狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及病毒基因工程技术领域，具体涉及狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒及其制备方法和应用。本发明提供的重组狂犬病病毒载体为包含重组狂犬病病毒基因组DNA表达盒的哺乳动物表达质粒；所述表达盒包含重组狂犬病病毒基因组DNA和调控元件。由该重组狂犬病病毒载体拯救获得狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒具有较高的拯救效率，制备的假病毒为复制增殖型假病毒，在体外培养过程中能够进行复制增殖并获得较高的病毒滴度，可作为沙粒病毒和丝状病毒野毒的替代物，用于检测沙粒病毒和丝状病毒的中和抗体及其效价，安全性较高且能够实现便捷的荧光可视化检测。

权利要求

1.重组狂犬病病毒载体，其特征在于，所述载体为包含重组狂犬病病毒基因组DNA表达盒的哺乳动物表达质粒；

所述表达盒包含重组狂犬病病毒基因组DNA和调控元件；

所述重组狂犬病病毒基因组DNA为将狂犬病病毒SRV9基因组中的狂犬病病毒糖蛋白编码基因替换为拉沙病毒Josiah株或马尔堡病毒Musoke株、Angola株或Ravn株的囊膜糖蛋白编码基因，并在狂犬病病毒基因组中的磷蛋白编码基因与基质蛋白编码基因之间插入荧光标记蛋白编码基因eGFP得到；

所述调控元件包括位于所述重组狂犬病病毒基因组DNA上游的顺次连接的CMV启动子、T7启动子和锤头型核酶序列以及位于所述重组狂犬病病毒基因组DNA下游的顺次连接的丁肝病毒核酶序列、T7终止子和poly (A)加尾信号序列元件。

2.狂犬病病毒重组拉沙病毒或马尔堡病毒假病毒，其特征在于，所述假病毒的基因组包含重组狂犬病病毒基因组DNA；

所述重组狂犬病病毒基因组DNA为将狂犬病病毒SRV9基因组中的狂犬病病毒糖蛋白编码基因替换为拉沙病毒Josiah株或马尔堡病毒Musoke株、Angola株或Ravn株的囊膜糖蛋白编码基因，并在狂犬病病毒基因组中的磷蛋白编码基因与基质蛋白编码基因之间插入荧光标记蛋白编码基因eGFP得到；

所述假病毒的制备方法包括：将权利要求1所述的重组狂犬病病毒载体和辅助质粒导入宿主细胞中，得到重组宿主细胞，培养重组宿主细胞并收获释放的病毒粒子；

所述辅助质粒为分别表达狂犬病病毒的RNA聚合酶、核蛋白、磷蛋白和糖蛋白的四个哺乳动物表达质粒；

在导入宿主细胞过程中，所述重组狂犬病病毒载体的用量为2 3μg，表达狂犬病病毒的~核蛋白的辅助质粒的用量为0.1 0.2μg，表达狂犬病病毒的磷蛋白的辅助质粒的用量为0.6~

0.7μg，表达狂犬病病毒的RNA聚合酶的辅助质粒的用量为0.25 0.3μg，表达狂犬病病毒的~ ~糖蛋白的辅助质粒的用量为3 4μg。

~

3.权利要求2所述的狂犬病病毒重组拉沙病毒或马尔堡病毒假病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的重组狂犬病病毒载体和辅助质粒导入宿主细胞中，得到重组宿主细胞，培养重组宿主细胞并收获释放的病毒粒子；

所述辅助质粒为分别表达狂犬病病毒的RNA聚合酶、核蛋白、磷蛋白和糖蛋白的四个哺乳动物表达质粒；

在导入宿主细胞过程中，所述重组狂犬病病毒载体的用量为2 3μg，表达狂犬病病毒的~核蛋白的辅助质粒的用量为0.1 0.2μg，表达狂犬病病毒的磷蛋白的辅助质粒的用量为0.6~

0.7μg，表达狂犬病病毒的RNA聚合酶的辅助质粒的用量为0.25 0.3μg，表达狂犬病病毒的~ ~糖蛋白的辅助质粒的用量为3 4μg。

~

4.权利要求1所述的重组狂犬病病毒载体或权利要求2所述的狂犬病病毒重组拉沙病毒或马尔堡病毒假病毒的以下任一种应用：（1）在非疾病诊断目的的检测或筛选马尔堡病毒或拉沙病毒的中和抗体中的应用；

（2）在制备用于检测马尔堡病毒或拉沙病毒的中和抗体的试剂中的应用；

（3）在制备用于检测马尔堡病毒或拉沙病毒的试剂中的应用；

（4）在制备用于诊断马尔堡病毒或拉沙病毒感染或由马尔堡病毒或拉沙病毒感染引起疾病的试剂中的应用。

5.马尔堡病毒或拉沙病毒的中和性抗体检测试剂，其特征在于，所述试剂包含权利要求2所述的狂犬病病毒重组拉沙病毒或马尔堡病毒假病毒。

说明书

狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒及其制备方法和

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及病毒基因工程技术领域，具体涉及狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 拉沙热(Lassa fever,LF)是一种以出血热和多器官衰竭为特征的烈性、高致死率的人兽共患病，其病原是拉沙病毒(Lassa fever virus,LASV)，是沙粒病毒科，旧世界病毒属的成员之一。该病毒被列为生物安全四级病原体，在2001年4月《禁止生物武器公约》中被列入禁止使用的生物武器名录。LASV通过其天然宿主多乳鼠(Mastomys natalensis)的尿液或者粪便传播给人类。马尔堡病毒(Marburg virus，MARV)是一种有包膜的负链RNA病毒，是丝状病毒科、马尔堡病毒属成员之一。马尔堡出血热是一种由马尔堡病毒(Marburg virus，MARV)在人类和非人类灵长动物中引起致命的病毒性出血热，该疾病与埃博拉病毒病的临床症状十分相似。拉沙病毒和马尔堡病毒可通过直接或间接接触带毒动物尸体或分泌物发生感染，也可通过气溶胶进行传播。目前尚无获批可应用于临床的疫苗或药物。此外，拉沙热病毒和马尔堡病毒因其高传染性、高致死性均被列为生物安全四级病原体，是国际禁止的生物武器，同时也被WHO列为“预防传染病研发行动蓝图”计划中优先研究的病原体。

[0003] 目前国际上拉沙病毒和马尔堡病毒的中和抗体检测方法多以实毒中和实验以及假病毒中和实验这两种检测方法为主，虽然拉沙病毒和马尔堡病毒实毒中和抗体检测方法对中和抗体效价评估准确性较高。但是，生物安全四级实验室资源以及拉沙病毒和马尔堡病毒实毒资源的匮乏已成为阻碍针对拉沙病毒和马尔堡病毒这类高危病原体预防性疫苗和治疗性抗体药物开发和有效性评价的主要因素之一。假病毒作为实毒的替代物，可较好的模拟拉沙病毒和马尔堡病毒入侵和感染特性，且在生物安全二级实验室(Biosafety Level 2 Laboratory,BSL‑2)即可操作，极大地降低了检测成本和病毒操作的生物安全风险。目前，研究者多用HIV和VSV载体包装的假病毒对中和抗体的中和能力进行评价，但是这两种包装载体多产生复制缺陷型假病毒，包装后所得病毒粒子无法进行体外扩增因此需要“现用现拯救”，且包装效率不稳定，拯救获得的假病毒滴度不高且一致性较差，当检测中和抗体的样本量过大时，假病毒量难以满足实验需求，大大增加了工作的繁琐程度和工作量。此外，HIV和VSV两种假病毒系统多使用萤火虫荧光素酶报告基因，在实际检测血清中和抗体效价时，需先裂解被假病毒感染的靶细胞，再使用荧光素酶底物作用，而后通过荧光检测仪测定相对光度值强度，进而判断待检样品在各稀释度下与假病毒的中和情况。这种中和抗体检测方法亦存在检测时间长、步骤繁琐、检测成本十分昂贵等弊端，不适用于样本的大规模检测。因此，开发新的假病毒体系对于拉沙病毒和马尔堡病毒的中和抗体检测以及推动拉沙病毒和马尔堡病毒诊断技术、预防性疫苗和治疗性抗体的研发具有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供重组狂犬病病毒载体、狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒及其制备方法和应用。

[0005] 目前已有的丝状病毒或沙粒病毒假病毒多用于丝状病毒或沙粒病毒的疫苗开发，用于中和抗体检测的丝状病毒或沙粒病毒假病毒少有报道，且多为复制缺陷型假病毒。本发明以开发用于中和抗体检测的丝状病毒或沙粒病毒假病毒为目的，采用狂犬病病毒表达丝状病毒或沙粒病毒的囊膜糖蛋白。在研发过程中，本发明发现，狂犬病病毒自身的糖蛋白编码基因的存在会干扰丝状病毒或沙粒病毒中和抗体的检测，因此，采用丝状病毒或沙粒病毒的囊膜糖蛋白编码基因替换狂犬病病毒自身的糖蛋白编码基因，使得重组病毒表达丝状病毒或沙粒病毒的囊膜糖蛋白，但不表达狂犬病病毒自身的糖蛋白，以提高中和抗体检测的特异性和准确性。

[0006] 具体地，本发明提供以下技术方案：

[0007] 第一方面，本发明提供一种重组狂犬病病毒载体，所述载体为包含重组狂犬病病毒基因组DNA表达盒的哺乳动物表达质粒；

[0008] 所述表达盒包含重组狂犬病病毒基因组DNA和调控元件；

[0009] 所述重组狂犬病病毒基因组DNA为将狂犬病病毒基因组中的狂犬病病毒糖蛋白编码基因(G)替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因(GP)得到；

[0010] 或者，所述重组狂犬病病毒基因组DNA为将狂犬病病毒基因组中的狂犬病病毒糖蛋白编码基因替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因，并在狂犬病病毒基因组中插入标记蛋白编码基因得到。

[0011] 以上所述的替换是指将狂犬病病毒的糖蛋白编码基因的完整编码区替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因。

[0012] 本发明进一步发现，将狂犬病病毒自身的糖蛋白编码基因替换后，会导致重组病毒的拯救效率明显降低，且体外增殖培养的滴度也明显降低。为解决上述问题，本发明对重组病毒载体的调控元件进行了大量的优化，并发现采用CMV启动子和T7启动子顺次串联得到的双启动子启动重组狂犬病病毒基因组DNA的转录能够显著提高重组病毒的体外拯救效率及其病毒体外增殖培养的滴度。

[0013] 以上所述的调控元件包括位于所述重组狂犬病病毒基因组DNA上游的CMV启动子和T7启动子。从5’‑3’端方向依次为CMV启动子和T7启动子。

[0014] 在本发明的一些实施方式中，所述重组狂犬病病毒基因组DNA以CMV启动子和T7启动子启动转录。

[0015] 在以上述双启动子启动重组狂犬病病毒基因组DNA转录的基础上，进一步结合核酶序列、终止子等调控元件的优化，进一步提高了重组病毒的体外拯救效率及其病毒体外增殖培养的滴度。

[0016] 优选地，所述调控元件包括位于所述重组狂犬病病毒基因组DNA上游的顺次连接的CMV启动子、T7启动子和锤头型核酶序列以及位于所述重组狂犬病病毒基因组DNA下游的顺次连接的丁肝病毒核酶序列、T7终止子和poly(A)加尾信号序列元件。

[0017] 锤头型核酶序列(HamRz)是从RNA病毒中分离得到的序列特异的核糖核酸酶，其复制依赖自我剪切，有利于保证转录出的重组狂犬病病毒基因具有精确的3’端。丁肝病毒核酶序列(丁型肝炎病毒核酶序列，HDV)具有核酶活性，可进行分子内剪切(顺式剪切)，有利于保证转录出的重组狂犬病病毒基因具有精确的5’端，而转录产物具有精确的3’端和5’端是重组病毒拯救成功的必要条件。

[0018] 以上所述的表达盒从5’‑3’方向依次为CMV启动子、T7启动子、锤头型核酶序列、重组狂犬病病毒基因组DNA、丁肝病毒核酶序列、T7终止子序列元件和poly(A)加尾信号序列元件。

[0019] 其中，CMV启动子和T7启动子的序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。

[0020] 锤头型核酶序列和丁肝病毒核酶序列分别如SEQ ID NO.3和4所示。

[0021] T7终止子的序列如SEQ ID NO.5所示。poly(A)加尾信号序列如SEQ ID NO.6所示。

[0022] 以上所述的表达盒优选仅由上述重组狂犬病病毒基因组DNA和调控元件组成。

[0023] 本发明所述的丝状病毒包括但不限于马尔堡病毒、埃博拉病毒等。

[0024] 优选地，所述丝状病毒为马尔堡病毒。所述沙粒病毒为拉沙病毒。

[0025] 不同马尔堡病毒或沙粒病毒的囊膜糖蛋白及其编码基因的序列可能存在差异。本领域技术人员可通过数据库、基因测序等途径获得马尔堡病毒和沙粒病毒的囊膜糖蛋白及其编码基因的序列。

[0026] 在本发明的一些实施方式中，所述马尔堡病毒为马尔堡病毒Musoke株、马尔堡病毒Angola株或马尔堡病毒Ravn株。

[0027] 在本发明的一些实施方式中，所述拉沙病毒为拉沙病毒Josiah株。

[0028] 在本发明的一些实施方式中，马尔堡病毒的囊膜糖蛋白为以下蛋白中的任一种：GenBank：DQ217792.1(马尔堡病毒Musoke株)、KY047763.1(马尔堡病毒Angola株)、KU179482.1(马尔堡病毒Ravn株)。

[0029] 在本发明的一些实施方式中，拉沙病毒的囊膜糖蛋白为Genbank:HQ688672.1(拉沙病毒Josiah株)所示的蛋白。

[0030] 在知晓上述氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可根据密码子规则获得马尔堡病毒的囊膜糖蛋白编码基因的核苷酸序列，且编码同一氨基酸序列的核苷酸序列并不唯一。

[0031] 优选地，本发明用于替换狂犬病病毒糖蛋白编码基因的马尔堡病毒的囊膜糖蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7‑9任一所示。拉沙病毒的囊膜糖蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

[0032] 为便于中和抗体检测，本发明还在重组狂犬病病毒载体中引入了荧光蛋白编码基因，以便于通过检测荧光信号检测中和抗体。

[0033] 优选地，所述标记蛋白为荧光标记蛋白。上述荧光蛋白编码基因包括但不限于绿色荧光蛋白编码基因。

[0034] 在本发明的一些实施方式中，所述荧光蛋白编码基因为eGFP基因。

[0035] 进一步优选地，所述标记蛋白编码基因插入在所述狂犬病病毒基因组的磷蛋白编码基因与基质蛋白编码基因之间。

[0036] 本发明发现，在上述位置引入荧光蛋白编码基因不会对假病毒的拯救效率和体外增殖能力造成不利影响。

[0037] 在本发明的一些实施方式中，所述标记蛋白编码基因插入在P基因与M基因之间的BsiWI和PmeI酶切位点之间。

[0038] 狂犬病病毒基因组优选为狂犬病病毒SRV9病毒株的基因组。

[0039] 狂犬病病毒SRV9病毒株的基因组的Genbank登录号为AF499686.2。

[0040] 在本发明的一些实施方式中，所述重组狂犬病病毒基因组DNA表达盒的序列如SEQ ID NO.11所示。

[0041] 在本发明的一些实施方式中，所述重组狂犬病病毒基因组DNA表达盒的序列为将SEQ ID NO.11所示序列的第4569bp位至6614bp位替换为SEQ ID NO.8所示序列得到的序列。

[0042] 在本发明的一些实施方式中，所述重组狂犬病病毒基因组DNA表达盒的序列为将SEQ ID NO.11所示序列的第4569bp位至6614bp位替换为SEQ ID NO.9所示序列得到的序列。

[0043] 在本发明的一些实施方式中，所述重组狂犬病病毒基因组DNA表达盒的序列为将SEQ ID NO.11所示序列的第4569bp位至6614bp位替换为SEQ ID NO.10所示序列得到的序列。

[0044] 以上所述的哺乳动物表达质粒优选为pcDNA3.1。

[0045] 以上所述的重组狂犬病病毒载体可与表达狂犬病病毒的RNA聚合酶、核蛋白、磷蛋白和糖蛋白的辅助质粒共同导入宿主细胞中进行病毒拯救，制备得到狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒。上述重组狂犬病病毒载体在进行病毒拯救时具有较高的拯救效率，能够提高狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒的制备效率。

[0046] 第二方面，本发明提供狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒，所述假病毒的基因组包含重组狂犬病病毒基因组DNA；

[0047] 所述重组狂犬病病毒基因组DNA为将狂犬病病毒基因组中的狂犬病病毒糖蛋白编码基因替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因得到；

[0048] 或者，所述重组狂犬病病毒基因组DNA为将狂犬病病毒基因组中的狂犬病病毒糖蛋白编码基因替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因，并在狂犬病病毒基因组中插入标记蛋白编码基因得到。

[0049] 以上所述的替换是指将狂犬病病毒的糖蛋白编码基因的完整编码区替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因。

[0050] 本发明所述的丝状病毒包括但不限于马尔堡病毒、埃博拉病毒等。

[0051] 优选地，所述丝状病毒为马尔堡病毒。所述沙粒病毒为拉沙病毒。

[0052] 不同马尔堡病毒或拉沙病毒的囊膜糖蛋白及其编码基因的序列可能存在差异。本领域技术人员可通过数据库、基因测序等途径获得马尔堡病毒和沙粒病毒的囊膜糖蛋白及其编码基因的序列。

[0053] 在本发明的一些实施方式中，所述马尔堡病毒为马尔堡病毒Musoke株、马尔堡病毒Angola株或马尔堡病毒Ravn株。

[0054] 在本发明的一些实施方式中，所述拉沙病毒为拉沙病毒Josiah株。

[0055] 在本发明的一些实施方式中，马尔堡病毒的囊膜糖蛋白为以下蛋白中的任一种：GenBank：DQ217792.1、KY047763.1、KU179482.1。

[0056] 在本发明的一些实施方式中，拉沙病毒的囊膜糖蛋白为Genbank:HQ688672.1所示的蛋白。

[0057] 在知晓上述氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可根据密码子规则获得马尔堡病毒的囊膜糖蛋白编码基因的核苷酸序列，且编码同一氨基酸序列的核苷酸序列并不唯一。

[0058] 优选地，本发明用于替换狂犬病病毒糖蛋白编码基因的马尔堡病毒的囊膜糖蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7‑9任一所示。拉沙病毒的囊膜糖蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

[0059] 为便于中和抗体检测，本发明还在狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒基因组中引入了荧光蛋白编码基因，以便于通过检测荧光信号获得中和抗体的中和能力。

[0060] 优选地，所述标记蛋白为荧光标记蛋白。

[0061] 上述荧光标记蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白。

[0062] 在本发明的一些实施方式中，所述荧光标记蛋白的编码基因为eGFP基因。

[0063] 优选地，所述标记蛋白编码基因插入在所述狂犬病病毒基因组的磷蛋白编码基因与基质蛋白编码基因之间。

[0064] 上述假病毒表达eGFP绿色荧光蛋白，可在蓝色激发光照射下产生绿色荧光，使用荧光显微镜即可直接观察待检样品与假病毒的中和情况；同时eGFP是传统GFP报告基因荧光强度的6倍以上，镜下观察细胞背景纯净，更有利于眼观区分病毒荧光。

[0065] 以上所述的用于重组丝状病毒或沙粒病毒的狂犬病病毒优选为狂犬病病毒SRV9病毒株。

[0066] 在本发明的一些实施方式中，所述重组狂犬病病毒基因组DNA为在狂犬病病毒SRV9病毒株的基因组(Genbank登录号为AF499686.2)的P基因与M基因之间插入eGFP基因，再将基因组上的糖蛋白编码基因替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因得到。

[0067] 第三方面，本发明提供所述狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒的制备方法，所述方法包括：将所述重组狂犬病病毒载体和辅助质粒导入宿主细胞中，得到重组宿主细胞，培养重组宿主细胞并收获释放的病毒；

[0068] 所述辅助质粒为分别表达狂犬病病毒的RNA聚合酶、核蛋白、磷蛋白和糖蛋白的四个哺乳动物表达质粒；

[0069] 优选地，在导入宿主细胞过程中，所述重组狂犬病病毒载体的用量为2～3μg，表达狂犬病病毒的核蛋白的辅助质粒的用量为0.1～0.2μg，表达狂犬病病毒的磷蛋白的辅助质粒的用量为0.6～0.7μg，表达狂犬病病毒的RNA聚合酶的辅助质粒的用量为0.25～0.3μg，表达狂犬病病毒的糖蛋白的辅助质粒的用量为3～4μg。

[0070] 在本发明的一些实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：

[0071] (1)构建所述重组狂犬病病毒载体；

[0072] (2)利用细胞密度不低于90％的仓鼠肾细胞进行重组病毒拯救，将步骤(1)获得的重组狂犬病病毒载体与辅助质粒在培养基中共孵育，得到混合物，将所述混合物加入脂质体中再次孵育，得到质粒‑脂质体复合物；将质粒‑脂质体复合物与待转染的仓鼠肾细胞混合，经培养后弃去质粒‑脂质体复合物，以含有胎牛血清培养基进行培养，获得拯救重组病毒，记为P1代；

[0073] (3)收获P1代重组病毒并接种于仓鼠肾细胞后进行孵育，加入胎牛血清细胞培养基继续恒温培养96～120h，收取培养物进行冻融，记作P2代；以同样方法连续传代培养至P5代，得到狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒。

[0074] 上述步骤(2)中，用于感染性克隆全长质粒与辅助质粒孵育的培养基为Opti‑MEM培养基。所述胎牛血清培养基为含2～10％胎牛血清的DMEM培养基。

[0075] 上述步骤(3)中，感作的条件为在37℃感作0.8～1.2h，冻融的温度为‑75～‑85℃。

[0076] 第四方面，本发明提供所述重组狂犬病病毒载体或所述狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒的以下任一种应用：

[0077] (1)在检测或筛选沙粒病毒或丝状病毒的中和抗体中的应用；

[0078] (2)在制备用于检测沙粒病毒或丝状病毒的中和抗体的试剂中的应用；

[0079] (3)在制备用于检测沙粒病毒或丝状病毒的试剂中的应用；

[0080] (4)在制备用于诊断沙粒病毒或丝状病毒感染或由沙粒病毒或丝状病毒感染引起疾病的试剂中的应用；

[0081] (5)在制备用于预防和/或治疗沙粒病毒或丝状病毒感染或由沙粒病毒或丝状病毒感染引起疾病的药物中的应用。

[0082] 上述(1)中，采用假病毒中和试验检测待测样品中是否含有中和抗体和/或中和抗体的效价，可通过检测荧光信号情况判断是否含有中和抗体以及中和抗体效价。

[0083] 上述(3)中，假病毒可作为沙粒病毒或丝状病毒检测的阳性对照品。

[0084] 上述(4)中，可通过检测血清等样本中的中和抗体是否存在和/或中和抗体的效价诊断是否感染沙粒病毒或丝状病毒。

[0085] 上述(5)中，所述药物优选为疫苗，本发明的假病毒可作为沙粒病毒或丝状病毒的疫苗的免疫原。

[0086] 上述(4)和(5)中，由沙粒病毒感染引起的疾病包括但不限于拉沙热，由丝状病毒感染引起的疾病包括但不限于马尔堡出血热。

[0087] 第五方面，本发明提供沙粒病毒或丝状病毒的中和性抗体检测试剂，所述试剂包含所述狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒。

[0088] 第六方面，本发明提供沙粒病毒疫苗或丝状病毒疫苗，所述疫苗包含所述狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒。

[0089] 第七方面，本发明提供一种沙粒病毒或丝状病毒的中和抗体的检测方法，所述检测方法包括：将待测样品进行不同稀释度的稀释，分别与所述狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒混合，得到混合液，将混合液接种至单层仓鼠肾细胞，同时设置阴性对照，经孵育后，弃去混合液并更换新鲜培养基，继续培养48～100h后于荧光显微镜下观察荧光情况。

[0090] 上述检测方法中，狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒的浓度优选为100TCID50。

[0091] 上述检测方法中，当阴性对照、病毒稀释对照、正常细胞对照全部成立时，根据各稀释度下样品的阳性孔数量，利用Reed‑Muench法计算结果，计算能够保护50％细胞孔不产生病毒荧光灶的样品稀释度，该稀释度则为待测样品的中和抗体效价。

[0092] 本发明的有益效果至少包括以下几点：

[0093] (1)本发明提供的重组狂犬病病毒载体具有较高的拯救效率，能够高效通过病毒拯救获得狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒。

[0094] (2)目前用于体外中和抗体评价的假病毒系统多为复制缺陷型重组病毒，即包装所产生的病毒粒子只能感染一代，无法在宿主细胞内复制增殖，无法进行体外扩繁，因此对于样本量大、检测批次多的中和抗体评价需进行反复拯救，存在假病毒包装的批次间差异，给中和抗体评价结果增加了人为误差干扰。本发明提供的狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒为复制增殖型假病毒，其生长动力学与相应的母本狂犬病病毒相似，在体外培6.25～6.50
养过程中能够进行复制增殖并获得较高的病毒滴度(滴度可高达10 TCID50/mL，而通常用于中和检测仅需要100TCID50)，可作为沙粒病毒和丝状病毒野毒的替代物，较好地模拟沙粒病毒和丝状病毒野毒与抗体的作用，用于检测沙粒病毒和丝状病毒的中和抗体及其效价，可满足大批量样品检测所需的假病毒，无需反复拯救，可在一次拯救成功后进行病毒滴度检测，稀释分装即可多次使用，大大节省了假病毒包装的成本。

[0095] (3)本发明提供的狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒的安全性良好，在不依托高等级生物安全实验室的条件下即可开展丝状病毒或沙粒病毒这些烈性高危病原体的中和抗体检测；经验证，对3日龄BALB/c乳鼠颅内接种假病毒，乳鼠100％存活且均未表现出现任何临床疾病症状。

[0096] (4)本发明提供的狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒在细胞水平可表达荧光蛋白，且可肉眼通过荧光显微镜直接观察以荧光信号为标准判读中和抗体检测结果，实现便捷的荧光可视化检测，无需荧光素酶、特异性抗体、FITC等荧光基团标记抗体，可在BSL‑2级实验室操作。与表达Luciferase荧光素酶报告基因的假病毒系统相比，无需使用细胞裂解液裂解宿主细胞以及昂贵的荧光素酶底物和大型荧光检测仪，简化了传统假病毒的检测步骤，节省了检测成本。

附图说明

[0097] 图1为本发明实施例1中重组病毒的基因组结构示意图，其中，CMV代表CMV启动子、T7代表T7启动子，HamRz代表锤头型核酶序列，HDV代表丁肝病毒核酶序列、T7t代表T7终止子，BGH代表poly(A)加尾信号序列。

[0098] 图2为本发明实施例1中重组质粒酶切鉴定电泳图。

[0099] 图3为本发明实施例1中重组病毒的荧光显微镜观察图。

[0100] 图4为本发明实施例1中重组病毒的电镜观察图。

[0101] 图5为本发明实施例1中重组病毒的Western blot鉴定图。

[0102] 图6为本发明实施例1中重组病毒的RT‑PCR鉴定电泳图。

[0103] 图7为本发明实施例1中重组病毒的生长动力学曲线图。

[0104] 图8为本发明实施例1中重组病毒的rSRV9‑eGFP‑LASV接种至3日龄BALB/c乳鼠的生存曲线图。

[0105] 图9为本发明实施例1中三种重组病毒rSRV9‑eGFP‑MARV接种至3日龄BALB/c乳鼠的生存曲线图。

[0106] 图10为本发明实施例2中重组病毒rSRV9‑eGFP‑LASV可视化中和抗体检测结果图。

[0107] 图11为本发明实施例2中重组病毒rSRV9‑eGFP‑MARV可视化中和抗体检测结果图。

具体实施方式

[0108] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0109] 实施例1重组病毒rSRV9‑eGFP‑LASV和rSRV9‑eGFP‑MARV的拯救和鉴定[0110] (一)重组病毒的构建

[0111] 1、感染性克隆的构建

[0112] (1)材料的准备

[0113] BSR‑T7细胞、pcDNA3.1质粒均可通过市售途径购买获得，BALB/c乳鼠购自吉林省长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

[0114] 以pcDNA3.1质粒为骨架，构建pcDNA3.1‑SRV9‑eGFP，方法如下：在pcDNA3.1空载体自带的CMV启动子下游，通过基因合成将T7启动子序列和锤头型核酶序列元件先行引入pcDNA3.1载体质粒中，并将SRV9全长基因组分段克隆至含有T7启动子和锤头型核酶序列下游，并在全长SRV9基因下游通过基因合成将丁肝病毒核酶序列元件引入序列中，得到pcDNA3.1‑SRV9，全长SRV9基因组最终可通过NheI(895bp)和NotI(927bp)酶切鉴定，在分段连接过程中，在SRV9全长基因组2425bp位置处通过引入BsiWi和PmeI酶切位点的方法插入绿色荧光蛋白报告基因eGFP，得到重组质粒pcDNA3.1‑SRV9‑eGFP。

[0115] 以pcDNA3.1质粒为骨架，构建pcDNA3.1‑N、pcDNA3.1‑P、pcDNA3.1‑L、pcDNA3.1‑G，方法如下：将狂犬病病毒的N基因、P基因、L基因和G基因分别插入至pcDNA3.1质粒的NheI(895bp)和SmaI(2076bp)酶切位点之间位置。

[0116] (2)用于构建感染性cDNA克隆目的片段的引物设计与合成

[0117] 根据Genbank:HQ688672.1公布的拉沙病毒LASV/Josiah株GP蛋白(G蛋白)完整编码基因序列和GenBank：DQ217792.1、KY047763.1和KU179482.1分别公布的马尔堡病毒Musoke株、Angola株及Ravn株GP蛋白完整编码基因序列为模板设计引物，利用Musoke‑F/Musoke‑R引物对扩增马尔堡病毒Musoke株GP序列；利用Angola‑F/Angola‑R引物对扩增马尔堡病毒Angola株GP序列；利用Ravn‑F/Ravn‑R引物对扩增马尔堡病毒Ravn株GP序列；利用LASV‑F/LASV‑R引物对扩增拉沙热病毒GP序列，具体引物序列信息如表1所示。分别利用KpnI/PstI酶切位点将上述病毒GP基因序列克隆至同时含有CMV启动子和T7启动子的pcDNA3.1‑SRV9‑eGFP全长骨架质粒，以GP序列替换SRV9基因组的G基因，克隆策略如图1所示。

[0118] 表1构建感染性cDNA克隆所需引物序列

[0119]

[0120] (3)重组质粒rSRV9‑eGFP‑LASV和rSRV9‑eGFP‑MARV的构建

[0121] 将LASV/Josiah GP基因片段或马尔堡病毒GP基因片段和载体质粒pCDNA3.1‑SRV9‑eGFP以限制性内切酶PstI/KpnI进行双酶切，利用T4 DNA连接酶将目的基因LASV/Josiah GP或马尔堡病毒GP基因片段克隆到重组载体pCDNA3.1‑SRV9‑eGFP，获得感染性克隆全长质粒rSRV9‑eGFP‑LASV(1个)和rSRV9‑eGFP‑MARV(3个)。通过限制性核酸内切酶PstI/KpnI对上述构建的感染性克隆全长质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图2所示，其中，A为rSRV9‑eGFP‑LASV的酶切电泳图，目的条带在1476bp左右；B为3个rSRV9‑eGFP‑MARV的酶切电泳图，目的条带在2046bp左右，酶切鉴定正确的质粒送公司测序。

[0122] 2、重组病毒rSRV9‑eGFP‑LASV和rSRV9‑eGFP‑MARV的拯救

[0123] 利用在6孔板中细胞密度约为90％的BSR/T7细胞，细胞密度为2×104～3×104个/孔，进行重组狂犬病病毒的拯救。将上述1中构建的4个感染性克隆全长质粒分别以2.5μg的用量与辅助质粒0.125μg pcDNA3.1‑N、0.625μg pcDNA3.1‑P、0.250μg pcDNA3.1‑L和3.7875μg pcDNA3.1‑G在Opti‑MEM中共孵育，将该混合物加入脂质体中再次孵育30min，使用Opti‑MEM润洗待转染的BSR/T7细胞两次后，均匀滴入质粒‑脂质体复合物，在37℃,5％CO2培养箱中培养5h后弃去复合物，各孔补加含5％胎牛血清的DMEM培养基2mL，4天后利用荧光显微镜观察特异性绿色荧光的出现；若出现荧光记重组病毒P1代。

[0124] 3、重组病毒的传代培养

[0125] 取500μL P1代重组病毒接种细胞后置于37℃细胞温箱中感作1h，补加含5mL 5％FBS的DMEM细胞培养基继续于37℃温箱中培养96～120h，收取培养物置于‑80℃冰箱中进行冻融2次后，进行分装，记作P2代。按照上述方法传代培养至P5代则证明拯救成功。

[0126] 相比仅以CMV为启动子的狂犬病毒SRV9拯救系统(与重组质粒rSRV9‑eGFP‑LASV和rSRV9‑eGFP‑MARV相比的区别仅在于删除重组狂犬病病毒基因组DNA上游的T7启动子，仅含有CMV启动子)，双启动子拯救系统对四种病毒的拯救效率均提高到75～100％。以病毒拯救成功细胞孔数与转染细胞总孔数比值计算拯救效率rSRV9‑eGFP‑Musoke为100％(4/4)、rSRV9‑eGFP‑Angola为100％(4/4)、rSRV9‑eGFP‑Ravn为100％(4/4)；rSRV9‑eGFP‑LASV为75％(3/4)；而仅以CMV为启动子的拯救系统对四种病毒的拯救效率为均为25％。由此可见，相较于单启动子病毒拯救系统，本发明的双启动子病毒拯救系统极大地提高了重组病毒的拯救效率。

[0127] 按照上述方法分别制备得到三种狂犬病病毒重组马尔堡病毒假病毒，分别命名为rSRV9‑eGFP‑Musoke、rSRV9‑eGFP‑Angola和rSRV9‑eGFP‑Ravn，以及一种狂犬病病毒重组拉沙病毒假病毒，命名为rSRV9‑eGFP‑LASV。

[0128] (二)重组病毒rSRV9‑eGFP‑LASV和rSRV9‑eGFP‑MARV的鉴定

[0129] 1、重组病毒的荧光观察

[0130] 在转染后每天在荧光显微镜下观察绿色荧光情况，结果如图3所示，在转染后第2天出现较小的绿色荧光灶，在第7天绿色荧光灶变大，在第10天，绿色荧光灶继续变大，且数量显著增多；其中，图3的A为荧光视野下重组病毒感染的细胞，图3的B为明亮视野下重组病毒感染的细胞。

[0131] 2、重组病毒的电镜观察

[0132] 将拯救成功的重组病毒传代培养，取P5代病毒培养上清经透射电镜观察，具体检测方法为：将β‑丙内酯灭活的病毒液滴于封口膜上，使之形成一个球形小液滴，用眼科镊夹取透射电镜专用铜网悬于小液滴上方与重组病毒充分吸附，室温作用15min后用1％磷钨酸染色3min，染色后用吸水纸除去铜网表面残余的磷钨酸，在透射电镜下观察病毒粒子。结果如图4所示，在透射电镜下观察，可看到典型的子弹状病毒粒子，长约130～240nm，直径约65～80nm

[0133] 3、重组病毒表面糖蛋白的免疫印迹鉴定

[0134] 将重组病毒rSRV9‑eGFP‑LASV与rSRV9‑eGFP‑MARV体外培养15mL，采用超滤管离心浓缩至200μL，与SDS‑PAGE Buffer混合后煮沸10min用于电泳；结束后将SDS‑PAGE凝胶转印至NC膜；将NC膜先后分别与一抗和二抗混合孵育；TBST洗涤膜5次每次5min；在膜上滴加曝光液置于曝光仪内成像。结果如图5所示，rSRV9‑eGFP‑MARV分别可在170kDa、40kDa以及74kDa附近出现特异性条带，rSRV9‑eGFP‑LASV在70kDa附近出现特异性条带，结果与预期相符，表明拉沙病毒和马尔堡病毒的糖蛋白成功重组在狂犬病病毒粒子表面。

[0135] 4、重组病毒的遗传稳定性鉴定

[0136] 取第5代的病毒培养液，利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取重组病毒基因组，利用表2所示的体系及反应设置进行反转录，将反转录后cDNA产物利用表3所示的体系及反应设置进行PCR扩增。鉴定结果如图6所示，其中，A为重组病毒rSRV9‑eGFP‑LASV的RT‑PCR图，目的条带在1476bp左右；B为重组病毒rSRV9‑eGFP‑MARV的RT‑PCR图，分别为rSRV9‑eGFP‑Musoke、rSRV9‑eGFP‑Angola、rSRV9‑eGFP‑Ravn，目的条带均在2046bp左右，证明重组病毒的遗传稳定性较好。

[0137] 表2反转录体系及反应设置

[0138]

[0139] 表3 PCR反应体系及反应设置

[0140]

[0141] 5、重组病毒的生长动力学检测

[0142] 使用12孔板，将重组病毒rSRV9‑eGFP‑LASV和三种重组病毒rSRV9‑eGFP‑MARV以MOI＝0.1分别接种至BSR/T7细胞置于37℃,5％CO2温箱中培养，分别收获接种细胞后24h，48h，72h，96h培养上清，并在BSR/T7细胞上进行病毒滴度检测绘制生长曲线。结果如图7所示，重组病毒rSRV9‑eGFP‑LASV和三种重组病毒rSRV9‑eGFP‑MARV与母本狂犬病病毒SRV9生长曲线相似，表明拉沙病毒糖蛋白GP基因和马尔堡病毒糖蛋白GP基因插入到狂犬病病毒基因组中对病毒的复制动力学无显著影响，重组病毒能够在体外增殖获得较高的病毒滴度
6.25～6.5
(病毒滴度均可达10 TCID50/mL)。

[0143] 6、重组病毒的体内安全性评价

[0144] 以相同剂量的重组病毒rSRV9‑eGFP‑LASV、rSRV9‑eGFP‑MARV、母本狂犬病病毒SRV9分别颅内注射3日龄BALB/c乳鼠，接种后监测14天。结果如图8和图9所示，接种母本狂犬病病毒SRV9的小鼠全部死亡，而注射重组病毒的各组小鼠精神状态良好且全部存活，表明rSRV9‑eGFP‑LASV(图8)和三种rSRV9‑eGFP‑MARV(图9)具有良好的安全性。

[0145] 实施例2重组病毒在可视化中和抗体检测中的应用

[0146] 本实施例基于实施例1构建的重组病毒提供一种新型拉沙病毒和马尔堡病毒可视化中和抗体检测方法，该方法的主要步骤如下：

[0147] 1、待检血清样品的制备

[0148] 待检血清样品于56℃水浴锅中灭活30min；将10倍稀释后的血清样品作为初始稀释度，而后进行连续倍比稀释；

[0149] 2、假病毒中和抗体检测方法

[0150] 取各稀释度下50μL样品分别加入100TCID50重组病毒rSRV9‑eGFP‑LASV和rSRV9‑eGFP‑MARV得到混合液，将混合液接种至长满单层BSR/T7细胞的96孔板，同时设置阴性对照，37℃5％CO2培养箱中作用1小时，弃去血清与病毒混合液后更换新鲜培养基，继续培养48h后于荧光显微镜下观察结果。

[0151] 3、荧光灶观察及中和抗体检测结果判定

[0152] 将培养后的96孔板置于荧光显微镜载物台，使用蓝色激发光进行观察：若镜下可观察到斑块状绿色荧光，则表示对应血清样品在该稀释度下无法中和重组病毒rSRV9‑eGFP‑LASV或rSRV9‑eGFP‑MARV；若镜下观察无特异性绿色荧光，则表示对应血清样品在该稀释度下可以中和重组病毒rSRV9‑eGFP‑LASV或rSRV9‑eGFP‑MARV，标记为阳性孔(CPE孔)。

[0153] 4、结果计算

[0154] 在中和抗体检测回归试验中，当阴性对照、病毒稀释对照、正常细胞对照全部成立时，根据各稀释度下血清样品的阳性孔数量，利用Reed‑Muench法计算结果，计算得到能够保护50％细胞孔不产生病毒荧光的血清稀释度，该稀释度则为对应血清样品的中和抗体效价。

[0155] 血清样品的稀释度及其中和抗体检测结果如表4所示。

[0156] 表4举例计算

[0157]

[0158] lg TCID50＝高于50％血清稀释度的对数‑相对距离比×稀释系数的对数；

[0159] 其中，

[0160]

[0161] 稀释系数的对数如表5所示。

[0162] 表5稀释系数的对数

[0163]

[0164] 经计算得到lgTCID50＝‑1.5‑0.5×(‑0.3)＝‑1.35，即TCID50/50μL＝10‑1.35[0165] 由表5可见，因10‑1.35＝1:22，则1:22的血清可保护50％的细胞不产生CPE，则1:22为该血清样品的中和抗体效价，利用三种狂犬病病毒重组马尔堡病毒检测的阳性血清效价如图10所示，利用狂犬病病毒重组拉沙病毒检测的阳性血清效价如图11所示。结果表明，携带绿色荧光报告蛋白eGFP基因的狂犬病病毒重组马尔堡病毒以及狂犬病病毒重组拉沙病毒可作为假病毒替代马尔堡病毒和拉沙病毒实毒进行中和抗体检测，且检测结果可通过肉眼判读，操作简便，结果直观。

[0166] 综上所述，本发明提供了利用双启动子狂犬病病毒反向遗传操作拯救携带绿色荧光蛋白eGFP报告基因的拉沙病毒假病毒和马尔堡病毒假病毒的高效拯救方法及其在可视化中和抗体检测中的应用。基于病毒反向遗传学技术，成功拯救出一株重组病毒rSRV9‑eGFP‑LASV和三株重组病毒rSRV9‑eGFP‑MARV。该假病毒可以模拟病毒不同生命周期，且只需在BSL‑2安全条件下进行，可极大程度降低生物安全风险，为拉沙热和马尔堡出血热的疫苗、药物研制提供理论依据和技术储备，也为在BSL‑2安全条件下更好地研究拉沙病毒和马尔堡病毒感染机制及机体的免疫防护奠定基础。

[0167] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。