一种重金属抗性的高地芽孢杆菌及其应用转让专利
申请号 : CN202210850167.1
文献号 : CN114990033B
文献日 : 2022-12-06
发明人 : 王承民 , 季芳 , 王雪 , 赵佳男 , 徐莉莉
申请人 : 广东省科学院动物研究所 , 优宜邦生物科技(上海)有限公司
摘要 :
本申请公开了一种重金属抗性菌，该重金属抗性菌为高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis，该重金属抗性菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：62442；其中，重金属包括Mn2+、Pb2+中的至少一种。本申请还提供了上述重金属抗性菌在重金属污染水体或土壤治理中的应用。本申请的重金属抗性菌有较好的重金属去除能力，能够用于重金属抗性菌污染土壤或水体治理，具有成本低、效率高和不会产生二次污染等优点。
权利要求 :
1.一种重金属抗性菌，其特征在于，所述重金属抗性菌为高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis，所述重金属抗性菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：62442；
2+ 2+
其中，重金属包括Mn 、Pb 中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的重金属抗性菌在重金属污染水体或土壤治理中的应用，其中，
2+ 2+
重金属包括Mn 、Pb 中的至少一种。
说明书 :
一种重金属抗性的高地芽孢杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物领域，更具体地，涉及重金属抗性的高地芽孢杆菌及其应用。
背景技术
[0002] 重金属具有致畸、致癌、致突变作用，由于重金属不易被生物体降解，且能通过食物链传递并富集，可经多种途径进入人体，严重危害人体健康。水体重金属污染主要是指水体中的镉、铜、铅、锌、镍、锰、钴等金属离子的浓度超过了一定的浓度标准而引起的，成为水体污染中危害极大的一种。
[0003] 铅经消化道吸收后，在人体内蓄积。主要存在于骨骼中，少量蓄积在肝、脑、肾和血液中，铅可以对造血系统造成危害，引起贫血和溶血。长期摄入铅后，可引起慢性铅中毒肾病。铅中毒还可导致人类死胎和流产、致癌、致突变。镍进入人体后积存于脊髓、脑及五脏，其中以肺为主。镍能激活或抑制一系列的酶而引起口腔炎、牙银炎和急性胃肠炎，并对心肌和肝脏有损害。镉可在生物体内富集，通过食物链进入人体引起慢性中毒。镉的生物半衰期为10‑30年，即使停止接触，大部分既往蓄积的镉仍继续停留在人体内。肾脏是镉最重要的蓄积部位和靶器官，严重的可导致肾衰竭；对骨骼的影响则是骨软化和骨质疏松；对其他的身体组织也会造成严重损伤。
[0004] 铜、锌、钴、锰是动植物的一种必需元素，但是过量的铜也是会引起肝硬化、腹泻、运动障碍等问题。锌、钴、锰等重金属的过量摄入，同样会引起以上问题。
[0005] 水体中的重金属大多来自工业领域，包括采矿业、冶金业、选矿业、制革、油漆和电镀业等。由于某些原因未经处理的废水就排入湖泊、河流以及海洋中，造成水体重金属污染。水体中的重金属在其浓度很小时就会产生毒性，具有高度危害性和难治理性。重金属治理，主要有物理、化学和生物修复。而生物修复中常用的微生物修复法由于经济、生态效益等优点，在重金属污染治理中占有重要地位。
[0006] 微生物修复法是利用细菌、真菌等微生物对水体屮的重金厲进行吸附的过程，主要原理是利用水体中的微生物或者经驯化的高效微生物，在适合的条件，通过微生物的还原反应将重金属离子还原或吸附成团沉淀，降低水体屮重金含量。
发明内容
[0007] 本申请提供了一种重金属抗性菌，该重金属抗性菌为高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis，重金属抗性菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC 2+ 2+
No：62442；其中，重金属包括Mn 、Pb 中的至少一种。
No：62442；其中，重金属包括Mn 、Pb 中的至少一种。
[0008] 本申请还提供了上述重金属抗性菌在重金属污染水体或土壤治理中的应用，其2+ 2+
中，重金属包括Mn 、Pb 中的至少一种。
中，重金属包括Mn 、Pb 中的至少一种。
[0009] 本申请的重金属抗性菌有较好的重金属去除能力，能够用于重金属抗性菌污染土壤或水体治理，具有成本低、效率高和不会产生二次污染等优点。
附图说明
[0010] 图1示出了菌株MPEB0007711在MHA固体培养基上的生长状态。
[0011] 图2示出了菌株MPEB0007711在光学显微镜下形态特征。
[0012] 图3示出了菌株MPEB0007711在2500mg/L铅离子浓度下的生长状态。
[0013] 图4示出了菌株MPEB0007711在2000mg/L锰离子浓度下的生长状态。
[0014] 图5示出了菌株MPEB0007711在600mg/L锌离子浓度下的生长状态。
[0015] 图6示出了菌株MPEB0007711在200mg/L钴离子浓度下的生长状态。
[0016] 图7示出了菌株MPEB0007711在300mg/L镉离子浓度下的生长状态。
[0017] 图8示出了菌株MPEB0007711在600mg/L铜离子浓度下的生长状态。
[0018] 图9示出了菌株MPEB0007711在300mg/L镍离子浓度下的生长状态。
[0019] 图10示出了菌株MPEB000771116S rDNA序列系统发育树。
[0020] 本发明的重金属抗性菌MPEB0007711，分类学名称为高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis，于2022年5月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为：GDMCC No：62442；保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
具体实施方式
[0021] 下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0022] 本申请提供一种重金属抗性菌，菌株属于高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)。于2022年5月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为：GDMCC No：62442。其有益效果是，该菌株表现出比较强的重金属耐受性能，对铅和锰有较强的去除作用，可将该菌株用于重金属污染的水体和土壤的生物修复。
[0023] 本发明提供的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)分离自广西锰矿周边土壤中。土壤来自广西锰矿附近，这里的土壤含锰在60‑188g/kg，含钴是100‑200mg/kg。将1mg土壤样品加入到装有50ml MHB(牛肉粉2g/L，可溶性淀粉1.5g/L，酸水解酪蛋白17.5g/L，pH 7.4)的250ml锥形瓶中，将锥形瓶放置在35℃，150RPM摇床中培养24h后，取其中1ml加入锰浓度为200mg/L的溶液中培养48h，再转入锰浓度为400mg/L的培养基中继续培养48h。取最后溶液中的20ul培养液在含锰400mg/L的固体培养基上划线培养。挑选不同形态的单克隆分别接种到未加任何金属离子的MHA(牛肉粉6g/L，可溶性淀粉1.5g/L，酸水解酪蛋白
17.5g/L，琼脂17g/L，pH 7.3)中培养24h。直到培养出菌落特征一致的纯菌种。将分离得到的菌株进行多种重金属MIC(最小抑制浓度)测定。测定方法采用96孔板筛选。即用含锰、镍、铜、锌、钴、铅等重金属浓度为100‑2500mg/L的培养基在96孔板中对菌株进行重金属MIC检测，于35℃培养基中培养48h，重复3次。选择其中对这些重金属耐受性最高的菌株为目标菌株，并进行菌株鉴定。筛选得到重金属抗性菌MPEB0007711，为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)。
17.5g/L，琼脂17g/L，pH 7.3)中培养24h。直到培养出菌落特征一致的纯菌种。将分离得到的菌株进行多种重金属MIC(最小抑制浓度)测定。测定方法采用96孔板筛选。即用含锰、镍、铜、锌、钴、铅等重金属浓度为100‑2500mg/L的培养基在96孔板中对菌株进行重金属MIC检测，于35℃培养基中培养48h，重复3次。选择其中对这些重金属耐受性最高的菌株为目标菌株，并进行菌株鉴定。筛选得到重金属抗性菌MPEB0007711，为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)。
[0024] 高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)特征描述如下：
[0025] 形态：该菌株在MHA平板上，35℃，培养24h，其在MHA平板上的菌落形态呈现白色、不透明、边缘整齐、无光泽(图1)；在含铅离子的培养基中该菌落呈现为棕褐色。如图2所示，对该菌株进行革兰氏染色，通过显微镜观察(10*100)，该菌为革兰氏阳性菌，菌体为短杆状，两端钝圆。
[0026] 金属耐受性：将复壮16h的菌株在含重金属平板上进行划线培养。重金属平板分别为含钴0.2g/L，含锌0.6g/L，含锰2g/L，含铅2.5g/L，含镍0.3g/L，含铜0.6g/L，含镉0.3g/L。在培养24小时后，菌株MBEP0007711均能在这些平板上生长。
[0027] 图3示出了菌株MPEB0007711在2500mg/L铅离子浓度下的生长状态。图4示出了菌株MPEB0007711在2000mg/L锰离子浓度下的生长状态。图5示出了菌株MPEB0007711在600mg/L锌离子浓度下的生长状态。图6示出了菌株MPEB0007711在200mg/L钴离子浓度下的生长状态。图7示出了菌株MPEB0007711在300mg/L镉离子浓度下的生长状态。图8示出了菌株MPEB0007711在600mg/L铜离子浓度下的生长状态。图9示出了菌株MPEB0007711在300mg/L镍离子浓度下的生长状态。如图3至图9所示，通过平板实验可以认为，该菌株耐受这个浓度的重金属。该菌株对高浓度重金属的耐受为其去除重金属的应用提供基础。
[0028] 16s分析：从本申请的菌株纯培养物中提取基因组DNA，利用通用软件27F和1492r进行扩增和测序，进一步通过MEGA软件构建系统进化树(图10)。结果显示该菌为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)。
[0029] 重金属去除特性：
[0030] 在MHB培养基中按2％的接种量接入MBEP0007711的种子液，30℃，150RPM恒温摇床培养18h。8000r/min离心10min收集菌体，用超纯水洗涤菌体3次，将湿菌体作为生物吸附剂。
[0031] 在pH7.4和30℃温度下，将湿菌体投加到已知浓度的重金属溶液中，添加湿菌体的量为2.5g/L。150RPM恒温振荡一定时间后，取样，8000r/min离心10min，用SpectrAA220型原子吸收分光光度计测定上清中剩余重金属离子的浓度，计算去除率。
[0032] 菌株对重金属的去除效率R的计算方法：
[0033]
[0034] 其中，R为重金属的去除效率，C0为重金属的初始浓度(mg/L)，Ce为平衡时溶液中重金属的浓度(mg/L)。
[0035] 将本申请提供的高地芽孢杆菌接种到各个浓度的含重金属的MHB溶液中，48h的去除率见表1所示：
[0036] 表1
[0037]
[0038] 因此，本申请的菌株MBEP0007711对Mn2+、Cu2+、Pb2+、Zn2+都表现较强的耐受能力。对2+ 2+
Mn 、Pb 均表现出较强的去除能力，可以用于这些重金属污染的水体或土壤的修复。
Mn 、Pb 均表现出较强的去除能力，可以用于这些重金属污染的水体或土壤的修复。
[0039] 本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。