一种强化型M-MLV逆转录酶突变体及其应用

摘要

本发明公开了一种强化型M‑MLV逆转录酶突变体及其应用，属于生物技术领域。所述M‑MLV逆转录酶突变体是在野生型莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶基础上经人工改造而成，氨基酸序列如Seq ID No.2所示。强化型M‑MLV逆转录酶具备高扩增效率、强抗抑制能力和热稳定性，耐热能力可达到70℃，反应灵敏度高、反应时间快，能够排除RNA样品中所混有的高浓度乙醇或异丙醇的干扰，实现RNA的逆转录。所述增强型逆转录酶突变体可应用于微量病毒RNA逆转录和检测，普通及长链cDNA的快速合成，多种转录组建库等领域，具有广泛的应用前景和市场价值。

权利要求

1. 一种强化型M‑MLV逆转录酶，其特征在于，所述强化型M‑MLV逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.编码权利要求1所述的强化型M‑MLV逆转录酶的多核苷酸。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2中所述的多核苷酸。

4.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物表达权利要求1所述的强化型M‑MLV逆转录酶、或包含权利要求3所述的重组表达载体。

5.一种逆转录试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的强化型逆转录酶。

6.一种合成cDNA的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1所述强化型M‑MLV逆转录酶或权利要求5所述逆转录试剂盒将RNA逆转录生成cDNA；所述方法在37℃ 70℃下反~‑5

应不少于1 min，再在80 90℃下变性10 20s；反应体系中RNA的浓度为5×10 mg/L 50mg/L。

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7.权利要求1所述的逆转录酶，权利要求4所述的重组微生物或权利要求5所述的逆转录试剂盒在RNA逆转录及定量检测中的应用。

说明书

一种强化型M‑MLV逆转录酶突变体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种强化型M‑MLV逆转录酶突变体及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] RT‑PCR技术所使用的模板为单链cDNA或双链DNA，而当检测模板为RNA时，需要用逆转录酶先将RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。莫洛泥鼠白血病病毒(Moloney Murine LeukemiaVirus,M‑MLV)逆转录酶是一种以RNA为模板常用的DNA聚合酶，具有RNase H活性，不具有3'‑5'外切酶活性，可用于逆转录合成cDNA，但MMLV逆转录酶目前仍存在产量较低，热稳定性差，耐受抑制物能力低，合成速度和灵敏度有待提高等问题，限制了其在微量RNA病毒检测等领域应用。提高核酸诊断方法的效率和准确性是当下研究的重点，所以通过改造逆转录酶来满足高灵敏度、高特异性、低成本、易操作、时间短的需求显得尤为重要。

发明内容

[0003] 基于上述现有的技术问题，本发明的目的是提供一种强化型M‑MLV逆转录酶，是在野生型M‑MLV逆转录酶的基础上进行人工改造，得到强抗逆能力、更高的热稳定性以及更快速催化活性的强化型逆转录酶。

[0004] 本发明的第一个目的是提供一种强化型M‑MLV逆转录酶，所述强化型M‑MLV逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0005] 本发明的第二个目的是提供编码所述的强化型M‑MLV逆转录酶的核苷酸序列。

[0006] 在一种实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0007] 本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体，所述载体包含所述的编码所述的强化型M‑MLV逆转录酶的核苷酸序列。

[0008] 在一种实施方式中，所述重组表达载体的出发载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K、pPIC9K系列载体，或pPSUMO。

[0009] 优选的，所述出发载体为pPSUMO或pET‑30a(+)。

[0010] 本发明的第四个目的是提供一种重组微生物，所述重组微生物表达所述的强化型M‑MLV逆转录酶、或包含所述的重组表达载体。

[0011] 在一种实施方式中，所述重组微生物以大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等为菌株为宿主细胞。

[0012] 本发明的第五个目的是提供一种逆转录试剂盒，所述试剂盒含有氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的强化型逆转录酶。

[0013] 在一种实施方式中，所述制剂和还包括RNase H2O、逆转录反应缓冲液、dNTPs和逆转录反应引物。

[0014] 在一种实施方式中，所述逆转录反应缓冲液为5×RT缓冲液；所述dNTPs浓度为10mM；所述RNA酶抑制剂浓度为40U/μL。

[0015] 在一种实施方式中，所述试剂盒中还含有RNA酶抑制剂。

[0016] 本发明的第五个目的是提供一种合成cDNA的方法，所述方法是利用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的强化型M‑MLV逆转录酶或所述逆转录试剂盒将RNA逆转录生成cDNA。

[0017] 在一种实施方式中，在37℃～70℃下反应不少于1min，再在80～90℃下变性10～20s。

[0018] 在一种实施方式中，所述反应时间优选为5～30min。

[0019] 在一种实施方式中，反应体系中RNA的浓度为5×10‑5mg/L～50mg/L，即20μL体系中添加1pg～1μg的RNA。

[0020] 本发明的第六个目的是提供所述的强化型M‑MLV逆转录酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

[0021] (1)取所述的重组微生物，接种于LB培养基中，扩大培养，培养至菌液OD600达到0.4‑0.6；

[0022] (2)向菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1～0.25mmol/L，诱导细胞表达蛋白，高速离心收集菌体沉淀，所得菌体沉淀中包含所述的强化型M‑MLV逆转录酶；

[0023] (3)在所得菌体沉淀中加入裂解缓冲液，超声震荡破碎处理，离心去除沉淀，过滤，得到上清液；

[0024] (4)上清液先通过镍离子亲和层析收集含有目的蛋白的样品洗脱液，再经离子交换层析和SUMO蛋白酶切，即得到所述的强化型M‑MLV逆转录酶。

[0025] 本发明的第七个目的是提供所述强化型M‑MLV逆转录酶或所述核苷酸序列或所述重组微生物细胞，或所述试剂盒在RNA逆转录及定量检测中的应用。

[0026] 本发明的有益效果在于：

[0027] (1)本发明优化了强化型MMLV逆转录酶的表达载体，选择pPSUMO载体提高了目的蛋白的可溶性表达，极大的方便了后续蛋白纯化，从而提升蛋白产量和得率。

[0028] (2)本发明的强化型MMLV逆转录酶突变体具有更强的逆转录活性，快速持续合成能力，对比野生型，同等条件下合成cDNA的产量更高，需要时间更短，可以在5min甚至更短的时间内完成cDNA合成，可应用于微量RNA病毒检测和体外分子诊断中，在降低对进口产品依赖的方面能发挥重要作用。

[0029] (3)本发明提供的强化型M‑MLV逆转录酶，能够耐受70℃的高温，有较好热稳定性同时具有高反应灵敏度和准确性，有极强的应用前景和市场推广价值。

[0030] (4)本发明在野生型M‑MLV逆转录酶的基础上进行人工改造，得到强化型M‑MLV逆转录酶。该逆转录酶具有强抗逆能力，能很好的抵抗抑制物对cDNA合成的干扰，在添加乙醇或者异丙醇的样本反应过程中，本发明所述的突变型逆转录酶活性不受影响，cDNA能正常合成，适用于多种复杂环境下的RNA逆转录。

[0031] (5)本发明提供一种试剂盒方法，尤其可适用于RT‑PCR检测。逆转录和后续荧光定量PCR反应整个反应过程一步操作，不用多次打开管盖，添加试剂，避免了有可能发生的污染，提高了检测灵敏度和节省时间，并且降低了成本，更好的满足多领域的研究应用。

附图说明

[0032] 图1为本发明实施例1中比较应用pET‑30a(+)和pPSUMO两种表达载体的诱导蛋白表达效果图。

[0033] 图2为本发明实施例1中对比野生型和强化型M‑MLV逆转录酶合成cDNA浓度结果图。

[0034] 图3为本发明实施例2中比较在不同合成时间下野生型和强化型M‑MLV逆转录效果图。

[0035] 图4为本发明实施例2中比较在不同温度下野生型和强化型M‑MLV逆转录效果图。

[0036] 图5为本发明实施例2中比较在短时间不同温度下野生型和强化型M‑MLV逆转录效果图。

[0037] 图6为本发明实施例3中比较在不同乙醇添加比例下野生型和强化型M‑MLV逆转录效果图。

[0038] 图7为本发明实施例3中比较在不同异丙醇添加比例下野生型和强化型M‑MLV逆转录效果图。

[0039] 图8为本发明实施例4中比较在不同RNA起始添加量条件下野生型和强化型M‑MLV逆转录效果图。

[0040] 图9为本发明实施例5中应用野生型和强化型M‑MLV逆转录qPCR检测两种基因表达的扩增曲线图。

具体实施方式

[0041] 下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。

[0042] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0043] 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

[0044] 实施例1：M‑MLV逆转录突变体的制备

[0045] 包括如下步骤：

[0046] 1.强化型M‑MLV逆转录酶构建

[0047] 在野生型M‑MLV逆转录酶蛋白序列的基础上进行人工改造(改造后的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示)，并根据大肠杆菌的密码子优化核苷酸序列(序列如SEQ ID NO.1所示)，分别通过NdeI/XhoI和BamHI/EcoRI酶切位点插入pET‑30a(+)和pPSUMO两种表达载体中。将上述质粒与大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热激90秒，分别标记M‑MLV；pET‑30a(+)和M‑MLV；pPSUMO，并通过含有卡那霉素的LB平板，筛选单克隆菌株。

[0048] 2.蛋白诱导表达及纯化

[0049] 将平板上的单克隆接种到10ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养活化至OD600值为0.4‑0.6，加入终浓度为0.1‑0.25mM的诱导剂IPTG，在16℃、70rpm下继续培养，诱导蛋白表达。12小时后离心收集菌体沉淀，低温超声破碎，获得两种不同表达载体的M‑MLV逆转录酶粗提液。粗体液通过SDS‑PAGE分离，并且进行考马斯亮蓝R‑250染色鉴定蛋白条带，结果如图1所示，M‑MLV；pET‑30a(+)和M‑MLV；pPSUMO两种表达载体经过相同条件均可成功诱导出目的蛋白，其中M‑MLV；pPSUMO表达载体诱导后上清和沉淀中目的蛋白含量都要比M‑MLV；pET‑30a(+)高，pPSUMO载体的使用促进了蛋白的可溶性表达，更多的蛋白在上清液中检测到，提高产量的同时也方便后续的蛋白纯化。

[0050] 3.蛋白纯化

[0051] 沉淀菌体用细胞超声破碎仪充分破碎后通过镍柱亲和纯化、离子交换层析后加入SUMO蛋白酶进行酶切，最终透析浓缩获得纯化后蛋白，蛋白经过透析后储存于酶储存溶液(由20mM Tris‑HCl(pH 7.5)，100mM NaCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.01％(v/v)NP‑40和50％(v/v)glycerol组成)中，‑80℃保存待用于后续实验。

[0052] 4.逆转录活性检测

[0053] 以1μg小鼠肝脏总RNA为模板，用野生型和纯化后的强化型M‑MLV逆转录酶进行逆转录反应。反应体系如下：

[0054] 表1

[0055]

[0056] 5×RT缓冲液由250mM Tris‑HCl(pH 8.3)，375mM KCl，15mM MgCl2，50mM DTT组成。

[0057] 反应程序：37℃20min，85℃15sec。反应结束后，用Nano drop仪器测定和比较分别用野生型和强化型M‑MLV逆转录酶合成的cDNA浓度，结果如图2所示，在RNA模板添加量相同情况下，强化型M‑MLV逆转录酶合成的cDNA浓度显著高于野生型，说明改造后的逆转录酶提高了持续合成cDNA的能力和对于RNA模板的利用率。

[0058] 实施例2：强化型M‑MLV逆转录酶逆转录能力测试

[0059] 对逆转录的时间和温度进行改变，以测试逆转录酶在不同条件下的逆转录能力。

[0060] 以1μg小鼠肝脏总RNA为模板，逆转录体系如实施例1所示，采用本发明所述强化型M‑MLV逆转录酶和野生型逆转录酶在相同逆转录条件37℃、20min下，改变逆转录时间(1min、5min、15min、20min和30min)进行PCR反应，PCR扩增片段长度为154bp，PCR扩增基因为成纤维细胞生长因子21(FGF21)，所用引物为：FGF21‑F：5’‑CTGCTGGGGGTCTACCAAG‑3’和FGF21‑F：5’‑CTGCGCCTACCACTGTTCC‑3’，PCR所用试剂为2×Taq Plus Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号P212‑01)，反应体系和程序参照说明书进行配制和进行反应，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，实验结果如图3所示，相比于野生型，本发明所述的强化型M‑MLV逆转录酶在短时间内1min和5min，就表现出明显的逆转录活性，PCR产物条带强度高，表明经改造后，加强了逆转录酶的反应速度，更好的适用于用RT‑PCR方法进行快速检测。随后只改变温度条件(37℃、42℃、50℃、55℃、65℃和70℃)，逆转录反应时间均为20min，结果如图4所示，本发明所述的强化型M‑MLV逆转录酶温度适用范围明显高于野生型，在65℃和70℃高温状态下，仍可以正常进行逆转录反应，而野生型随着温度的升高逆转录合成cDNA能力明显下降，在此温度下，RNA样本的二级结构被完全打开，提高了引物与样本的结合能力，降低了非特异性结合，最终极大的提升cDNA合成效率与质量，对比结果说明改造后的逆转录酶热活力及热稳定性相对野生型有显著提高，适用于需要对复杂结构的RNA模板进行的逆转录反应，能高效同时高质量的合成cDNA。同时本发明也比较了强化型M‑MLV逆转录酶和野生型在不同温度(37℃、42℃、50℃、65℃和70℃)，短时间(5min)条件下进行逆转录反应，结果如图5所示，与野生型逆转录酶相比，强化型M‑MLV逆转录酶在高温条件下(65℃和70℃)，短时间5min仍可以快速进行逆转录反应，而且反应产物量明显高于野生型逆转录酶。

[0061] 实施例3：强化型M‑MLV逆转录酶突变体的抑制物耐受性验证

[0062] 在某些情况下的RNA模板中可能存在一些抑制物会降低逆转录反应的实际效果，为检测强化型M‑MLV逆转录酶对于抑制物的耐受性，向上述两组反应体系中分别添加5％～25％(v/v)的乙醇或者异丙醇，并在37℃、20min条件下进行逆转录反应，利用PCR反应并将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳的方法检测实验结果，结果如图6和图7所示，实验结果显示，本发明所述的强化型M‑MLV逆转录酶较野生型具有更强的抗逆能力，在乙醇和异丙醇存在的情况下，本发明所述的强化型M‑MLV逆转录酶的生物活性仍不受影响，能耐受抑制组分对cDNA合成的干扰，同时提高了得率和完整性，可适用于多种复杂和极端环境下的RNA逆转录反应。

[0063] 实施例4：强化型M‑MLV逆转录酶突变体的反应灵敏度验证

[0064] 为检测强化型M‑MLV逆转录酶突变体对于低RNA浓度样本的灵敏度，将1μg RNA模板进行梯度稀释，分别稀释为100ng、10ng、1ng、1pg，反应体系如上所述在37℃条件下进行逆转录反应，利用PCR反应并将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳的方法检测实验结果，结果如图8所示，本发明所述的强化型M‑MLV逆转录酶较野生型相比，对于极低浓度RNA样本(1ng和1pg)，仍有很强的灵敏度，拓宽了该逆转录酶在不同实验场景的应用，尤其是在需要极强灵敏度的体外分子诊断中。

[0065] 实施例5：强化型M‑MLV逆转录酶应用于RT‑PCR检测

[0066] 逆转录方法同实施例1所示，RT‑PCR所用试剂为 qPCR SYBR Green Master Mix(上海翌圣生物科技有限公司，货号11201ES03)，反应体系如下：

[0067] 表2

[0068]

[0069]

[0070] 应用CFX96 Bio‑Rad荧光定量PCR仪上进行目的基因检测，

[0071] FGF21 F:5’‑CTGCTGGGGGTCTACCAAG‑3’，

[0072] FGF21 R:5'‑CTGCGCCTACCACTGTTCC‑3’；

[0073] β‑actin F:5’‑GGCTGTATTCCCCTCCATCG‑3’，

[0074] β‑actin R:5'‑CCAGTTGGTAACAATGCCATGT‑3’。

[0075] 两步法反应条件如下，95℃5min，95℃10sec，60℃30sec，40个循环。检测结果(Ct值)如下表所示：

[0076] 表3

[0077]

[0078] 由表中Ct值结果与扩增曲线如图9可以得出，相同基因强化型的Ct值均比野生型要低，说明改造后的强化型逆转录酶应用于RT‑PCR反应，提高了检测的灵敏度，能更快速的完成整个检测反应，节省时间成本。

[0079] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。