PTGES表达抑制剂在制备提升肿瘤细胞对化疗药物的敏感性的药物中的应用转让专利
申请号 : CN202210760058.0
文献号 : CN115025226B
文献日 : 2023-05-23
发明人 : 马琼 , 孙瑾 , 王欢 , 李晨宇 , 吴永虹
申请人 : 中国人民解放军空军军医大学
摘要 :
本发明公开了一种PTGES表达抑制剂在制备提升肿瘤细胞对化疗药物的敏感性的药物中的应用。本发明发现通过敲除或抑制PTGES的表达，能够减弱骨肉瘤对于化疗药物，特别是洛铂的耐药性，提示合成PTGES的抑制剂或敲除试剂与洛铂联合应用，在治疗骨肉瘤时能够克服骨肉瘤对化疗药物的耐药性，其在临床应用具有重要指导意义并有广阔前景。
权利要求 :
1.PTGES表达抑制剂在制备提升骨肉瘤细胞对洛铂敏感性的药物中的应用，所述PTGES表达抑制剂为shRNA或siRNA。
说明书 :
PTGES表达抑制剂在制备提升肿瘤细胞对化疗药物的敏感性
的药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种PTGES表达抑制剂在制备提升肿瘤细胞对化疗药物的敏感性的药物中的应用。
背景技术
[0002] 骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤，好发于青少年，预后不良。目前骨肉瘤的治疗方法是积极的手术切除与新辅助化疗相结合。铂类化疗药物是骨肉瘤临床常用的药物，包括顺铂、奥沙利铂和洛铂。洛铂是第三代铂类抗肿瘤药物之一，副作用少，抗肿瘤活性好。然而，经过几个疗程的治疗后，复发和转移仍然是患者面临的难题。大多数死于骨肉瘤的患者表现出明显的化学耐药性。
[0003] 脂质代谢在许多细胞活动的信号转导中起着关键作用，并作为癌细胞行为中新出现的关键效应而备受关注。癌细胞利用脂质代谢获得能量和信号分子，从而增殖、转移并对各种治疗作出反应。此外，在临床前动物模型中，阻断癌症相关脂肪细胞脂解和游离脂肪酸摄取对肿瘤抑制具有有益作用。关于化疗耐药性，越来越多的证据表明，肿瘤的缺氧环境可触发脂质代谢并产生高水平的 ATP，这是化疗耐药性的关键因素。然而，骨肉瘤中与脂质代谢相关的个性化治疗指南仍有待探索。
[0004] PTGES是花生四烯酸代谢途径中合成PGE2的关键酶，可催化PGH2转化为PGE2，在炎症组织和肿瘤中的表达显著上调，已被证明对非小细胞肺癌细胞的致瘤性、迁移和转移至关重要。在Gprc5a基因敲除小鼠模型中，PTGES与免疫抑制和肺肿瘤发生相关。目前认为，PTGES/PGE2信号对细胞干性至关重要，包括ABCG2和EMT相关标记的表达，并可诱导巨噬细胞和MDSC中PD‑L1 的表达，抑制肿瘤免疫。然而，PTGES在肿瘤化疗耐药中的作用尚不清楚。因此，探索PTGES在骨肉瘤铂类药物化疗中的作用并开发针对骨肉瘤化疗增敏的药物对骨肉瘤患者的治疗意义重大。
发明内容
[0005] 针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种PTGES表达抑制剂在制备提升肿瘤细胞对化疗药物的敏感性的药物中的应用，通过抑制或敲除PTGES基因，可提高骨肉瘤患者对洛铂的响应率，降低耐药性的产生。
[0006] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007] 以PTGES作为靶点在制备提升肿瘤细胞对化疗药物的敏感性的药物中的应用。
[0008] 此外，还提供了PTGES表达抑制剂在制备提升肿瘤细胞对化疗药物的敏感性的药物中的应用。
[0009] 进一步地，该药物通过抑制PTGES的表达来改善肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
[0010] 进一步地，肿瘤包括骨肉瘤。
[0011] 进一步地，化疗药物为铂类化疗药物。
[0012] 进一步地，化疗药物为洛铂。
[0013] 进一步地，PTGES表达抑制剂包括shRNA、siRNA、小分子化合物或单抗。
[0014] 一种联合化疗药物，包括PTGES表达抑制剂以及铂类化疗药物。
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 本发明发现通过敲除或抑制PTGES的表达，能够减弱骨肉瘤对于化疗药物，特别是洛铂的耐药性，提示合成PTGES的抑制剂或敲除试剂与洛铂联合应用，在治疗骨肉瘤时能够克服骨肉瘤对化疗药物的耐药性，其在临床应用具有重要指导意义并有广阔前景。
附图说明
[0017] 图1为IHC染色检测PTGES在洛铂敏感和耐药骨肉瘤组织中的表达；比例尺：100μm(放大倍数，200倍)，比例尺：50μm(放大倍数，400倍)；小提琴图显示差异具有显著性。
[0018] 图2为慢病毒敲减PTGES后骨肉瘤细胞中PTGES mRNA和蛋白的表达水平；***P＜0.001；
[0019] 图3为转染shPTGES的骨肉瘤细胞经洛铂处理后，活化的半胱氨酸蛋白酶 9、半胱氨酸蛋白酶3和PARP的表达水平；*P＜0.05，**P＜0.01；
[0020] 图4为流式细胞术检测洛铂处理48小时不同处理组骨肉瘤细胞的凋亡率； *P＜0.05，***P＜0.001；
[0021] 图5为TUNEL染色检测敲减PTGES的骨肉瘤细胞经洛铂处理后的凋亡情况；比例尺：100μm；
[0022] 图6为克隆形成试验检测转染shPTGES和洛铂处理的骨肉瘤细胞的增殖能力；***P＜0.001；
[0023] 图7为CCK8实验检测转染shPTGES后经洛铂处理的骨肉瘤细胞的活力。
具体实施方式
[0024] 下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
[0025] 实施例1 PTGES与骨肉瘤的耐药性
[0026] 对唐都医院骨科2019年至2022年骨肉瘤后进行手术的患者肿瘤样本进行免疫组织化学染色，具体过程如下：
[0027] 肿瘤组织在室温下用10％福尔马林溶液固定过夜，梯度乙醇(70％、80％、 95％和100％)脱水，石蜡包埋后将组织切成2‑3μm的切片。石蜡切片60℃恒温过夜，脱蜡至水：二甲苯2×15min，100％乙醇2×5min，95％乙醇2×5min， 70％乙醇2×5min，ddH2O 2×5min。微波法抗原修复，静置冷却至室温；将切片完全浸没于3％的过氧化氢溶液中，室温孵育
15min；PBS洗涤切片，2×5 min；甩干切片，向组织上滴加足量封闭液(含5％山羊血清的PBS)，轻轻摇晃使其完全覆盖组织，并置于湿盒中室温孵育15min；向组织上滴加50μL稀释好的PTGES一抗抗体(Cayman，1:50)，使其完全覆盖组织，并置于湿盒中 4℃孵育过夜；PBS洗涤切片，3×5min；向组织滴加50μL兔鼠通用即用型二抗，湿盒中37℃孵育1h；PBS洗涤切片，3×5min；向组织滴加50μL新鲜配置的DAB显色底物液，室温孵育5‑10min；当显色信噪比达到最佳时，将切片拿至水龙头下用流水缓缓冲洗1min；苏木素衬染，盐酸酒精分化，脱水并封片，通风橱内干燥后镜检。
15min；PBS洗涤切片，2×5 min；甩干切片，向组织上滴加足量封闭液(含5％山羊血清的PBS)，轻轻摇晃使其完全覆盖组织，并置于湿盒中室温孵育15min；向组织上滴加50μL稀释好的PTGES一抗抗体(Cayman，1:50)，使其完全覆盖组织，并置于湿盒中 4℃孵育过夜；PBS洗涤切片，3×5min；向组织滴加50μL兔鼠通用即用型二抗，湿盒中37℃孵育1h；PBS洗涤切片，3×5min；向组织滴加50μL新鲜配置的DAB显色底物液，室温孵育5‑10min；当显色信噪比达到最佳时，将切片拿至水龙头下用流水缓缓冲洗1min；苏木素衬染，盐酸酒精分化，脱水并封片，通风橱内干燥后镜检。
[0028] 染色结果在正置显微镜(Olympus BX51)下独立评估，每例标本选取5个互补视野，根据每个视野中阳性细胞区域面积及阳性细胞染色强度进行评分。评分标准：a.阳性面积评分：阳性细胞数≤5％，计0分；6％‑20％，计1分；21％‑50％，计2分；51％‑70％，计3分；≥71％计4分；b.染色强度评分：黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分。综合评分＝阳性面积评分×染色强度评分。
[0029] 图1中左侧为免疫组织化学检测结果，分别为洛铂治疗敏感组和洛铂治疗耐药组骨肉瘤标本中PTGES的表达，上面为200倍放大倍数下的图片，下面为 400倍放大倍数下的图片；右侧为统计结果，小提琴图显示差异具有显著性。
[0030] 如图1所示，在洛铂治疗患者耐受的样本中，PTGES的表达较治疗敏感的样本中增强，差异具有显著性。
[0031] 实施例2构建敲减PTGES的骨肉瘤细胞系
[0032] 1、人骨肉瘤细胞的培养
[0033] 人骨肉瘤细胞系MG63、SOSP‑9607分别用含10％胎牛血清的改良的Eagle 培养基与RPMI‑1640培养基培养，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
[0034] 2、慢病毒感染
[0035] 敲减PTGES的shPTGES慢病毒颗粒和随机对照慢病毒颗粒由上海吉凯基因有限公5
司提供。将1×10骨肉瘤细胞接种于6孔培养板中，按照MOI(感染复数)＝100的比例对细胞进行感染，每孔加病毒量(μL)＝MOI×细胞数/滴度×1000。随后在4μg/mL嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific)存在下筛选感染细胞5天，并将其维持在含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基中，以获得稳定的PTGES敲减的骨肉瘤细胞系。
司提供。将1×10骨肉瘤细胞接种于6孔培养板中，按照MOI(感染复数)＝100的比例对细胞进行感染，每孔加病毒量(μL)＝MOI×细胞数/滴度×1000。随后在4μg/mL嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific)存在下筛选感染细胞5天，并将其维持在含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基中，以获得稳定的PTGES敲减的骨肉瘤细胞系。
[0036] 将1×105骨肉瘤细胞接种于6孔培养板中，以50％的MOI与慢病毒颗粒的 50％汇合度感染。随后在4μg/mL嘌呤霉素存在下选择感染细胞14天，并将其维持在含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基中，以构建稳定的感染细胞，即PTGES 敲减的骨肉瘤细胞系。
[0037] 3、实时荧光定量PCR分析
[0038] 使用GeneJET RNA纯化试剂盒(Thermo Scientific)提取细胞总RNA， Nanodrop分光光度计、琼脂糖凝胶电泳评估RNA的纯度、浓度和完整性。使用反转录试剂盒(YEASEN)以1μg总RNA为模板合成cDNA。使用Rotor‑Gene Q 系统(QIAGEN)进行定量实时PCR。将cDNA样品稀释10倍，使用Hieff UNICON Universal Blue Qpcr SYBR Green Master Mix(YEASEN)进行实时PCR反应。扩增条件是：95℃，2分钟；95℃，10秒，共35次循环，然后60℃，30秒。GAPDH 作为看家基因以标准化所有样品。采用2‑ΔΔCt方法计算PTGES mRNA的相对表达量。PTGES的引物序列的详细信息如下所示。
[0039] PTGES上游引物：5’‑CCCAAGGTTTGAGTCCCTCC‑3’；
[0040] PTGES下游引物：5’‑CCCATCAAGGGGACATTTGC‑3’；
[0041] GAPDH上游引物：5’‑CTCCTCCACCTTTGACGCTG‑3’，
[0042] GAPDH下游引物：5’‑TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG‑3’。
[0043] 4、蛋白印迹分析
[0044] 用含1％蛋白酶抑制剂的蛋白裂解缓冲液收集细胞裂解物，采用BCA法对蛋白进行定量。将20μg总蛋白置于10％SDS‑PAGE凝胶中，80V电泳至分离胶后120V电泳至溴酚蓝跑出凝胶，结束电泳。小心剥下凝胶，适当标记后，从负极到正极，按照海绵、滤纸、凝胶、0.22μm PVDF膜、滤纸和海绵的顺序，制备转膜体系。100V恒压条件下，转膜1.5h，全程冰浴。转膜结束后，将PVDF 膜标记方向和正反，剪开目的条带和内参所在部位，5％脱脂奶粉(TBST稀释) 37℃封闭1h；PTGES一抗(Cayman，1:200)4℃孵育过夜。次晨脱色摇床上TBST洗膜10min×2次，TBS洗膜10min后，加入HRP标记的二抗，室温结合1h；TBST洗膜10min×2次后，将膜条浸泡在TBS溶液中。滴加发光工作液在PVDF膜上，保鲜膜覆盖，BIO‑RAD化学发光仪发光显影，用 Image‑Pro‑Plus软件对各波段的信号强度进行量化，以各条带与β‑actin灰度的比值计算蛋白质的表达丰度。
[0045] 图2为慢病毒敲减PTGES后，骨肉瘤细胞中PTGES mRNA和蛋白的水平，其中，A为实时定量PCR检测PTGES mRNA的表达；B图为蛋白印迹检测PTGES 蛋白的表达。
[0046] 根据图2可以看出，PTGES在骨肉瘤细胞中的表达显著减少，表明在骨肉瘤细胞中成功敲减了PTGES。
[0047] 实施例3骨肉瘤敲减PTGES后对洛铂敏感性的提升
[0048] 1、流式细胞检测
[0049] 将3×105用慢病毒感染的稳定敲减PTGES的骨肉瘤细胞接种于6孔板中， 24小时后用20μg/mL洛铂处理细胞。培养24小时后收集细胞，PBS洗涤，完全培养基重悬。使用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(RUO)、PE Annexin V 凋亡检测试剂盒(RUO)和Coulter EPICS XL流式细胞仪(Beckman)评估细胞凋亡。每个样本至少检测三次，并使用EXP032 ADC分析软件获取凋亡数据。
[0050] 图3中上面两幅为两株细胞的蛋白印迹图片，下面两幅为通过Image J将蛋白印迹的灰度值进行统计学分析后的柱状图。
[0051] 如图3所示，两株骨肉瘤细胞稳定敲减PTGES后，经20μg/mL洛铂处理 24小时后，细胞中活化的半胱氨酸蛋白酶9(Cleaved‑Caspase 9)、活化的半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved‑Caspase 3)和活化的PARP(Cleaved‑PARP)的蛋白水平显著降低。
[0052] 如图4所示，通过流式细胞检测发现，经20μg/mL洛铂处理的PTGES敲减的骨肉瘤细胞中，凋亡细胞的比例显著增加，即对洛铂的敏感性增加。
[0053] 2、TUNEL染色
[0054] 使用凋亡检测试剂盒(Roche,Germany)进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP4
缺口末端标记(Tunel)分析。将慢病毒稳定感染的骨肉瘤细胞按照2×10个细胞/孔铺于24孔板内无菌盖玻片上，24小时后1×PBS洗5分钟，4％多聚甲醛固定细胞15min，PBS洗5分钟×3次，含0.1％Triton X‑100破膜10分钟， PBS洗5分钟×3次，将50μL TUNEL加入到450μL反应缓冲液中，混匀加入24孔板每个孔中；37℃避光孵育60分钟,PBS洗5分钟×3次；含DAPI封片剂封片、避光晾干。荧光显微镜下观察并计数Tunel阳性细胞。Tunel阳性细胞的百分比由三个孔中的五个随机视野计算获得。
缺口末端标记(Tunel)分析。将慢病毒稳定感染的骨肉瘤细胞按照2×10个细胞/孔铺于24孔板内无菌盖玻片上，24小时后1×PBS洗5分钟，4％多聚甲醛固定细胞15min，PBS洗5分钟×3次，含0.1％Triton X‑100破膜10分钟， PBS洗5分钟×3次，将50μL TUNEL加入到450μL反应缓冲液中，混匀加入24孔板每个孔中；37℃避光孵育60分钟,PBS洗5分钟×3次；含DAPI封片剂封片、避光晾干。荧光显微镜下观察并计数Tunel阳性细胞。Tunel阳性细胞的百分比由三个孔中的五个随机视野计算获得。
[0055] 图5为两株骨肉瘤细胞株染色结果。如图5所示，在荧光显微镜下观测，经慢病毒转染的肿瘤细胞中，凋亡现象显著增加。
[0056] 3、克隆形成试验
[0057] 将600个慢病毒感染的稳定敲减PTGES的骨肉瘤细胞及感染对照载体的骨肉瘤细胞接种在35mm培养皿中。培养10‑14天后，用4％多聚甲醛固定20分钟，吉姆萨染液染色20分钟。流水缓慢洗去染色液，空气中干燥，倒置显微镜下拍照和计数大于10个细胞的克隆数。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数) ×100％。
[0058] 图6为克隆形成实验检测结果，左侧图为两株骨肉瘤细胞不同处理组的克隆形成图片，右侧为经xx统计分析的不同处理组的克隆形成率。如图6所示，克隆形成试验表明，敲减PTGES的骨肉瘤细胞株MG63和SOSP‑9607在洛铂 (20μg/mL)处理后，细胞的克隆效率急剧下降(P<0.05)。
[0059] 4、CCK8检测细胞对洛铂的敏感性
[0060] 将每个孔共6000个慢病毒感染的稳定敲减PTGES的骨肉瘤细胞接种在96 孔板中，24小时后用不同浓度(0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL) 的洛铂处理24小时，添加10μL CCK8试剂，细胞继续培养2小时。全波长多功能酶标仪(Tecan，Switzerland)测量细胞在450nm处的吸光度。每个实验组包含三个生物学重复，以半数抑制浓度确定细胞对洛铂的耐药程度。
[0061] 图7为CCK8实验检测PTGES稳定敲减的骨肉瘤细胞经不同浓度洛铂处理后的细胞活力，左图为骨肉瘤MG63细胞株的实验结果，右图为骨肉瘤SOSP‑9607细胞株的实验结果。如图7所示，在PTGES敲减的两株骨肉瘤细胞中，洛铂的IC50值显著降低，表明PTGES的敲减在增强了骨肉瘤细胞对洛铂的敏感性。
[0062] 因此，通过敲除或抑制PTGES的表达，能够减弱骨肉瘤对于化疗药物，特别是洛铂的耐药性，提示合成PTGES的抑制剂或敲除试剂与洛铂联合应用，在治疗骨肉瘤时能够克服骨肉瘤对化疗药物的耐药性，其在临床应用具有重要指导意义并有广阔前景。