转基因NK细胞及其在抗肿瘤药物中的应用

摘要

本发明涉及转基因NK细胞及其在抗肿瘤药物中的应用。本申请提供了一种人IL‑2突变体、携带人IL‑2突变体的免疫细胞及其在抗肿瘤药物中的应用，所述人IL‑2突变体具有全新的氨基酸结构，在天然IL‑2序列基础上进行了多点突变尝试，其具有更强的NK‑92细胞促增殖能力和肿瘤细胞毒性；IL‑2突变体基因导入NK‑92细胞中，使其能够自主持续分泌该细胞因子，既能够满足自身需要，又能够避免全身给药造成的过重负担；该经过基因修饰后的NK‑92细胞获得了较强的肿瘤杀伤能力，能够有效对抗肺癌的实体肿瘤，在体内、体外都展现了令人满意的抗肿瘤效果；基因修饰的NK‑2细胞与顺铂等小分子药物联用，进一步提高了抗肿瘤活性，产生明显协同作用，强化了抗肿瘤效果。

权利要求

1. 一种人白细胞介素2突变体，其特征在于所述人白细胞介素2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2. 如权利要求1所述的人白细胞介素2突变体，其中所述人白细胞介素2突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3. 一种免疫细胞，其特征在于所述免疫细胞携带有编码如SEQ ID NO:1所示的人白细胞介素2突变体的基因，所述免疫细胞为NK细胞。

4. 如权利要求3所述的免疫细胞，其中所述人白细胞介素2突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.如权利要求4所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞为NK‑92细胞。

6.一种药物组合物，包括权利要求3至5中任一项所述的免疫细胞和小分子抗肿瘤药物，所述小分子抗肿瘤药物选自培美曲塞、吉西他滨、紫杉醇、顺铂、伊立替康中的一种或几种。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述小分子抗肿瘤药物为顺铂。

8.权利要求1至2中任一项所述的人白细胞介素2突变体或权利要求3至5中任一项所述的免疫细胞或权利要求6至7中任一项所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，所述肿瘤选自肝癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌。

说明书

转基因NK细胞及其在抗肿瘤药物中的应用

技术领域：

[0001] 本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体提供了一种转基因NK细胞及其在抗肿瘤药物中的应用。背景技术：

[0002] 癌症是严重危害人们生命健康的恶性疾病，在世界各个国家或地区的发病率、死亡率居高不下。肺癌是最为常见的癌症之一，据估计2021年，全球范围内有超过250万的新增肺癌患者，约占全球癌症患者的12％；其中男性患肺癌的比例更高，2021年约有163万病例，女性发病比例较男性略低，造成这种状况的原因可能与男性更倾向于吸烟、酗酒、熬夜等不良的生活习惯有关。肺癌的存活率低而死亡率高，每年有超过100万人死于该疾病及其并发症。并且令人担忧的，亚洲也是肺癌的高发地区之一，每年有数十万的新增肺癌患者。

[0003] 目前癌症的传统治疗手段以手术、放疗和化疗为主，虽然上述方法经过数十年的发展日臻成熟并挽救或延长了无数癌症患者的生命，但是面对肿瘤的新变化，尤其是耐药性、复发性、转移性癌症的出现，而显得越来越捉襟见肘。近年来出现的肿瘤免疫疗法，似乎给出了新的解决方案，这种疗法目的是增强对肿瘤细胞的免疫反应，进而借助机体自身的免疫机制抑制甚至杀死肿瘤细胞，并可与化学疗法、手术、放射疗法和靶向小分子结合使用，免疫肿瘤药物包括广泛的药物，包括抗体、疫苗、辅助疗法、细胞因子、溶瘤病毒、双特异性分子和细胞疗法。其中过继性细胞转移疗法取得了疗效最为显著，也受到了更多的关注，这种方法最初是输注淋巴细胞于患者体内治疗肿瘤，1980年代过继细胞移植的首次成功临床应用是基于在转移性黑色素瘤患者中使用自体肿瘤浸润淋巴细胞和在复发性白血病患者中输注同种异体供体淋巴细胞；1990年代随着基因技术的发展，通过使用T细胞受体或嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)来改善免疫细胞特异性成为可能，这种方式增强了T细胞的识别功能和杀伤功能，并且一旦注入患者体内CAR‑T细胞就会在患者体广泛增殖，通过抗原释放、协助肿瘤浸润淋巴细胞攻击肿瘤或通过自身的持久性来促进免疫监视以防止肿瘤复发，目前这种方法在血液瘤的治疗中取得了巨大成功，世界范围内已经有多种药物批准上市。然而以T细胞为基础的免疫疗法却具有如下缺点：(1)移植抗宿主反应，难以形成通用型细胞系，多以个体T细胞进行基因改造，过程繁琐、成本较高且易产生污染风险；(2)免疫因子风暴，治疗中常伴随大量免疫因子释放，引发严重不良反应；(3)神经毒性，T细胞侵入大脑引发致命的脑水肿等等。

[0004] 自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是有效的先天效应细胞，能够靶向和杀死病毒感染的恶性细胞。与T细胞不同，NK细胞不需要匹配的人类白细胞抗原来激活或发挥功能，相反NK细胞依赖于一系列生殖系编码的激活和抑制受体，这些受体与靶细胞上的同源配体结合并引发细胞毒性。NK细胞不仅分泌颗粒酶B和穿孔素来裂解靶细胞，还分泌细胞因子和趋化因子来协调随后的免疫反应。这些独特的属性使NK细胞成为过继免疫治疗的有吸引力的细胞类型。来自临床研究的证据表明，NK细胞同种异体转移是有效且安全的(参见Liu E,Marin D,Banerjee P,Macapinlac HA,Thompson P,Basar R,et al..Use of CAR‑transduced natural killer cells in CD19‑positive lymphoid tumors.N Engl J Med.(2020)382:545–53.)，但仍然存在挑战，特别是在治疗性NK细胞的制造方面，由于NK细胞仅占外周淋巴细胞的10％，因此来自白细胞分离术的NK细胞供应有限。离体扩增对于产生临床相关水平的原代NK细胞进行输注是必要的，然而这一过程因端粒缩短和所得细胞的细胞毒性降低而变得复杂，因此如何有效扩增和维护肿瘤杀伤能力成为NK细胞治疗的首要问题。

[0005] 为了克服原代NK细胞的局限性，从NK细胞淋巴瘤患者中建立了几种克隆NK细胞系，其中NK‑92细胞系在多项临床研究中显示出一致的抗癌活性。NK‑92细胞拥有许多标志性的激活受体(例如NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46)，但缺乏几种抑制性受体(例如，TIGIT和PD‑1)，经伽马射线照射的NK‑92细胞的输注也已被证明对患者是安全的。此外，NK‑92的无限增殖会产生一致的均质NK细胞供应，以允许多次输注、改善治疗后勤工作并降低治疗开发的成本。然而由于免疫功能受损，与原代NK细胞相比，NK‑92的抗癌活性降低。

[0006] 有研究提出，NK‑92是白细胞介素2(interleukin‑2，IL‑2)依赖性的，即IL‑2能够促进其增殖或活化。IL‑2是由活化的T淋巴细胞分泌产生的细胞因子，由133个氨基酸组成，IL‑2基因位于第4号染色体上，其第58，105位半胱氨酸形成的二硫键对于其活性的保持具有重要作用。IL‑2的发现始于1960年代中期，人们发现抗原或有丝分裂原激活的白细胞培养物的上清液含有一种能够刺激淋巴细胞分裂的因子；该因子能够用于维持T细胞培养超过9个月，这种技术很快适应了具有持续细胞毒性潜力的肿瘤反应性T细胞的培养，后将其命名为IL‑2。1983年报道了人类IL‑2基因的测序，随后的1985年开发出人重组IL‑2并用于恶性肿瘤的治疗，开启了IL‑2的免疫治疗之路，并取得了令人满意的疗效，目前IL‑2已经用于黑色素瘤、肺转移瘤、肾细胞癌、结肠癌患者癌和肺腺癌等多种肿瘤的治疗中。IL‑2能够促进NK细胞的体外增殖，IL‑2、IL‑15、IL‑7或饲养细胞处理是已被证明可增加NK细胞毒性的方式，将活化的NK细胞的输注和IL‑2推注也被证明是安全的。但是天然IL‑2的活性仍有待于提高，因此研究人员开始关注对于IL‑2序列的改造，例如EP0200280A2提出将IL‑2中104位的甲硫氨酸残基被保守氨基酸取代，可提高抗氧化活性；CN111018961A提出引入半胱氨酸残基形成二硫键，改善IL‑2与其受体的结合活性；CN113667004A提出在IL‑2的42/44位进行定点突变可改善抗肿瘤活性；CN101426916A提出C125S突变，所述突变蛋白提供了保持或增强的人NK细胞介导的自然杀伤细胞毒、淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞毒、或ADCC介导的细胞毒性。

[0007] 尽管现有技术中对于NK‑92细胞以及IL‑2作了大量而富有成效的研究，但仍面临如何提高和改善NK‑92细胞抗肿瘤效果的问题，本发明在现有研究基础上，对人IL‑2天然序列进行定点突变，获得了促进NK‑92细胞增殖能力和强化其细胞毒性能力更强的IL‑2变体，并将所述基因引入NK‑92细胞中，使得NK‑92可通过自我分泌的方式持续获得免疫激活，而不需全身性注射，避免过度免疫刺激；还筛选了可与所述NK‑92细胞联用的化学药物，进一步提高了抗肿瘤效果。

发明内容

[0008] 为解决上述技术问题，本发明中提供了一种人白细胞介素2突变体，所述人白细胞介素2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0009] 本发明在已有研究基础上，对人天然IL‑2序列进行了研究，对已知的44位、125位等潜在可变位点进行突变，还在18位、34位、68位、123位设计了定点突变，使得IL‑2与目标靶位结合活性更高，相比于F44S、C125S等已知改造突变体，具有更强的NK‑92细胞增殖活性和肿瘤细胞毒性。

[0010] 进一步的，其中所述人白细胞介素2突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0011] 提供了一种免疫细胞，其特征在于所述免疫细胞携带有编码如SEQ ID NO:1所示的人白细胞介素2突变体的基因。

[0012] 所述IL‑2突变体在体外可促进NK‑92细胞等免疫细胞增殖，但是这种方式在临床治疗中往往需要大规模的全身给药，容易引发不必要的临床治疗负担，导致难以预期的不良反应，增加患者治疗负荷和经济成本，因此本发明中将IL‑2突变体导入NK‑92细胞内，不仅能够避免全身给药带来的困境，还能够实现持续增殖和高水平的肿瘤毒性。

[0013] 进一步的，所述人白细胞介素2突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0014] 进一步的，其中所述免疫细胞选自T细胞和/或NK细胞。

[0015] 进一步的，其中所述免疫细胞选自NK‑92细胞。

[0016] 提供了一种药物组合物，包括本发明中所述的免疫细胞和小分子抗肿瘤药物，所述小分子抗肿瘤药物选自培美曲塞、吉西他滨、紫杉醇、顺铂、伊立替康中的一种或几种。

[0017] 进一步的，所述小分子抗肿瘤药物为顺铂。

[0018] 联合应用是常规的抗肿瘤疗法，本发明中筛选了已知的抗肿瘤药物与经过基因修饰的NK‑92细胞联合用于治疗肺癌，发现顺铂与NK‑92细胞联用的效果最好，能够显著提高抗肿瘤能力。

[0019] 提供了一种权利要求1至2中任一项所述的人白细胞介素2突变体或权利要求3至6中任一项所述的免疫细胞或权利要求7至8中任一项所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0020] 进一步的，所述肿瘤选自肝癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌。

[0021] NK‑92细胞和顺铂的抗癌谱系相当广泛，可用于多种实体瘤和血液瘤治疗，包括但不限于肝癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌(参见Natural Born Killers:NK Cells in Cancer Therapy，S.Elizabeth Franks,Benjamin Wolfson,and James W.Hodge，Cancers(Basel).2020Aug；12(8):2131)等等。本发明中实验证明所述NK‑92细胞以及其与顺铂的组合可用于治疗肺癌，鉴于现有技术对NK‑92和顺铂抗癌光谱性的研究，故可以预期本发明中提供的免疫细胞和药物组合物能够用于治疗肝癌、结直肠癌、前列腺癌等实体肿瘤。

[0022] 有益效果

[0023] 本申请提供了一种人白细胞介素2突变体、携带人白细胞介素2突变体的免疫细胞及其在抗肿瘤药物中的应用，具有以下优势：

[0024] (1)对人IL‑2氨基酸序列进行改造，获得了具有全新结构的IL‑2衍射物，具有更强的NK‑92细胞促增殖能力和肿瘤细胞毒性；

[0025] (2)将IL‑2突变体基因导入NK‑92细胞中，使其能够自主持续分泌该细胞因子，既能够满足自身需要，又能够避免全身给药造成的过重负担；

[0026] (3)基因修饰的NK‑92细胞能够高效杀死肺癌等肿瘤细胞，在体内、体外都展现了令人满意的抗肿瘤效果；

[0027] (4)基因修饰的NK‑92细胞与顺铂等小分子药物联用，进一步提高了抗肿瘤活性，产生明显协同作用。

附图说明

[0028] 图1：IL‑2及其衍生物纯化产物蛋白质电泳图；

[0029] 图2：IL‑2及其衍生物促进NK‑92细胞增殖；

[0030] 图3：体外基因修饰的NK‑92细胞对肿瘤细胞的杀伤力；

[0031] 图4：联用用药肿瘤杀伤能力；

[0032] 图5：TNF‑α表达水平变化图；

[0033] 图6：实验动物生存期。

具体实施方式

[0034] 以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。

[0035] 以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0036] 实施例1 IL‑2突变体设计与制备

[0037] 1.1 IL‑2突变体设计

[0038] 人天然IL‑2由133个氨基酸所组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。根据现有研究结果，IL‑2氨基酸结构中半胱氨酸形成二硫键，对于IL‑2与其受体结合活性至关重要，且有研究这提出对42位和44位的苯丙氨酸(Phe)进行突变，即F42S/F44S；以及对125位半胱氨酸(Cys)，即C125S，能够改善促进NK‑92细胞的增殖活性，在该基础上，本发明人对IL‑2中的在18位、34位、44位、68位、123位和125位等多个位点进行了点突变研究，获得了全新的突变体，记为mu‑IL‑2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0039] 1.2 IL‑2蛋白制备

[0040] 为便于比较和研究，本实施例中制备了人天然IL‑2蛋白(h IL‑2)，F42S/F44S突变的42/44‑IL‑2蛋白、C125S突变的125‑IL‑2蛋白以及实施例1.1中设计的mu‑IL‑2蛋白。具体制备方法如下：

[0041] 将编码相应IL‑2及其衍生物的DNA序列导入pcDNA3.3表达载体中，将上述表达载体电转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，转化后涂布于含有抗生素的LB平板上，37℃下在培养过夜，筛选阳性克隆。提取质粒，测序显示所述目标序列正确。

[0042] 本实施例中使用毕赤酵母真核表达载体制备IL‑2及其衍生物蛋白，可保证目标蛋白更接近真核生物的生理状态。将目标核酸片段克隆到表达载体pPIC‑9r上，转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株，置于30℃，220rpm摇床培养48h；使用甲醇诱导表达48h，离心收集上清，经超滤膜浓缩后使用离子交换层析进行纯化。对纯化后的蛋白进行蛋白电泳，利用考马斯亮蓝染色液进行染色，结果如图1所示，表明相关蛋白纯度较高，能够满足后续实验要求。

[0043] 实施例2促进NK‑92细胞增殖能力检测

[0044] 2.1 NK‑92细胞培养

[0045] 复苏NK‑92细胞(购自中科院上海细胞研究所)，接种于α‑MEM培养基(含10％胎牛血清、10％马血清、0.2mmol/L肌醇和0.2mmol/L叶酸)中，于37℃、5％CO2培养，每隔12h更换培养基，并观测细胞生长情况，待细胞融合度达到80％左右后，进行后续实验。

[0046] 2.2 NK‑92细胞增殖实验

[0047] 将1×105个NK‑92细胞接种于96孔板中，并分别加入终浓度20ng/mL的h IL‑2、42/44‑IL‑2、125‑IL‑2、mu‑IL‑2蛋白，以等量的无菌PBS作为对照组，于37℃、5％CO2环境中培养24小时。采用MTT法检测细胞，每孔加入50μL的MTT(5mg/mL)溶液，37℃孵育4h；弃去孔内的培养液，每孔加入150μL的DMSO震荡至板底的紫色结晶完全溶解，酶标仪490nm波长处测定吸光度OD值。以对照组细胞增殖率为100％计，按如下公式计算其他各组细胞增殖率，细胞增殖率(％)＝OD转染组/OD对照组×100％。

[0048] 如图2所示，IL‑2及其衍生物可显著提高NK‑92细胞增殖能力，其中42/44位突变在促增殖能力上未显示明显优势，而125位突变的促细胞增殖能力较天然序列和42/44位突变有所提高，本申请中所提供的复合多点突变IL‑2可大幅度提高NK‑92细胞的增殖能力，有望获得长效而持久的肿瘤杀伤细胞。

[0049] 实施例3 NK‑92细胞基因修饰

[0050] 本实施例中采用慢病毒载体转染NK‑92细胞，主要步骤如下：

[0051] (1)将上述IL‑2及其衍生物基因克隆至慢病毒表达载体pLV‑sf GFP(2A)Puro中，将其电转化如大肠杆菌DH5α中，涂布平板，37℃过夜培养。挑取单菌落摇菌培养，使用试剂盒提取质粒。经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选阳性克隆，得到相应的4种重组质粒pLV‑IL‑2。

[0052] (2)将Lenti‑X293T细胞接种于含有10％FBS的DMEM培养基中，于37℃、5％CO2下培养，当细胞密度为70‑80％时进行转染实验；将相应的4种重组质粒pLV‑IL‑2添加到293T细胞培养基中，37℃、5％CO2下孵育6h后，弃去培养基，PBS洗涤三次后更换完全培养基；收集转染后48小时的293T细胞上清液。于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；采用超速离心法收集病毒，获得病毒浓缩液。

[0053] (3)体外培养NK‑92细胞，将1×106个细胞接种于6孔板中，按50:1比例加入上述慢病毒载体，充分混匀，37℃、5％CO2下培养3‑4天，中间根据细胞生长情况可传代或换液。采用流式细胞仪鉴定转染结果，结果表明转染后的NK‑92细胞能够有效表达目标蛋白。

[0054] 实施例4肿瘤细胞杀伤实验

[0055] 4.1基因修饰的NK‑92细胞对肺癌细胞杀伤能力

[0056] 本实施例中以肺癌A549细胞作为靶细胞考察基因修饰的NK‑92细胞对肿瘤的杀伤能力。将A549细胞接种于DMEM完全培养基(含10％FBA)中，37℃、5％CO2下培养至对数生长期后，收集细胞用于细胞杀伤实验。

[0057] 效应细胞与靶细胞(A549细胞)按1:1、10:1比例接种于96孔板中，所述效益细胞分别为NK‑92细胞，转染天然IL‑2的NK‑92‑IL‑2细胞、转染42/44‑IL‑2的NK‑92‑42/44‑IL‑2细胞、转染125‑IL‑2的NK‑92‑125‑IL‑2细胞、转染mu‑IL‑2的NK‑92‑mu‑IL‑2细胞；另单设效应细胞孔和靶细胞孔，每组设立3个复孔。37℃培养24h后，每孔加入10μL CCK8试剂，孵育4h，用酶标仪检测其在450nm处的吸光度(OD值)，以空白孔校零，按公式计算杀伤力。

[0058] 杀伤力(％)＝[1‑(实验孔OD值－单效应细胞孔OD值)/单靶细胞孔OD值]×100％[0059] 如图3所示，NK‑92对A549细胞具有一定的杀伤能力，经过转染IL‑2基因后，这种杀伤能力似乎得到了加强，但是幅度有限；经过定点突变的IL‑2似乎更有效，这与突变的IL‑2可促进NK‑92细胞增殖的实验结果是相呼应的；从具体突变位点来看，本申请所提供的多点突变，比42/44、125等单点突变更有效。此外，NK‑92细胞所占比例也对肿瘤杀伤效果具有一定的影响，如图3所示，在加大NK‑92细胞用量后，NK‑92‑mu‑IL‑2细胞的杀伤能力显著增强。

[0060] 4.2基因修饰的NK‑92细胞与化学药物联用对肺癌细胞杀伤能力

[0061] 为了进一步提高NK‑92细胞的抗肿瘤效果，本实施例中选用已知的治疗肺癌化学药物，试图筛选出可与NK‑92配合使用，且疗效显著的抗癌药物。具体的，发明人选择了培美曲塞、吉西他滨、紫杉醇、顺铂、伊立替康等抗肿瘤药作为候选药物。

[0062] 培养A549细胞，方法同4.1节。在96孔板中，按10:1比例加入效应细胞，本实施例中选用NK‑92‑mu‑IL‑2细胞作为效应细胞，每组中分别加入50ng/ml浓度的培美曲塞、吉西他滨、紫杉醇、顺铂、伊立替康，混合均匀后37℃培养24h，测定肿瘤杀伤力，测定和计算方法同4.1节。

[0063] 结果如图4所示，联合其他抗癌药物后，对于A549细胞的杀伤能力又不同程度的改善，其中培美曲塞、吉西他滨、紫杉醇改善程度不大，而使用顺铂后，肿瘤杀伤能力大幅度提高至约80％，此外与伊立替康联合也展示出了强大的协同效应，这说明本发明中所提供的经基因修饰的NK‑92细胞与顺铂、伊立替康等已知抗癌药物联用具有更大的应用前景。

[0064] 4.3基因修饰的NK‑92细胞对TNF‑α分泌能力的影响

[0065] 为考察经mu‑IL‑2修饰的NK‑92细胞以及在联合用药过程中，对细胞因子分泌的影响，本实施例考察了TNF‑α分泌水平。分别将NK‑92、NK‑92‑mu‑IL‑2细胞以及NK‑92‑mu‑IL‑2细胞+顺铂、NK‑92‑mu‑IL‑2细胞+伊立替康处理A549细胞，具体方法同4.2节，孵育24小时后离心去上清，采用ELISA试剂盒(购自美国BD公司)检测上清中的TNF‑α浓度，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

[0066] TNF‑α是一种已知的抑癌因子，可介导多种抗肿瘤机制，发挥抗肿瘤作用。如图5所述，使用mu‑IL‑2修饰后可显著提高TNF‑α的表达水平，有利于激活TNF‑α相关抗肿瘤通路。在联合用药中，顺铂可进一步提高TNF‑α的分泌水平，而伊立替康联合组中却未见明显的促进分泌作用，说明顺铂可能主要通过促进TNF‑α分泌而与基因修饰的NK‑92细胞发挥协同作用，而伊立替康则可能通过其他途径进行。

[0067] 实施例5动物实验

[0068] 选用3‑4周龄，SPF级，BALB/c裸鼠，室温26‑28℃，空气湿度40％‑60％，饲养1周以5
实验适应环境。培养A549细胞至对数生长期，使用无菌PBS调整细胞密度至2×10 /μL单细胞，麻醉裸鼠并将其固定于操作台上，用微量注射器脑内注射入A549细胞5μL(细胞数1×
6
10个)，造模一周后经活体成像仪检测，证明造模成功。

[0069] 将实验动物随机分为4组，NK‑92组，尾静脉注射1×106个NK‑92细胞；NK‑92‑mu‑6
IL‑2组，尾静脉注射1×10个NK‑92‑mu‑IL‑2细胞；NK‑92‑mu‑IL‑2联合顺铂组，尾静脉注射
6
1×10 个NK‑92‑mu‑IL‑2细胞，每3天注射20mg/kg顺铂；对照组，每3天注射1mL无菌生理盐水。每日观测实验动物的生存情况，记录并计算各组模型动物的平均生存时间。

[0070] 如图6所示，使用未经处理的NK‑92细胞在体内治疗肺癌肿瘤模型的效果并不理想，与对照组相比未见显著延长生存期作用，这可能是由于该NK‑92细胞在体内肿瘤环境中的生存时间较短，难以发挥有效的治疗作用；而导入mu‑IL‑2基因后，可显著延长体内NK‑92细胞的生存时间，mu‑IL‑2具有较强的促增殖能力，且可自主生产和分泌，起到了长效治疗的作用，故使得裸鼠模型生存期显著改善；联合顺铂后，实验动物生存期进一步提高，可能与TNF‑α等细胞因子的分泌有关，而产生了明显协同作用。

[0071] 虽然本发明参考其示例性的实施例已经进行了具体显示和描述，本领域的技术人员应当理解的是，在不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的多种改变。