激性外，实施例1‑21及对比例2‑9制备的样品均对红细胞没有刺激性。
[0156] 试验例2：DPPH自由基清除能力评价
[0157] 清除DPPH自由基能力在一定程度上反应物质的抗氧化能力。自由基清除率越大，表明抗氧化能力越强，抗衰老能力越强。因此，可以通过样品对清除DPPH自由基能力的研究来判断其抗衰老效果。以实施例1‑21和对比例1‑9制备的样品进行下面试验，结果见表3所示。
[0158] 向试管中加入质量浓度为45.8mg/L的DPPH测试液2.0mL和样品0.05mL，总体积用50％乙醇(v/v)补充至3mL，摇匀，避光反应30min后，用1cm比色皿在517nm波长处测定吸光度，记为A1；向试管中加入无水乙醇2mL和相应体积的待测样品，总体积用50％乙醇(v/v)补充至3mL，测得的吸光度记为A2；向试管中加入DPPH测试液2mL和50％乙醇(v/v)1mL，测得的吸光度记为A3。按以下公式计算待测液对DPPH自由基清除率(Y)；
[0159] DPPH自由基清除率的计算公式为：Y(％)＝[1‑(A1‑A2)/A3]×100；
[0160] 式中A1为空白对照清除DPPH后体系的吸光度值，A2为样品清除DPPH后体系的吸光度值，A3为未加药品前反应体系的吸光度值。
[0161] 表3
[0162]
[0163]
[0164] 表3结果表明，相比于对比例1‑9，实施例1‑21制得的复合发酵物具有更强的清除DPPH自由基能力。
[0165] 试验例3：衰老相关β‑半乳糖苷酶(SA‑β‑gal)测定
[0166] 人皮肤成纤维细胞(HDF)在6孔板中以每孔1×104个细胞的密度在37℃下，质量分数5％CO2培养24小时。HDF用样品(5％)处理24小时后，HDF用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗两2
次，在30J/cm的UVB照射。然后，去除PBS，HDF用样品(5％)在37℃下，质量分数5％CO2培养24小时。用1毫升PBS清洗，然后加入0.5毫升固定液，然后在室温下放置15分钟以固定。在固定化的HDF中加入0.5mL混合染色溶液(染色溶液470μL，染色补充液5μL，含有20mg/mL X‑gal的二甲基甲酰胺25μL)，在37℃下培养24小时，对细胞进行染色。然后，用PBS清洗染色细胞，每个样本板随机选取500个成纤维细胞显微镜下进行拍照，并对SA‑β‑Gal染色的成纤维细胞计数。衰老细胞相对比率＝样品中衰老细胞数/模型组衰老细胞数×100；结果见表4所示。
次，在30J/cm的UVB照射。然后，去除PBS，HDF用样品(5％)在37℃下，质量分数5％CO2培养24小时。用1毫升PBS清洗，然后加入0.5毫升固定液，然后在室温下放置15分钟以固定。在固定化的HDF中加入0.5mL混合染色溶液(染色溶液470μL，染色补充液5μL，含有20mg/mL X‑gal的二甲基甲酰胺25μL)，在37℃下培养24小时，对细胞进行染色。然后，用PBS清洗染色细胞，每个样本板随机选取500个成纤维细胞显微镜下进行拍照，并对SA‑β‑Gal染色的成纤维细胞计数。衰老细胞相对比率＝样品中衰老细胞数/模型组衰老细胞数×100；结果见表4所示。
[0167] 表4
[0168]
[0169]
[0170] 表4结果表明，相比于对比例1‑9，采用实施例1‑21制得的复合发酵物处理HDF后，可以降低HDF中衰老细胞的数量，说明实施例1‑21复合发酵物具有延缓衰老的作用。
[0171] 试验例4：人I型胶原蛋白和基质金属蛋白酶分析
[0172] HDF在6孔板中以每孔2×104个细胞的密度在37℃下，质量分数5％CO2培养24小时。2
HDF用样品(5％)处理24小时后，HDF用PBS清洗两次，在30J/cm的UVB照射。然后，去除PBS，HDF用样品(5％)在37℃下，质量分数5％CO2培养24小时。培养结束后，根据ELISA试剂盒操作方法，测定人I型胶原蛋白(COL‑I)和基质金属蛋白酶‑1(MMP‑1)的含量。
HDF用样品(5％)处理24小时后，HDF用PBS清洗两次，在30J/cm的UVB照射。然后，去除PBS，HDF用样品(5％)在37℃下，质量分数5％CO2培养24小时。培养结束后，根据ELISA试剂盒操作方法，测定人I型胶原蛋白(COL‑I)和基质金属蛋白酶‑1(MMP‑1)的含量。
[0173] 总RNA的提取物纯化根据试剂盒操作流程进行。通过260/280nm吸光度的比率测量RNA(3μL)浓度和纯度，并将剩余的RNA溶液储存在‑80℃用于逆转录。总RNA通过如下反转录系统转化为第一链互补DNA(cDNA)：4μL 5x prime Script RT Master MIX、0.5μg总RNA和20μL反应中的无RNase水。将cDNA用于实时PCR和反应体系含有10μL SYBR Premix EX Taq(2x)、1μL正向引物(10μM)、1μL反向引物(10μM)和8μL cDNA，其在Applied Biosystems7500Fast Real time PCR System v2.3版中根据以下条件扩增反应条件：50.0℃3分钟，95.0℃3分钟，然后95.0℃10秒和60.0℃30秒40个循环。通过仪器软件分析阈值循‑ΔΔCt
环(Ct)，并根据比较Ct方法(2 )计算mRNA表达的倍数变化。各基因正向、反向引物序列见表5所示；测试结果见表6、表7所示。
环(Ct)，并根据比较Ct方法(2 )计算mRNA表达的倍数变化。各基因正向、反向引物序列见表5所示；测试结果见表6、表7所示。
[0174] 表5
[0175]
[0176]
[0177] 表6
[0178]
[0179] 表7
[0180]
[0181]
[0182] 表6和表7结果表明，相比于对比例1‑9，实施例1‑21制得的复合发酵物在更好降低MMP‑1的含量的同时，还能提高COL‑I的含量。另外，实施例1‑21制得的复合发酵物还可以降低HDF中MMP‑1mRNA的相对表达量、提高COL‑I mRNA的相对表达。由于MMP‑1的提高和COL‑I的降低会引起皮肤衰老、产生皱纹，而本发明实施例1‑21制得的复合发酵物在降低MMP‑1的含量的同时，还能提高COL‑I的含量，表明实验例1‑21中的复合发酵物有更强的抗衰老功效。
[0183] 试验例5：对UV照射后人永生化角质形成细胞(HaCat)细胞存活率的影响
[0184] 将HaCat细胞接种至6孔板中，在37℃和5％CO2的培养箱孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到50％‑60％时，往空白对照组、模型组中加入细胞培养基，往受试样品组加入含2
有对应浓度受试样品(5％)的细胞培养基，预处理1h，然后进行UVB辐照(30mJ/cm)40min。
于37℃和5％CO2的培养箱中继续培养24h后吸取培养基，用PBS清洗2‑3次，采用MTT法测试细胞存活率，细胞相对存活率(％)＝样品组细胞存活率/模型组细胞存活率×100，测试结果如表8所示。
有对应浓度受试样品(5％)的细胞培养基，预处理1h，然后进行UVB辐照(30mJ/cm)40min。
于37℃和5％CO2的培养箱中继续培养24h后吸取培养基，用PBS清洗2‑3次，采用MTT法测试细胞存活率，细胞相对存活率(％)＝样品组细胞存活率/模型组细胞存活率×100，测试结果如表8所示。
[0185] 表8
[0186]样品 细胞相对存活率(％) 样品 细胞相对存活率(％)
实施例1 170.3 实施例16 158.8
实施例2 157.6 实施例17 161.3
实施例3 160.9 实施例18 155.5
实施例4 148.2 实施例19 154.0
实施例5 140.1 实施例20 144.2
实施例6 143.5 实施例21 141.3
实施例7 138.2 对比例1 109.7
实施例8 166.8 对比例2 111.0
实施例9 160.2 对比例3 117.2
实施例10 161.3 对比例4 122.1
实施例11 154.2 对比例5 119.4
实施例12 146.3 对比例6 125.6
实施例13 137.8 对比例7 120.3
实施例14 140.3 对比例8 121.5
实施例15 168.0 对比例9 124.4
实施例1 170.3 实施例16 158.8
实施例2 157.6 实施例17 161.3
实施例3 160.9 实施例18 155.5
实施例4 148.2 实施例19 154.0
实施例5 140.1 实施例20 144.2
实施例6 143.5 实施例21 141.3
实施例7 138.2 对比例1 109.7
实施例8 166.8 对比例2 111.0
实施例9 160.2 对比例3 117.2
实施例10 161.3 对比例4 122.1
实施例11 154.2 对比例5 119.4
实施例12 146.3 对比例6 125.6
实施例13 137.8 对比例7 120.3
实施例14 140.3 对比例8 121.5
实施例15 168.0 对比例9 124.4
[0187] 表8结果表明，相比于对比例1‑9，实施例1‑21制得的复合发酵物对UV照射后的HaCat细胞具有更好的保护作用，并且能够促进细胞的生长。
[0188] 试验例6：对UV照射后HaCaT细胞内IL‑1β和TNF‑α含量的影响
[0189] 将HaCat细胞接种至6孔板中，在37℃和5％CO2的培养箱孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到50％‑60％时，往空白对照组、模型组中加入细胞培养基，往受试样品组加入含2
有对应浓度受试物样品(5％)的细胞培养基，预处理1h，然后进行UVB辐照(30mJ/cm )
40min。于37℃和5％CO2的培养箱中继续培养24h。培养结束后，根据ELISA试剂盒操作方法，测定IL‑1β和TNF‑α的含量，测试结果如表9所示。
有对应浓度受试物样品(5％)的细胞培养基，预处理1h，然后进行UVB辐照(30mJ/cm )
40min。于37℃和5％CO2的培养箱中继续培养24h。培养结束后，根据ELISA试剂盒操作方法，测定IL‑1β和TNF‑α的含量，测试结果如表9所示。
[0190] 表9
[0191]
[0192]
[0193] 表9结果表明，相比于对比例1‑9，实施例1‑21制得的复合发酵物可以降低UV照射后HaCat细胞产生的炎症因子IL‑1β和TNF‑α的含量，表现出抗炎的活性。
[0194] 应用例1
[0195] 本应用例1提供一种含有本发明实施例1制得的复合发酵物的精华液，其具体配方如表10所示，制备方法按照常规精华液的制备方法制备而成。
[0196] 表10
[0197]
[0198]
[0199] 对比应用例1
[0200] 本对比应用例1与应用例1相比，区别在于将实施例1制得的复合发酵物替换为对比例1制得的复合提取物，且加入量相同，其他组分、添加量以及制备方法与应用例1相同。
[0201] 应用例1、对比应用例1的精华液的效果评价
[0202] 1、对象选取志愿者30名，年龄在20～45岁，男女各半。左侧使用应用例1的精华液，右侧使用对比应用例1的精华液，每天早午晚各使用一次，每次各涂抹1g产品于脸部，并按摩2分钟。根据感官评价填写试用评价表。使用7天、14天、28天各统计一次。志愿者在使用过程中对样品进行皮肤弹性(0‑5分)、紧致度(0‑5分)效果评价，其中最高分为5，表示效果显著，最低分为0表示没有效果。结果如表11所示。
[0203] 表11
[0204]
[0205] 2、对象选取志愿者30名，年龄在30～45岁女性。测试前，使用VISIA面部图像分析仪拍摄照片，分析志愿者眼部细纹的情况。请志愿者在洁面后使用相应组别的产品，其中左侧眼部使用应用例1的精华液，右侧眼部使用对比应用例1的精华液，1分钟后再次进行拍摄及分析，作为样品的即时淡纹效果。随后请志愿者连续试用待测样品，每日使用2次，每次使用0.5g，连续试用28d，在第7天和第28天进行回访，拍摄面部照片并进行分析，作为样品的长效淡纹效果。同一个志愿者的检测由同一个检测人员完成。通过检测仪器内置的分析系统，对眼部细纹的变化率进行计算，统计结果。结果如表12所示。
[0206] 表12
[0207]
[0208] 表11和表12结果表明，志愿者认为使用应用例1制备的精华液后，皮肤弹性、紧致度、眼部细纹方面得到显著改善，优于使用对比应用例1制备的精华液，此效果与复合发酵物能够提高COL‑I含量和降低MMP‑1含量是相关的。说明将本发明的复合发酵物应用到化妆品中具有显著的抗衰老功效。
[0209] 以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。