丹参酮ⅡA修饰物及其制备方法和用途

摘要

本发明公开丹参酮ⅡA修饰物及其制备方法和用途。本发明通过曼尼希加成反应、酯水解反应、缩合反应等步骤成功制备了末端氨基的丹参酮ⅡA修饰物。利用丹参酮ⅡA与雌激素受体的亲和性，构建具有主动靶向性的纳米递送体系。当负载抗肿瘤药物Dox后，在细胞水平及动物体内水平均表现出较好的肿瘤靶向性及抗肿瘤作用，同时具有较高的安全性，有望成为以乳腺癌为代表的具有雌激素受体过表达特征疾病的靶向治疗方式。

权利要求

1.一种具有下式(I)所示结构的丹参酮ⅡA修饰物或其盐：

其中，n为2‑10范围内的整数。

2.根据权利要求1所述的丹参酮ⅡA修饰物或其盐的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向式(II)所示结构化合物的有机溶液加入一端含有保护基团的氨基‑PEGn‑氨基和催化剂反应，然后萃取，用氨水洗涤后浓缩得到中间体3；

(2)向中间体3的有机溶液加入有机酸反应得到丹参酮ⅡA修饰物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，进一步包括(3)向丹参酮ⅡA乙酸溶液加入甘氨酸乙酯盐酸盐和醛水溶液反应，得到中间体1，取中间体1溶于盐酸溶液，80℃搅拌，浓缩冻干得到式(II)所示结构化合物的步骤。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述有机溶液为二甲基乙酰胺、四氢呋喃和二氯甲烷中的至少一种溶液。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)的催化剂包括2‑(7‑偶氮苯并三氮唑)‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸酯和N,N‑二异丙基乙胺。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)的有机酸包括三氟乙酸、甲基磺酸和甲苯磺酸中的至少一种。

7.一种雌激素受体靶向性的递送系统，其特征在于，包括载体和与所述载体共价连接的靶向性分子，其中，所述靶向性分子为根据权利要求1所述的丹参酮ⅡA修饰物或其盐，所述载体为介孔硅纳米颗粒。

8.根据权利要求7所述的雌激素受体靶向性的递送系统的制备方法，其特征在于，包括将载体分散于水溶液中，活化载体表面的羧基，加入丹参酮ⅡA修饰物或其盐及三乙胺反应，得到所述递送系统。

9.根据权利要求1所述的丹参酮ⅡA修饰物或其盐，或根据权利要求7所述的雌激素受体靶向性的递送系统在制备抗雌激素受体过表达肿瘤的药物中的用途。

说明书

丹参酮ⅡA修饰物及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及医药领域，具体地涉及丹参酮ⅡA修饰物及其制备方法和用途，特别是涉及靶向雌激素受体的介孔硅纳米粒的制备及治疗乳腺癌方面应用。

背景技术

[0002] 乳腺癌已经成为当今世界威胁女性健康和导致女性死亡最严重的疾病之一，预测未来的十年中乳腺癌患者总数仍会持续增长，并且70％以上的乳腺癌为雌激素依赖型。纳米医学为乳腺癌的诊断及治疗提供了新的机遇，基于雌激素依赖型的乳腺癌，雌激素受体的过表达是其诊断依据之一。设计良好的靶向雌激素受体的纳米制剂，对于雌激素依赖型乳腺癌的诊断及治疗意义重大。

[0003] 植物雌激素具有与雌激素类似的结构及功能，中药丹参中含有多种植物雌激素类的活性成分，其中报道了丹参酮ⅡA(Tan IIA)作为活性成分，用于治疗心血管病，具有扩展血管、降压、抗栓的功能，对治疗冠心病、心绞痛、心律过速有显著疗效。

[0004] 背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

[0005] 为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种丹参酮ⅡA修饰物，用于作为靶向分子制备药物递送系统，其能够特异性靶向给药部位，大大提高了给药的主动靶向性。具体地，本发明包括以下内容。

[0006] 本发明的第一方面，提供一种具有下式(I)所示结构的丹参酮ⅡA修饰物或其盐：

[0007]

[0008] 其中，n为2‑10，优选3‑8，更优选3‑5范围内的整数。

[0009] 优选地，所述盐为有机酸盐，其实例包括但不限于三氟乙酸、甲基磺酸和甲苯磺酸。

[0010] 本发明的第二方面，提供丹参酮ⅡA修饰物或其盐的制备方法，其包括以下步骤：

[0011] (1)向式(II)所示结构化合物的有机溶液加入一端含有保护基团的氨基‑PEGn‑氨基和催化剂反应，然后萃取，用氨水洗涤后浓缩得到中间体3；

[0012]

[0013] (2)向中间体3有机溶液加入有机酸反应得到丹参酮ⅡA修饰物。

[0014] 可选地，本发明的制备方法还可包括(3)向丹参酮ⅡA的乙酸溶液加入甘氨酸乙酯盐酸盐和醛水溶液反应，得到中间体1，醛水溶液的实例包括甲醛水溶液，或多聚甲醛水溶液，例如三聚甲醛水溶液等；

[0015]

[0016] 取中间体1溶于盐酸溶液，高温搅拌，浓缩冻干得到中间体2；

[0017]

[0018] 根据本发明所述的制备方法，优选地，氨基保护基为Cbz保护基、Boc保护基、PMB保护基、Trt保护基中的至少一种。

[0019] 根据本发明所述的制备方法，优选地，步骤(3)中的所述有机溶液为二甲基乙酰胺、四氢呋喃和二氯甲烷中的至少一种溶液。

[0020] 根据本发明所述的制备方法，优选地，步骤(3)的催化剂包括2‑(7‑偶氮苯并三氮唑)‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸酯和N,N‑二异丙基乙胺。

[0021] 根据本发明所述的制备方法，优选地，步骤(4)的有机酸包括三氟乙酸、甲基磺酸和甲苯磺酸中的至少一种。

[0022] 本发明的第三方面，提供一种雌激素受体靶向性的递送系统，其包括载体和与所述载体共价连接的靶向分子，其中，所述靶向分子为第一方面所述的丹参酮ⅡA修饰物或其盐在制备。

[0023] 根据本发明所述的雌激素受体靶向性的递送系统，优选地，所述载体为纳米颗粒，如硅介孔硅粒。

[0024] 本发明的第四方面，提供雌激素受体靶向性的递送系统的制备方法，其包括将载体分散于水溶液中，活化载体表面的羧基，加入丹参酮ⅡA修饰物或其盐及三乙胺反应，得到所述递送系统。所述载体可以是负载药物的载体或未负载药物的空载体。

[0025] 本发明的第五方面，提供丹参酮ⅡA修饰物或其盐，或雌激素受体靶向性的递送系统在制备抗雌激素受体过表达肿瘤的药物中的用途。

[0026] 本发明通过曼尼希加成反应、酯水解反应、缩合反应等步骤成功制备了末端氨基的丹参酮ⅡA修饰物。进一步，将修饰物接枝于载体，构建了纳米粒级靶向递送载体，该载体负载抗肿瘤药物Dox后，在细胞水平及动物体内水平均表现出较好的肿瘤靶向性及抗肿瘤作用，同时具有较高的安全性。Tan‑MSN作为一种基于纳米平台的中药活性成分介导的给药途径，有望成为以乳腺癌为代表的具有雌激素受体过表达特征疾病的靶向治疗方式。

[0027] 本发明利用TanⅡA与雌激素受体的亲和性，构建具有主动靶向性的纳米递送体系。在优选的实施方案中，使用介孔硅纳米粒作为载体，其具有良好生物相容性，具有有效成分负载量高，表面易于修饰等方面的优势。因此，将丹参酮ⅡA修饰于介孔硅纳米粒上，利用其与雌激素受体的亲和效果，制备出具有雌激素受体靶向性的介孔硅纳米粒，为乳腺癌的诊疗发挥重要作用。

附图说明

[0028] 图1不同配体与雌激素受体α蛋白的分子对接(A：β雌二醇；B：TanⅡA；C：Tan‑COOH)。

[0029] 图2不同配体与雌激素受体β蛋白的分子对接(A：β雌二醇；B：TanⅡA；C：Tan‑COOH)。

[0030] 图3实施例1制备的Tan‑Dox‑MSN的TEM图。

[0031] 图4孵育不同时间MCF‑7细胞对纳米粒摄入的定量分析结果。注(***：P＜0.001，**：P＜0.01，mean±SD，n＝3)。

[0032] 图5为不同时间点荷瘤裸鼠体内的吲哚菁绿荧光分布。

[0033] 图6为12h时肿瘤和脏器中的盐酸阿霉素荧光强度。

[0034] 图7为荷瘤小鼠模型在治疗过程(第2‑12天)的相对肿瘤体积变化。

[0035] 图8为12天后各组小鼠离体肿瘤图片。A：生理盐水；B：Dox注射液；C：Dox溶液；D：Dox‑MSN；E：MSN‑Tan；F：Tan‑Dox‑MSN。

具体实施方式

[0036] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0037] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0038] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

[0039] 实施例1

[0040] 本实施例为提高肿瘤主动靶向性的介孔硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

[0041] 一、植物雌激素类中药活性成分丹参酮ⅡA的修饰

[0042] (1)将丹参酮ⅡA(4.5g，15.3mmol)溶于乙酸(360mL)中，加入甘氨酸乙酯盐酸盐(4.25g，30.6mmol)和甲醛(3mL，37％水溶液)，在65℃下搅拌12小时。LCMS监测反应。反应完成后，将混合物冷却至25℃，并在真空下浓缩。混合物用清水洗涤(200mL*5)。混合物经过滤并在硅胶色谱柱(洗脱液：石油醚/乙酸乙酯＝60/40)得到中间体1。

[0043] (2)将中间体1(2.0g，4.88mmol)加入6N盐酸(20mL)的溶液。将溶液在80℃下搅拌4小时。LCMS显示反应完成。然后在真空中浓缩后直接冻干得到中间体2(1.3g，3.4mmol，收率70％)为红色固体。

[0044] (3)将中间体2(1.3g，3.4mmol)加入DMF(10mL)中，之后加入t‑Boc‑N‑Amido‑PEGn‑amine(n＝3，1.2g，4.1mmol)，HATU(1.56g，4.1.1mmol)和DIEA(1.3g,10.2mmol)的溶液中。在室温下搅拌1h。用LCMS检查中间体的消失。反应完成后。用乙酸乙酯(300mL*3)萃取混合物，用氨水(50mL*2)洗涤有机物。将有机相浓缩得到中间体3(1.5g)。

[0045] (4)向中间体3(1.5g)的DCM(10mL)溶液中缓慢加入TFA(10mL)。室温反应1小时。LCMS监测反应已完成。通过在酸性条件下的Pre‑HPLC的反相制备方法，得到丹参酮ⅡA修饰物(265mg，0.477mmol，13.7％)。所述修饰物为三氟乙酸盐的形式。

[0046] 二、植物雌激素丹参酮ⅡA修饰的靶向纳米粒的制备，包括如下步骤：

[0047] (1)称取适量的MSN‑COOH分散于含有Dox的PBS缓冲溶液中，室温搅拌(避光)一定时间，离心分离(10000rpm，25℃，10min)，沉淀用PBS缓冲液洗涤3次，沉淀于40℃真空干燥12h，得到Dox‑MSN纳米粒。

[0048] (2)称取适量Dox‑MSN超声分散于10mL MES缓冲液(pH 6.0)中，加入适量EDC/NHS，混合均匀后于室温条件下震荡1h进行活化羧基，离心分离(10000rpm，25℃，10min)取沉淀重新分散于10mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，加入适量丹参酮ⅡA修饰物及三乙胺后，反应3h，离心分离(10000rpm，25℃，10min)，沉淀用PBS缓冲液洗涤3次，得到丹参酮ⅡA修饰的介孔硅纳米粒(Tan‑Dox‑MSN)。

[0049] 由图3可以看出，本实施例制备得到的介孔硅纳米粒粒径较小且均一。

[0050] 实施例2

[0051] 本实施例为提高肿瘤主动靶向性的介孔硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

[0052] 一、植物雌激素类中药活性成分丹参酮ⅡA的修饰

[0053] (1)将丹参酮ⅡA溶于乙酸中，之后加入甘氨酸乙酯盐酸盐和甲醛水溶液，搅拌均匀，反应适宜时间后，过硅胶柱提纯，得到中间体1。

[0054] (2)取中间体1溶于盐酸溶液。将溶液在高温下搅拌，浓缩冻干得到中间体2。

[0055] (3)将中间体2溶于二甲基乙酰胺中，之后加入氨基‑PEGn‑Cbz氨基保护基(n＝4)，2‑(7‑偶氮苯并三氮唑)‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸酯、N,N‑二异丙基乙胺，搅拌均匀，乙酸乙酯萃取，氨水洗涤后浓缩得到中间体3。

[0056] (4)将中间体3溶于DMSO中，加入三氟乙酸，反应完全后，通过制备色谱得到丹参酮ⅡA修饰物。所述修饰物为三氟乙酸盐的形式。

[0057] 二、植物雌激素丹参酮ⅡA修饰的靶向纳米粒的制备，包括如下步骤：

[0058] (1)采用羧基功能化的介孔硅(MSN‑COOH)为递送载体，通过吸附法负载吲哚菁绿(ICG)。

[0059] (2)将负载有效成分后的载体分散于水溶液中，可以采用1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N‑羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)活化羧基后，离心后，加入0.065倍质量的丹参酮ⅡA修饰物，三乙胺(2eq)，进行反应。即得靶向雌激素受体的多功能介孔硅纳米粒。

[0060] 经检测，本实施例的靶向雌激素受体的介孔硅纳米粒粒径与实施例1相似。

[0061] 实施例3

[0062] 本实施例为提高肿瘤主动靶向性的多功能介孔硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

[0063] 一、植物雌激素类中药活性成分丹参酮ⅡA的修饰

[0064] (1)将丹参酮ⅡA溶于乙酸中。之后加入甘氨酸乙酯盐酸盐和多聚甲醛溶液，搅拌均匀，反应适宜时间后，过硅胶柱提纯，得到中间体1。

[0065] (2)取中间体1溶于盐酸溶液。将溶液在高温下搅拌，浓缩冻干得到中间体2。

[0066] (3)将中间体2溶于二甲基乙酰胺中，之后加入氨基‑PEGn‑PMB氨基保护基(n＝6)，2‑(7‑偶氮苯并三氮唑)‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸酯，N,N‑二异丙基乙胺，搅拌均匀，乙酸乙酯萃取，氨水洗涤后浓缩得到中间体3。

[0067] (4)将中间体3溶于氯仿中，加入三氟乙酸，反应完全后，通过制备色谱得到丹参酮ⅡA修饰物。所述修饰物为三氟乙酸盐的形式。

[0068] 二、植物雌激素丹参酮ⅡA修饰的靶向纳米粒的制备，包括如下步骤：

[0069] (1)采用羧基功能化的介孔硅为递送载体，通过吸附法负载香豆素‑6。

[0070] (2)将负载有效成分后的载体分散于水溶液中，采用1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N‑羟基丁二酰亚胺活化羧基后，离心后，加入0.2倍质量的丹参酮ⅡA修饰物，三乙胺(6eq)，进行反应。即得靶向雌激素受体的介孔硅纳米粒。

[0071] 经检测，本实施例的靶向雌激素受体的介孔硅纳米粒粒径与实施例1相似。

[0072] 测试例

[0073] 为了确认修饰基团对于药物的结合活性是否产生影响，发明人对实施例1的靶向雌激素受体的介孔硅纳米粒进行了分子对接研究、细胞摄入试验、肿瘤靶向性研究、抗肿瘤活性研究，方法和结果如下：

[0074] 一、分子对接研究

[0075] 配体准备：丹参酮ⅡA的结构来源于中医药资料库(http://tcm.cmu.edu.tw)，原配体β雌二醇及修饰物的结构使用ChemDraw软件绘制，以mol2格式进行保存，将所有配体导入Discovery Studio软件中。配体进行加氢、能量最小化操作后，与受体进行对接。

[0076] 受体准备：从蛋白数据库(Protein  Data  Bank，PDB数据库，http://www.rcsb.org)中下载雌激素受体α(PDB：1QKT)和雌激素受体β(PDB：3OLL)晶体结构，将结构保存为mol2格式。将蛋白结构导入Discovery Studio软件，进行去水，选取原配体结合位点，删除原配体后，与预选配体进行对接。

[0077] 对接过程中，采用CDOCKER模式，选择的空腔半径为10，其余参数均为系统默认值。

[0078] 由表1和表2可知，丹参酮ⅡA及其修饰物与雌激素受体α及雌激素受体β的‑CDOCKER INTERACTION ENERGY均为正值，由于能量越低稳定性越好，表明丹参酮ⅡA及其修饰物与雌激素受体α及雌激素受体β结合较为稳定。

[0079] 表1预选配体与雌激素受体α蛋白对接结果

[0080]

[0081] 表2预选配体与雌激素受体β蛋白对接结果

[0082]

[0083] 图1‑A可知，原配体β雌二醇与雌激素受体α中氨基酸残基ARG394、GLU353形成氢键相互作用，与LEU346、LEU384、ALA350、MET388、LEU387、LEU391形成疏水相互作用。因此认为ARG394、GLU353、LEU346、LEU384、ALA350、MET388、LEU387、LEU391是雌激素受体α与配体结合的关键氨基酸。

[0084] 由图1‑B可知，丹参酮ⅡA与雌激素受体α中氨基酸残基GLU353、MET388形成氢键相互作用，与LEU349、LEU346、ALA350、MET421、LEU525、HIS524、MET343、LEU384、LEU387、LEU391、PHE404形成疏水相互作用。

[0085] 由图1‑C可知，丹参酮ⅡA末端羧基修饰物与雌激素受体α中氨基酸残基THR347形成氢键相互作用，与ALA350、LYS529、MET388、PHE404、LEU384形成疏水相互作用，与MET421形成Pi‑sulfur相互作用，与LEU525形成Pi‑Sigma相互作用。

[0086] 由图2‑A可知，原配体β雌二醇与雌激素受体β中氨基酸残基HIS475、GLU305形成氢键相互作用，与LEU298、LEU476、ILE373、MET336、ILE376、MET340、ALA302、LEU339、LEU343、PHE356形成疏水相互作用。因此认为HIS475、GLU305、LEU298、LEU476、ILE373、MET336、ILE376、MET340、ALA302、LEU339、LEU343、PHE356是雌激素受体β与配体结合的关键氨基酸。

[0087] 由图2‑B可知，TanⅡA与雌激素受体β中氨基酸残基GLU305、MET340形成氢键相互作用，与LEU301、LEU339、ALA302、LEU298、LEU476、MET295、ILE373、HIS475、LEU343、PHE356形成疏水相互作用。

[0088] 由图2‑C可知，中间体2与雌激素受体β中氨基酸残基MET340、LEU298、GLU305形成氢键相互作用，与PHE356、LEU343、LAL302、LEU339、HIS475、MET295、LEU476、ILE373、ILE376形成疏水相互作用，与MET336形成Pi‑sulfur相互作用。

[0089] 二、Dox‑MSN及Tan‑Dox‑MSN制剂的制备

[0090] 称取适量的MSN‑COOH分散于一定浓度的盐酸阿霉素PBS缓冲溶液中，室温搅拌(避光)一定时间，离心分离(10000rpm，25℃，10min)，沉淀用PBS缓冲液洗涤3次，沉淀于40℃真空干燥12h，得到Dox‑MSN纳米粒，合并所有上清液和洗涤液用于计算载药量。图3实施例1制备的Tan‑Dox‑MSN的TEM图。

[0091] 三、细胞摄入研究

[0092] 收集对数增长期的MCF‑7细胞，计其密度，以5×105个/孔，接种于6孔板中，每孔2mL，放置于培养箱中，5％CO2、37℃培养24h。吸出原培养液，分别加入2mL含有Dox‑MSN以及Tan‑Dox‑MSN的培养液(Dox浓度为5μg/mL)，培养1、2、4h。培养结束后，用PBS清洗三遍，用
1mL 0.25％胰酶+0.02％EDTA对细胞进行消化，两倍量完全培养基终止消化后离心，用PBS分散，采用流式细胞仪进行分析，设定Dox的激发波长为470nm，发射波长为580nm。对MCF‑7细胞摄入不同制剂的情况进行定量分析。

[0093] 由图4可知，在制备出的修饰组(Tan‑Dox‑MSN)在1、2、4h内MCF‑7细胞的摄入量高于未修饰组(Dox‑MSN)表现出较好的靶向效果。

[0094] 四、体内肿瘤靶向性研究

[0095] 采用实施例1中方法，将Dox替换为吲哚菁绿(ICG)制备相应纳米粒(ICG‑MSN、Tan‑ICG‑MSN)。

[0096] 将荷瘤裸鼠随机分成7组，每组3只。具体分组情况如下：生理盐水组、ICG溶液组、ICG‑MSN组、Tan‑ICG‑MSN组、Dox溶液组、Dox‑MSN组、Tan‑Dox‑MSN组。每组分别标号后按体重计算给药剂量，给药各组小鼠尾静脉注射200μL溶液或者制剂，生理盐水组注射相同体积的生理盐水。其中，各组ICG的剂量为1mg/kg；各组Dox的剂量为2mg/kg。

[0097] 生理盐水组、ICG溶液组、ICG‑MSN组、Tan‑ICG‑MSN组于注射后1h、4h、12h、24h进行活体成像拍照，观察各组小鼠体内的荧光分布情况。将Dox溶液组、Dox‑MSN组、Tan‑Dox‑MSN组的小鼠在给药12h后处死，进行解剖，分别取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织，置于小动物活体成像系统中进行观察，确定载体及药物在各组织器官及肿瘤部位的分布情况。

[0098] 从图5、图6中可以看到，Tan‑ICG‑MSN在12h及24h于小鼠肿瘤部位荧光强度明显，体现出良好的靶向性，Tan‑Dox‑MSN组肿瘤部位荧光强度高于Dox‑MSN组，说明Tan‑Dox‑MSN具有良好的肿瘤靶向效果。

[0099] 五、抗肿瘤活性研究

[0100] 通过构建荷瘤MCF‑7细胞的BALB/c裸鼠乳腺癌模型并给予不同药物，记录肿瘤体积与重量等方式，考察提高阿霉素肿瘤主动靶向性和肾脏保护的纳米结构脂质制剂在体内抗肿瘤的作用，并通过考察肿瘤部位的细胞增殖与凋亡情况对药物抗肿瘤效果加以验证。

[0101] 取指数生长期人乳腺癌MCF‑7细胞进行传代操作，待细胞密度达到一定数量后，用MEM培养基重悬，离心，用PBS清洗3次以去除血清，再用MEM培养基稀释以调整细胞浓度，用8
计数板计数。将MCF‑7细胞悬液以MEM培养基稀释至1×10个/mL，加入等体积的基质胶。用酒精棉擦拭雌性BALB/c裸鼠腋下，将100μL含有基质胶的细胞悬液用预冷后的1mL注射器接种于裸鼠前肢腋下皮下，在接种时要注意细胞悬液的混匀，并保持温度在0‑4℃，以防止基
3
质胶凝固。每天观察肿瘤生长情况，且用游标卡尺测量肿瘤大小，待肿瘤体积至100mm 左右
2
时(a：肿瘤宽度，b：肿瘤长度，肿瘤体积V＝ab/2)进行随机分组。

[0102] 将荷瘤小鼠随机分成6组。具体分组情况如下：

[0103] 生理盐水组

[0104] 阳性药物盐酸阿霉素注射液组(DOX注射液)

[0105] 盐酸阿霉素溶液组(DOX溶液)

[0106] 载有盐酸阿霉素介孔硅纳米粒组(Dox‑MSN)

[0107] 丹参酮ⅡA修饰的空白介孔硅纳米粒组(Tan‑MSN)

[0108] 丹参酮ⅡA修饰的载有盐酸阿霉素的介孔硅纳米粒组(Tan‑Dox‑MSN)

[0109] 各组制备方法如下：

[0110] 生理盐水组：购买自石家庄第四制药厂。

[0111] 阳性药物盐酸阿霉素注射液(DOX注射液)：购买自山西普德药业有限公司。

[0112] 盐酸阿霉素溶液(D溶液)的制备：按质量比为1:1000的比例取盐酸阿霉素，溶于生理盐水中，制成丹酚酸A溶液。

[0113] 丹参酮ⅡA修饰的空白介孔硅纳米粒(Tan‑MSN)的制备：称取适量MSN‑COOH超声分散于10mL MES缓冲液(pH 6.0)中，加入适量EDC/NHS，混合均匀后于室温条件下震荡1h进行活化羧基，离心分离(10000rpm，25℃，10min)取沉淀重新分散于10mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，加入适量丹参酮ⅡA修饰物及三乙胺后，反应3h，离心分离(10000rpm，25℃，10min)，沉淀用PBS缓冲液洗涤3次，得到丹参酮ⅡA修饰的介孔硅纳米粒(Tan‑MSN)，合并所有上清液和洗涤液用于计算损失药量。

[0114] 丹参酮ⅡA修饰的载有盐酸阿霉素的介孔硅纳米粒组(Tan‑Dox‑MSN)：为实施例1制备的样品。

[0115] 每组分别标号后按体重计算给药剂量，给药各组小鼠尾静脉注射约200μL溶液或者制剂，对照组注射相同体积的生理盐水。每3天注射1次，共给药5次。

[0116] 如图7所示，用药后(第0、3、6、9、12天)用游标卡尺测量肿瘤长径(a)和短径(b)，肿2
瘤体积V＝ab /2。以给药时间为横坐标，以各组不同时间肿瘤体积与对照组给药12天后的肿瘤体积平均值之比为纵坐标(相对肿瘤体积)，绘制相对肿瘤体积‑时间变化曲线。

[0117] 第5次给药后次日处死荷瘤小鼠，把皮下移植瘤连同胞膜完整剥离出肿瘤组织如图8，Tan‑Dox‑MSN组的相对肿瘤体积与DOX溶液组及Dox‑MSN组比均具有极显著下降(p＜0.01)，说明纳米结构脂质制剂可以提高药物在肿瘤部位有效积累，提高了药物的生物利用度，提高药物的体内抗肿瘤作用。

[0118] 实验证明，实施例2、3制备的靶向雌激素受体的多功能介孔硅纳米粒在细胞摄入实验及体内肿瘤靶向性与实施例1相似。

[0119] 尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。