一种干细胞在制备人工皮肤中的用途

摘要

本发明涉及一种干细胞在制备人工皮肤中的用途。本发明提供了一种抑制Wnt/β‑catenin信号通路的单克隆抗体并将其用于制备抑制骨髓间充质干细胞衰老的药物组合物，同时采用所述单抗培养的骨髓间充质干细胞制备人工皮肤后具有较好的促进伤口愈合的效果。具有较好的应用前景。

权利要求

1.一种抑制Wnt/β‑catenin信号通路的单克隆抗体 1A2，其特征在于所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO：1所示； 重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

说明书

一种干细胞在制备人工皮肤中的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及生物、美容领域，更具体的涉及一种改进的人工皮肤的制备方法及应用。

背景技术

[0002] 人工皮肤是指利用工程学和细胞生物学的原理和方法，在体外人工研制的皮肤代用品，用来修复、替代缺损的皮肤组织。最近10多年来，组织工程的迅猛发展，使得研究开发具有良好生物相容性的、在植入体内后可以自行生物降解的、可用于器官和软、硬组织的重建与修复的组织工程材料成为可能。组织工程的第一个面市产品是人工皮肤，也是迄今为止在临床应用方面最为成功的组织工程材料。且已在烧伤、慢性静脉溃疡以及先天性皮肤畸形等疾病的治疗方面取得良好效果。近些年来，人工皮肤的研究开发十分活跃，新的人工皮肤产品不断涌现。有人曾把人工皮肤分为表皮替代物、真皮替代物和全皮替代物三类，然而，根据人工皮肤的发展，也有研究者以为，已有的人工皮肤可以根据其性能分为普通型人工皮肤和组织工程化人工皮肤；也可根据其与损伤皮肤的结合方式分为暂时替代性人工皮肤和永久替代性人工皮肤。

[0003] 组织工程皮肤的制备方法较多。传统的动物或人体二倍体非转化细胞的培养一般是单层贴壁培养，它不能反映正常的细胞生长环境，而组织工程的核心技术便是细胞的三维立体培养技术，这种培养可以使细胞进一步发展为与其在体内相对应的组织结构相似的人造组织。由于异体移植物会被受者免疫系统视为外源物质而排斥，但培养的皮肤在临床中未观察到排斥效应，这可能是由于组织工程皮肤中没有加工和递呈抗原的朗格罕氏细胞，因而免疫原性弱。此外，在慢性伤口治疗中，人造生物皮肤可刺激休眠的溃疡边缘向伤口中心迁移，从而修复伤口。事实上，这些人工培养的移植物并不存活，只是暂时性替代皮肤功能，并且分泌皮肤愈合所需的细胞因子和皮肤基质蛋白，为自体细胞的生长、血管的生成提供良好的生长环境和结构支架，最终所有的细胞会被自体细胞所替代，这种替代过程一般在人造生物皮肤移植后一周便会发生。

[0004] CN110960730B中公开了一种3D打印的仿生抗排异人工皮肤及其制备方法。该方法是将带氨基的多糖类物质和蛋白质溶于酸性溶液中得到前体溶液，亚精胺和小分子二醛或两端用醛基修饰的高分子材料溶于无水乙醇中得到亚精胺交联剂，采用3D生物打印方法，在培养皿中打印前体溶液并雾化亚精胺交联剂，依次进行，并通过控制各层的亚精胺交联剂的浓度从而控制各层的硬度，最终得到硬度具有梯度变化的仿生抗排异人工皮肤。CN1212160C公开了一种含有人骨髓间充质干细胞的人工皮肤及其构建方法，它是以胎牛皮或牛跟腱为基料，经过两次酶处理的胶原海绵膜，再与肝素和表皮生长因子的混合物构建含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架，将从人骨髓血中纯化的人骨髓间充质干细胞植入支架两侧，构建支架两侧和内部均有骨髓间充质干细胞的人工皮肤。但是所述方法在应用上由于骨髓间充质干细胞本身易衰老而导致还有改进的空间。

[0005] 在过去二十年，最先面市的组织工程产品———人造生物皮肤的开发取得了很大进展，已有几种产品获得FDA批准，成功地用于治疗重度皮肤烧伤、慢性顽固性皮肤溃疡等，人造生物皮肤不仅能够促进皮肤愈合，而且没有免疫原性，具有来源充足、使用方便安全等优点。尽管如此，人造生物皮肤产品还有待完善，还有待深入研究。

发明内容

[0006] 本发明克服现有技术的缺陷，克服骨髓间充质干细胞容易衰老的缺陷，提供一种高活性、高增殖特性的骨髓间充质干细胞，进而制备相应的人工皮肤。

[0007] 现有技术的研究表明激活的Wnt/β‑catenin信号通路可导致MSCs衰老，抑制Wnt/β‑catenin信号通路可以延缓细胞衰老，提高细胞增殖和存活能力。发明人在此基础上开发了新的抑制Wnt/β‑catenin信号通路的单克隆抗体。

[0008] 一方面，本发明提供一种抑制Wnt/β‑catenin信号通路的单克隆抗体，本发明获得的1A2单克隆抗体具有较好的结合效果，其解离常数达到了(15.63±0.13)nM。

[0009] 通过抗体链测序，获得了相应的抗体的可变区序列分别如下：

[0010] 轻链可变区的氨基酸序列：(SEQ ID NO：1)；

[0011] DIVITQRPALMAASPGEKVTITCCVRAPMYCPEKCWYQQKSGISPKPWIYANPLIYWGVPARFSG SGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCPVLVQGWTRFGAGTKLELK

[0012] 重链可变区的氨基酸序列：(SEQ ID NO：2)；

[0013] EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSGCMGWWIKQRPGQGLEWIGEHRRDFEMKSMSCVAK GKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGNYRPCEVWGLGTTLAVSS。

[0014] 另外一方面，本发明还提供了抑制Wnt/β‑catenin信号通路的单克隆抗体在制备抑制骨髓间充质干细胞衰老的药物组合物中的用途。

[0015] 本发明的抗β‑catenin抗体药物组合物，组合物或组合还可包含任何合适的辅助剂中的至少一种，例如但不限于水性稀释剂，粘合剂，稳定剂，缓冲剂，盐，亲脂溶剂，防腐剂，佐剂等。优选药学上可接受的助剂。这些无菌溶液的非限制性例子和制备这些无菌溶液的方法在本领域中是众所周知的。可以常规选择药学上可接受的载体，其适合于本领域公知的或本文所述的抗β‑catenin抗体，片段或变体组合物的给药方式，溶解度和/或稳定性。

[0016] 优选地，所述水性稀释剂任选地还包含药学上可接受的防腐剂。优选的防腐剂包括那些选自苯酚，间甲酚，对甲酚，邻甲酚，氯甲酚，苯甲醇，对羟基苯甲酸烷基酯(甲基，乙基，丙基，丁基等)，苯扎氯铵，苯扎氯铵，脱氢乙酸钠和硫柳汞，或其混合物的防腐剂。在制剂中使用的防腐剂的浓度是足以产生抗微生物作用的浓度。这些浓度取决于所选择的防腐剂，并且容易由本领域技术人员确定。

[0017] 其它赋形剂，例如等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂和防腐剂增强剂，可以任选地和优选地加入到稀释剂中。等渗剂，例如甘油，通常以已知浓度使用。优选加入生理上耐受的缓冲液以提供改进的pH控制。该制剂可以覆盖很宽的pH范围，例如约pH4‑pH10，优选约pH5‑pH9，最优选约6.0‑8.0。优选地，本发明的制剂具有约6.8至约7.8的pH。优选的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，最优选磷酸钠，特别是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

[0018] 作为活性成分的本公开的分子溶解，分散或混合在赋形剂中，该赋形剂是药学上可接受的并与活性成分相容，这是众所周知的。合适的赋形剂是例如水，盐水，磷酸盐缓冲盐水(PBS)，葡萄糖，甘油等及其组合。其它合适的载体是本领域技术人员公知的。另外，如果需要，该组合物可含有少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂。

[0019] 本公开的单克隆抗体可以使用本领域公知的方法制备。

[0020] 除了传统的在体内提高抗体的方法外，还可以使用噬菌体展示技术在体外产生抗体。与常规抗体生产相比，这种重组抗体的生产快得多，并且它们可以针对大量抗原产生。而且，当使用常规方法时，许多抗原被证明是非免疫原性的或非常有毒，因此不能用于在动物中产生抗体。而且，重组抗体的亲和力成熟(即，提高亲和力和特异性)是非常简单和相对快速的。最后，可以在一个选择过程中产生大量不同的针对特异性抗原的抗体。为了产生重组单克隆抗体，可以使用各种基于展示文库的方法来产生具有不同抗原识别位点的大量抗体。这样的文库可以以几种方式制备：通过克隆重链种系基因库中的合成CDR3区域，从而产生大的抗体库，可以从中选择具有各种特异性的重组抗体片段，从而产生合成库。可以使用人的淋巴细胞库作为构建抗体文库的起始材料。有可能构建人IgM抗体的原始库，并因此创建大多样性的人文库。该方法已经成功地被广泛用于选择大量抗不同抗原的抗体。

[0021] 在一些实施方案中，本公开的抗体或抗原结合片段是本公开的试剂。

[0022] 在一些实施方案中，本发明提供了编码本发明抗体的核酸序列。在一个实施方案中，本文所述抗体由包含与本文所述核苷酸序列具有至少75％同一性的核苷酸序列的核酸分子编码。在一个实施方案中，本文所述抗体由包含与本文所述核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列的核酸分子编码。在一个实施方案中，本文所述抗体由包含与本文所述核酸序列具有至少85％同一性的核酸序列的核酸分子编码。在一个实施方案中，本文所述抗体由包含与本文所述核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列的核酸编码。在一个实施方案中，本文所述抗体由包含与本文所述核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列的核酸编码。

[0023] 另一方面，提供了编码本公开的抗体或抗原结合片段的核酸序列。

[0024] 另一方面，提供了编码本公开的抗体或抗原结合片段的核酸分子。

[0025] 本发明进一步提供采用单抗处理后的骨髓间充质干细胞在制备人工皮肤中的用6
途。其中，人工皮肤是将骨髓间充质干细胞以5×10个细胞与纤维蛋白胶主体胶0.15ml混合后，加入0.15ml催化剂后形成0.3m1膜状凝胶即为人工皮肤。

[0026] 其中纤维蛋白胶是市售产品，其分为纤维蛋白胶主体胶和催化剂二个部分，在纤维蛋白胶主体胶未加入催化剂之前，为液态，加入催化剂之后，主体胶变为固态。一般的，纤维蛋白封闭剂主体胶主要含高浓度的纤维蛋白原、白蛋白、凝血因子XIII；催化剂主要含白蛋白、凝血酶原和氯化钙。

[0027] 有益效果

[0028] 本发明提供了一种抑制Wnt/β‑catenin信号通路的单克隆抗体并将其用于制备抑制骨髓间充质干细胞衰老的药物组合物，同时采用所述单抗培养的骨髓间充质干细胞制备人工皮肤后具有较好的促进伤口愈合的效果。具有较好的应用前景。

附图说明

[0029] 图1单克隆抗体对骨髓间充质干细胞增殖结果图

[0030] 图2单抗处理后的细胞内β‑catenin蛋白的表达量结果图

[0031] 图3单抗处理后的细胞细胞凋亡检测结果图

具体实施方式

[0032] 下面的实施例旨在说明如何制备和使用本发明的化合物和方法，而不应解释为限制。虽然现在将结合其特定实施例描述本公开，但是很明显，对于本领域技术人员来说，许多修改和变化都是显而易见的。因此，意欲包括落入所附权利要求的精神和宽广范围内的所有这些修改和变化。

[0033] 实施例1β‑catenin的表达制备

[0034] 根据β‑catenin基因的cDNA序列设计合成引物(由上海英俊生物技术有限公司合成)，上游引物5’‑TATGGATCCATGGCTACTCAAGCTGAT‑3′(BamH I)，下游引物5′‑TATCTCGAGATGATGATGATGATGATGCAGGTCAGTATCAAACCA‑3’(Xho I)，斜体字母为添加的酶切位点，加粗字体为添加的6×His标签序列。

[0035] 从人血液中提取RNA，反转录成cDNA，从cDNA中扩增β‑catenin基因的cDNA序列，50μL体系中包括dNTP200mmol/L，MgCl21.5mmol/L，10pmol上下游引物和2.5UTaqDNA聚合酶.扩增程序为94℃预变性3min后进入循环:94℃30s，55℃30s，72℃3min，35循环，72℃延伸5min.PCR扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳、胶回收纯化β‑catenin基因的cDNA序列片段。用BamHI、XhoI分别酶切pGEX‑4T‑1和β‑catenin基因的cDNA序列片段，1％琼脂糖凝胶回收酶切片段。将回收片段按目的基因和载体摩尔比5∶1，反应体系10μL，在T4连接酶作用下室温连接2.5h，转化top10感受态细菌，涂布于含有氨苄青霉素(终质量浓度100ng/μL)的LB平板上，37℃培养过夜。阳性鉴定的克隆提取质粒，将阳性重组质粒转化至BL21pLysS中，挑取1个单菌落接种到含有氨苄青霉素LB液体培养基中37℃培养过夜，按1∶100比例转入新鲜含有氨苄青霉素LB培养基，在OD值达到0.6时开始诱导，以终浓度为0.4mmol/L的IPTG在27℃条件下诱导3h，离心、收集菌体、裂解菌体后，取上清，先经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化，然后再经Ni柱纯化后，获得了纯度较好的单一条带蛋白，调整蛋白浓度为10mg/mL备用。

[0036] 实施例2β‑catenin单克隆抗体的制备

[0037] 以纯化的重组β‑catenin蛋白为免疫原免疫Balb/c小鼠，每隔3周后加强免疫一次，第l0天取血检测抗体效价，待抗体效价达到要求后，取脾脏。取加强免疫后检测抗体效价最好的一只Balb/c小鼠分离脾细胞培养，采用常规方法，以PEG1500为融合剂与杂交瘤细胞融合，经过大量培养细胞，间接ELISA法进一步分离和筛选细胞株。采用有限稀释方法对所有筛选确认的阳性细胞株进行亚克隆，待细胞集落生长至显微镜视野1/3时吸取上清进行筛选。待亚克隆阳性率达到100％时，正式建株，每株细胞冻存5支以上。筛选阳性杂交瘤细胞，其中阳性较好的细胞为1A2,3D7。将二者阳性细胞腹腔免疫小鼠获得腹水，经ProteinA亲和层析柱纯化小鼠单克隆抗体腹水，得到纯化的β‑catenin单克隆抗体1A2和3D7备用。

[0038] Western blot检测单克隆抗体的特异性：重组β‑catenin蛋白、GST、以及白蛋白分别SDS‑PAGE电泳，转硝酸纤膜，2％牛血清白蛋白4℃封闭过夜；分别与1：20稀释的重组β‑catenin蛋白单克隆抗体1A2或3D7，37℃孵育2h，加入TBST稀释(1：4000)的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，30℃孵育2h；以上步骤完成后用TBST洗3次(5min/次)。将膜放人新鲜配制的二氨苯胺(DAB)底物溶液中显色，蒸馏水洗涤终止显色反应，观察结果。结果显示，抗体能够识别重组β‑catenin蛋白蛋白，而不识别GST和白蛋白，具有较好的特异性。

[0039] 实施例3 1A2单克隆抗体特性鉴定

[0040] 利用Fortibio测定抗体结合及解离常数。利用OctetRED(Fortebio,USA)仪器，测定抗1A2抗体亲和力。PBS稀释抗体浓度为10μg/mL，包被AHC传感器；PBS为对照，稀释1A2浓度为0.1μg/mL、1μg/mL、3μg/mL、10μg/mL、测定抗1A2抗体与β‑catenin相互作用的结合、解离曲线；利用GlobeFitting拟合曲线，计算两者相互作用的解离常数。结果见表1。

[0041] 表1. 1A2与β‑catenin相互作用亲和力分析

[0042]抗体名称 解离常数(nM)
1A2 15.63±0.13

[0043] 从结果看出，本发明获得的1A2单克隆抗体具有较好的结合效果，其解离常数达到了(15.63±0.13)nM。

[0044] 通过抗体链测序，获得了相应的抗体的可变区序列分别如下：

[0045] 轻链可变区的氨基酸序列：(SEQ ID NO：1)；

[0046] DIVITQRPALMAASPGEKVTITCCVRAPMYCPEKCWYQQKSGISPKPWIYANPLIYWGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCPVLVQGWTRFGAGTKLELK

[0047] 重链可变区的氨基酸序列：(SEQ ID NO：2)；

[0048] EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSGCMGWWIKQRPGQGLEWIGEHRRDFEMKSMSCVAKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGNYRPCEVWGLGTTLAVSS。

[0049] 实施例4 1A2单克隆抗体对骨髓间充质干细胞增殖

[0050] 取对数生长期MSCs(商品化，货号：CP‑H166，武汉普诺赛生命科技有限公司)制成4
细胞悬液，调整细胞浓度至3x10 /ml，将细胞悬液接种于96孔板中。实验分为4组，分别是空白培养基组、10μg/mL1A2单抗处理组、100μg/mL1A2单抗处理组，100μg/mL DKK1阳性对照组。各组细胞分别在相应培养液内培养1‑7d(期间每3天换液l次)，在第1/3/5/7天培养结束后各孔加入5mg/ml的MTT孵育4h，然后弃去孔内液体，每孔加入150μl DMSO，震荡10min后，酶标仪上读取波长为570nm的吸光度值，绘制细胞增殖曲线。每组实验设5个复孔，结果如图
1所示。

[0051] MTT检测结果显示，10μg/mL1A2单抗处理组、100μg/mL1A2单抗处理组以及100μg/mL DKK1阳性对照组相对于对照组，其MSCs表现出较强的增殖能力，其吸光度值在培养的第7天，与空白组相比显著增加，差异均具有统计学意义(p<0.05)。在第7天，100μg/mL1A2单抗处理组的OD570nm值为0.58±0.03，比阳性对照的0.53±0.03的效果增加显著。

[0052] 实施例5 1A2单抗处理后的细胞内β‑catenin蛋白的表达量影响

[0053] 采用实施例4相同培养方法各组培养后的细胞裂解，提取细胞总蛋白。SDS‑PAGE电泳后，湿式电转移蛋白与PVDF膜上。用3％BSA，0.05％Tween‑20，PBS配制封闭液，将转移好的PVDF膜置于10ml封闭液中，在室温条件下封闭2h。兔抗大鼠β‑catenin(l:200)和β‑actin(l:200)一抗室温下孵育2h，TBST洗膜3次，HRP标记的羊抗兔IgG(1:2000)室温下孵育2h，TBST洗膜3次后，加入ECL液发光，X光片盒中曝光，于暗室中显影拍照，观察β‑catenin和β‑actin蛋白的表达。运用图象分析系统扫描各组曝光条带的灰度值，计算各检测蛋白与内参β‑actin蛋白灰度值的比值。结果如图2所示。

[0054] 从图2可以看出，10μg/mL1A2单抗处理组、100μg/mL1A2单抗处理组以及100μg/mL DKK1阳性对照组相对于阴性对照组相比显著减少，差异均具有统计学意义(p<0.05)。特别是100μg/mL1A2单抗处理组的比率只有0.08±0.01，比阳性对照组的0.46±0.06抑制效果有明显提高。

[0055] 实施例6 1A2单抗处理后的细胞细胞凋亡检测

[0056] 采用实施例4相同培养方法各组培养后，再在培养液内加入100μmol/LH2O2处理50min。然后，各组每毫升培养液内加入40μlAO/EB染色液，在37℃水浴箱中孵育30min。荧光显微镜下观察拍照并计数。每组实验重复3次，每次随机选取3个视野，计数100个细胞中的凋亡细胞数量，并计算凋亡率来反映各组细胞的凋亡程度。凋亡率＝(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)/总细胞数×100％。结果如图3所示。

[0057] 从图3的结果可以看出，经过H2O2处理后，空白组内出现较多的凋亡细胞，细胞出现皱缩、染色体聚集等形态表现。10μg/mL1A2单抗处理组、100μg/mL1A2单抗处理组以及100μg/mL DKK1阳性对照组相对于阴性对照组相比显著减少凋亡率，差异均具有统计学意义(p<0.05)。特别是100μg/mL1A2单抗处理组的凋亡率只有(11.02±2.11)％，比阳性对照组的(14.13±3.04)％凋亡率有显著降低。

[0058] 实施例7人工皮肤的制备及性能检测

[0059] 取对数生长期MSCs(商品化，货号：CP‑H166，武汉普诺赛生命科技有限公司)制成4
细胞悬液，调整细胞浓度至3x10 /ml，将细胞悬液接种于T25细胞培养瓶中，使用L‑DMEM完全培养液(其中分别添加1A2单抗以及阳性对照(DKK1)终浓度为100μg/mL)，在体积分数为
5％的CO2和37℃条件下静止培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每3‑4d半量换液1次，收
6
集细胞，用胰酶和EDTA消化成细胞悬液，以5×10个细胞与纤维蛋白胶主体液0.15ml混合后，加入0.15ml催化剂后形成0.3m1膜状凝胶。

[0060] 动物移植实验：2‑3月龄C57BL，按随机数字法分为5组：单抗处理的干细胞复合纤维蛋白胶移植组，未采用单抗处理的干细胞复合纤维蛋白胶移植组，单纯纤维蛋白胶移植组，空白对照组，阳性对照组。于实验前10ml戊巴比妥钠麻醉，在小鼠背部左右两侧分别制备1个直径1cm的圆形创面，完整去除全层皮肤，将移植物置于创面上，用透明敷料(Tegaderm)作临时敷料粘贴。记录并比较分析各组创面愈合时间的差异。结果如下表1所示。

[0061] 表1各组创面愈合时间

[0062]

[0063] 结果显示，与单纯纤维蛋白胶移植组对比，阳性对照组以及干细胞复合纤维蛋白胶移植组的上皮形成较好，胶原排列有序，干细胞复合纤维蛋白胶移植组和单纯纤维蛋白胶移植组以及阳性对照组与空白对照组相比，差异均具有统计学意义(p<0.05)。特别是采用单抗处理的干细胞复合纤维蛋白胶移植组创面愈合时间更是缩为(11.8±1.3)d效果显著。

[0064] 作为本发明的活用例，期待将其应用于再生医疗，再生美容中，例如，本发明的干细胞作为种子，并且可以作为干细胞的人工表皮膜的制作技术以及皮肤的再生技术加以利用。

[0065] 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。